專利名稱：豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬α干擾素成熟蛋白(mIFNa )重組腺病毒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬α干擾素具有廣譜、高效抗病毒、抗腫瘤的作用，其對(duì)免疫系統(tǒng)起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，豬α干擾素對(duì)入侵病毒的非特異性抑制功能，對(duì)許多重大傳染病致病病毒具有有效地防御功能?；蚬こ讨苽涞呢iα干擾素與血源性干擾素相比，具有無污染、安全性高、純度高、比活性高、成本低、療效確切等優(yōu)點(diǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101845441A (申請(qǐng)?zhí)?01010125057. 6)公開了一種復(fù)合豬α干擾素基因及其重組載體，屬于基因工程生物制品技術(shù)領(lǐng)域。將新設(shè)計(jì)的復(fù)合豬α干擾素的·基因序列重組到PPICZ a -A載體，電轉(zhuǎn)化入酵母菌感受態(tài)細(xì)胞，陽性鑒定、高拷貝酵母菌株的篩選、誘導(dǎo)表達(dá)。該系統(tǒng)表達(dá)的復(fù)合豬α干擾素效價(jià)較低，應(yīng)用豬體后，降解較快，不利于臨床應(yīng)用。重組腺病毒rAdnIFN α在分類上屬于腺病毒科(Adenoviridae),哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus),人腺病毒種(Human adenovirus),該重組腺病毒可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行有效地表達(dá)，用該重組腺病毒感染動(dòng)物后不出現(xiàn)臨床癥狀，因此可以用來表達(dá)抗原蛋白。重組腺病毒基因工程技術(shù)在人類的基因治療方面已經(jīng)取得了廣泛地應(yīng)用，很多應(yīng)用于人類基因治療的重組腺病毒已經(jīng)進(jìn)入臨床三期階段。因?yàn)橹亟M腺病毒具有感染宿主范圍廣，能夠感染分裂和不分裂的細(xì)胞；可以表達(dá)人源和非人源蛋白；而且不會(huì)整合到宿主基因組中，不會(huì)引起基因插入突變，可以復(fù)制得到高滴度等特點(diǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1275084A (申請(qǐng)?zhí)?8809116. X)公開了一種重組的豬腺病毒載體，包括穩(wěn)定整合并能表達(dá)至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒的重組載體。核苷酸序列優(yōu)選地是編碼豬霍亂病毒或假狂犬病病毒的抗原決定簇的序列。該腺病毒載體無法滿足豬α干擾素的表達(dá)要求。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1970774 (申請(qǐng)?zhí)?00610124194)公開了一種豬α干擾素重組腺病毒及其構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法步驟如下豬α干擾素IFN-α基因的擴(kuò)增、克??；含有IFN-a基因的重組穿梭載體的構(gòu)建；重組腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建；重組腺病毒的獲得。還公開了豬a干擾素重組腺病毒在制備抗病毒疫苗中的應(yīng)用。該方法獲得的重組腺病毒滴度較低，而且?guī)в蠫FP標(biāo)簽，不能應(yīng)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬α干擾素成熟蛋白(mIFNa )重組腺病毒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種豬a干擾素成熟蛋白重組腺病毒，其特征在于，將豬a干擾素表達(dá)基因插入到穿梭載體 pShuttle-CMV 中，制得 pShuttle-CMV-mlFNα ;然后將 pShuttle-CMV-mlFNα與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι發(fā)生同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAchmIFN α ;再經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、包裝，獲得豬ct干擾素成熟蛋白重組腺病毒rAd-mlFNa。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的豬α干擾素表達(dá)基因序列如SEQ ID NO. I所示。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNa的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的,所述的脂質(zhì)體為脂質(zhì)體Lipofectamine2000或293Fectin。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的細(xì)胞為293細(xì)胞或AD293細(xì)胞。上述豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟

(I)提取豬的外周血單核淋巴細(xì)胞的總RNA，然后利用RT-PCR擴(kuò)增豬α干擾素成熟蛋白基因，制得核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的基因片段；(2)將步驟(I)制得的基因片段插入穿梭載體pShuttle-CMV中，制得含有豬mIFNa的重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-mlFN a ；(3)將腺病毒骨架載體pAdEasy-1轉(zhuǎn)化至由BJ5183大腸桿菌制備的感受態(tài)細(xì)胞，制得含pAdEasy-Ι的BJ5183細(xì)胞，然后制備含pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞；(4)將步驟(2)制得的重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-mlFNa電轉(zhuǎn)化至由步驟(3)制得的含pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)同源重組后，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNα ；(5)將步驟(4)制得的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNa經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、包裝，獲得豬ct干擾素成熟蛋白重組腺病毒rAd-mlFNa。所述步驟(I)中，RT-PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所
/Jn ο上述豬a干擾素成熟蛋白重組腺病毒在制備豬抗病毒感染藥物中的應(yīng)用。上述操作如無特殊說明，均可采取本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。有益效果I、本發(fā)明構(gòu)建的豬a干擾素成熟蛋白重組腺病毒外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定，且滴度高而穩(wěn)定，重組腺病毒的滴度(組織細(xì)胞半數(shù)感染量)穩(wěn)定在108 67TCID5(l/mL，與現(xiàn)有干擾素相t匕，本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒滴度提高了 10000倍；2、本發(fā)明表達(dá)的是豬a干擾素成熟蛋白，成熟蛋白是真正發(fā)揮抗病毒作用的蛋白，不包含降低重組病毒滴度的疏水信號(hào)肽干擾蛋白的表達(dá)；3、本發(fā)明表達(dá)豬a干擾素成熟蛋白的腺病毒載體，由于該重組腺病毒采用人血清5型腺病毒，對(duì)人、豬等動(dòng)物沒有致病性，不表達(dá)GFP蛋白，生產(chǎn)上更安全；4、本發(fā)明利用腺病毒載體首次表達(dá)豬a干擾素成熟蛋白，該重組腺病毒突破了常規(guī)豬a干擾素的局限性，使豬a干擾素提前表達(dá)，使豬提前獲得抵抗病毒感染的能力；5、本發(fā)明所述重組腺病毒能在體內(nèi)進(jìn)行有限增值并且不斷表達(dá)mIFNa蛋白，表達(dá)的mIFNa具有廣譜抗病毒作用，通過抑制病毒的吸附、脫殼盒早期病毒核酸轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白合成以及成熟病毒的釋放等病毒感染過程的各個(gè)環(huán)節(jié)，起到抑制病毒增殖的效果；6、本發(fā)明所述重組腺病毒可以有效預(yù)防和治療由病毒引起的豬的多種傳染病，針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等疾病有顯著療效，提高公豬的精液質(zhì)量，降低母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及產(chǎn)仔數(shù)少等情況，實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病治愈率高達(dá)80-95%。本產(chǎn)品對(duì)豬瘟、口蹄疫等也有顯著地療效，顯著降低由此引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失，使豬的生產(chǎn)性能大大提高。


圖I是重組豬α干擾素成熟蛋白腺病毒的生產(chǎn)工藝流程圖；圖2是重組腺病毒質(zhì)粒的Pac I酶切鑒定的電泳圖；圖3是RT-PCR鑒定豬mIFN α重組腺病毒表達(dá)的電泳圖；圖4是Western-blot鑒定mIFNa重組腺病毒表達(dá)的電泳圖；
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中所述的腺病毒穿梭載體pShut11e-CMV、腺病毒骨架載體pAdEasy-1、BJ5183大腸桿菌、293細(xì)胞、AD293細(xì)胞均購自QbioGene公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、293Fectin購自Invitrogen公司；EcoR I內(nèi)切酶、Xho I內(nèi)切酶、Pac I內(nèi)切酶購自NEB公司。實(shí)施例I豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟一、豬α干擾素成熟蛋白腺病毒質(zhì)粒(pAd-mlFNa )的構(gòu)建I、細(xì)胞總RNA提取用淋巴細(xì)胞分離液(購自上海生工公司)分離豬的外周血單核淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(購自HyClone公司)稀釋成5 X IO VmL,種植24孔細(xì)胞板，每孔lmL。每孔中添加ConA(購自Sigma公司)至5μ g/mL，置37°〇、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄去上清，加入ImL TRIzol (購自Invitrogen公司),提取細(xì)胞總RNA, RNA提取步驟均按Invitrogen公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作。2、引物根據(jù)豬IFNa 序列(GenBank No. NM 001195377)設(shè)計(jì)引物上游引物5’ -GTAGAATTCATGTGCGACCTGCC-3，，下游引物5’ -GAACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG-3，。在上游引物中引入EcoRI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在下游引物中引入Xho I內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。3、豬α干擾素成熟蛋白基因的克隆將提取到的細(xì)胞總RNA作為模板,用TaKaRa公司出售的PrimeScript One-StepRT-PCR試劑盒擴(kuò)增豬α干擾素成熟蛋白編碼基因；反應(yīng)體系如下RNA模板3 μ L、2 X PrimeScript One-Step緩沖液12. 5 μ L、上下游引物各IuL (10 μ mol/L)和酶混合物(反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制劑)I μ L，加水至25 μ L混勻。反應(yīng)條件為50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù)變性2min，94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸45s，循環(huán)30次，最后72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到50Ibp大小的特異DNA條帶。PCR產(chǎn)物用DNA快速回收試劑盒(購自TaKaRa公司)回收，將回收的PCR產(chǎn)物與PMD19-T (購自TaKaRa公司)在16°C連接30min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，37°C培養(yǎng)16h 20h。挑取平板上的單菌落于氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜振蕩培養(yǎng)，次日應(yīng)用菌液PCR的方法擴(kuò)增IFNa成熟蛋白基因篩選陽性克隆，陽性重組質(zhì)粒命名為ρΤ-mIFNa ;鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒交由上海生工測(cè)序。豬IFNa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，將序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已發(fā)布的豬IFNa基因序列的同源性達(dá)到96%以上。·4、重組豬mIFNa穿梭載體的構(gòu)建將測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒ρΤ-mIFNa經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切，膠回收目的片段，克隆入與經(jīng)過EcoR I內(nèi)切酶和Xho I內(nèi)切酶雙酶切的腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，提取質(zhì)粒，用EcoR I內(nèi)切酶和Xho I內(nèi)切酶雙酶切鑒定和測(cè)序分析，獲得含有豬mIFN a的重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-mlFN a (具體步驟和操作條件可參見腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV的使用說明書)。5、含腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι的BJ5183大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備將腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι轉(zhuǎn)化至BJ5183大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(2. 5Κν、200Ω、25yF電擊)，用含氨芐青霉素(ΙΟΟμ g/mL)和鏈霉素(25μ g/mL)的LB平板培養(yǎng)基篩選，挑取單克隆，獲得含pAdEasy-Ι的BJ5183細(xì)胞，然后用冰冷的含10%甘油的雙蒸水(WB)洗滌BJ5183細(xì)胞2次，最后用1/100原始培養(yǎng)體積的WB重懸細(xì)胞，然后制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。6、重組豬mIFNa腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-mlFNa經(jīng)Pme I內(nèi)切酶(購自NEB公司)線性化后，膠回收，電轉(zhuǎn)化至含腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι的BJ5183大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)20h 24h，在大腸桿菌重組酶的作用下，穿梭載體和骨架載體發(fā)生同源重組，將外源基因轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體。挑取平板上的單菌落于卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜振蕩培養(yǎng)，次日堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pac I酶切，得到一條大約30kb的大片段和一條大約3kb的小片段(圖2)，表明含有目的基因的陽性重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNa構(gòu)建成功。將鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒交由上海生工測(cè)序，重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNa的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。二、重組腺病毒rAd-mlFNa的包裝及鑒定1、293細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存(I)將液氮中保存的293細(xì)胞株迅速放入37 42°C水浴中，劇烈搖晃，使之快速融化。(2) 2000rpm離心IOmin,吸去上清,加入ImL含10% (v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(購自HyClone公司)，漂洗細(xì)胞表面，吸去營(yíng)養(yǎng)液，重復(fù)2次。(3)加入ImL含10% (v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)使之分散，轉(zhuǎn)入25mL細(xì)胞瓶，補(bǔ)加4mL含10% (v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，搖勻后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(4)每天在倒置生物顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2天傳代一次。(5)把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好的293細(xì)胞完全消化下來，離心、沉淀293細(xì)胞，用少量含10% (v/v)小牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(6)用含50% (v/v)小牛血清的DMEM、40% (v/v)小牛血清和10% (v/v)小牛血清的DMSO的細(xì)胞凍存液使細(xì)胞密度達(dá)到I X IO6個(gè)/mL，在I. 8mL凍存管中分裝I. OmL的293細(xì)胞，把凍存管置于液氮罐液氮面上方，24h后把細(xì)胞沉到液氮面以下。2、豬mIFNa重組腺病毒的包裝與鑒定與表達(dá)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFN a經(jīng)Pac I內(nèi)切酶酶切純化后，經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝獲得重組豬mIFN α腺病毒rAdiIFN α。提取重組病毒的RNA，進(jìn)行RT-PCR鑒定，擴(kuò)增出約50Ibp的片段，未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞結(jié)果為陰性，與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果如圖3所示。 3、豬mIFNa重組腺病毒的表達(dá)與鑒定將感染rAd-mlFNa的293細(xì)胞離心，收集細(xì)胞，加入2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min,用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。Western-blot結(jié)果表明重組腺病毒在293細(xì)胞中表達(dá)了目的蛋白，蛋白大小(ISkD)與預(yù)期的蛋白分子量一致，結(jié)果如圖4所不。此蛋白為豬α干擾素成熟蛋白(mIFN a )基因表達(dá)廣物。4、豬mIFNa重組腺病毒的純化在24孔細(xì)胞板的每一個(gè)孔2 X IO4個(gè)293細(xì)胞，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將重組病毒按照1%體積比接種細(xì)胞，37°C吸附Ih ;棄去上清，用DMEM洗滌細(xì)胞2次；在一無菌的三角燒瓶中加入IOmL 37°C預(yù)熱的含1 丨％青霉素、1被％鏈霉素和4wt%血清的2 X DMEM，和IOmL高壓滅菌的2wt%的瓊脂糖，充分混勻后置于37°C水浴鍋中；按24孔細(xì)胞板的每一孔加500 μ L上述瓊脂糖，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察噬斑；用滅菌吸頭挑取包含單個(gè)噬斑的瓊脂糖塊放入滅菌離心管中，加入200 μ L滅菌的PBS，將瓊脂糖塊搗碎后，反復(fù)凍融3次；12000rpm離心5min ;將收獲的病毒上清接種于一新的24孔細(xì)胞板中。5、豬mIFNa重組腺病毒的TCID5tl測(cè)定按照《動(dòng)物病毒學(xué)》(科學(xué)出版社，出版號(hào)9787030060532，出版日期1997年11月)中第十四章中記載的方法，用含2wt%血清和lwt%青霉素、lwt%鏈霉素的DMEM維持液將重組腺病毒作10倍比稀釋，然后分別接種于長(zhǎng)滿293細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每個(gè)孔接種100 μ L0同時(shí)設(shè)定維持液陰性對(duì)照。37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察并記錄細(xì)胞病變，按照Reed-Much法計(jì)算病毒TCID5(I。重組病毒效價(jià)為108 67TCID5(l/mL。6、豬mIFNa重組腺病毒的穩(wěn)定性試驗(yàn)將重組腺病毒rAd-mlFN a在293細(xì)胞上連續(xù)傳代50代，每5代分別檢測(cè)rAd-mlFNa中mIFNa的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，同時(shí)測(cè)定其組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID5Q)。結(jié)果表明，mIFNa在重組腺病毒rAd-mlFN a連續(xù)傳代過程中表達(dá)穩(wěn)定，其TCID5tl也一直穩(wěn)定，未發(fā)生變化。綜上所述，將純化的重組腺病毒rAd-mlFN a在293細(xì)胞上連續(xù)傳代50代，每5代檢測(cè)重組腺病毒中mIFN a的表達(dá)情況，同時(shí)測(cè)定其TCID5(I。結(jié)果證明，重組腺病毒能穩(wěn)定表達(dá)mIFNa蛋白，而且其TCID5tl穩(wěn)定，種毒的滴度穩(wěn)定在108 67TCID5(l/mL。實(shí)施例2
如實(shí)施例I所述的豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒的構(gòu)建方法，不同之處在于，脂質(zhì)體為293Fectin，轉(zhuǎn)染細(xì)胞為AD293細(xì)胞。實(shí)施例3豬mIFNa重組腺病毒的大量制備將實(shí)施例I和實(shí)施例2純化的重組腺病毒rAd-mlFN a在293細(xì)胞上連續(xù)傳代50代，檢測(cè)其豬mIFNa的表達(dá)情況，證明豬mIFN a表達(dá)穩(wěn)定，而且重組病毒的滴度穩(wěn)定在108_67TCID5(l/mL。在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，用純化的豬mIFNa重組腺病毒按IO4TCID5tl接種長(zhǎng)成單層的293細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80 90%時(shí)收獲病毒，凍融后即可獲得豬mIFNa重組腺病毒，分別標(biāo)記為樣品I和樣品2。

實(shí)施例4豬mIFNa重組腺病毒對(duì)豬病毒性疾病治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)案例一豬mIFN a重組腺病毒對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的治療30日齡斷奶仔豬160頭，隨機(jī)分成I、II組，每組80頭。每組中再隨機(jī)分成4小組，每小組20頭，包括樣品I和樣品2兩個(gè)試驗(yàn)小組各3個(gè)不同劑量組和2個(gè)對(duì)照組。分別于攻毒后肌肉注射兩個(gè)樣品的豬mIFN a重組腺病毒108TCID5(I、2 X 108TCID5(I、3 X IO8TCID5tl,非治療對(duì)照組注射ImL生理鹽水。攻毒后2天開始治療，肌肉注射豬mIFN a重組腺病毒，每天一次，連續(xù)使用三天。連續(xù)觀察14天。保護(hù)率=(AXB-C)/AXB，A為試驗(yàn)組豬，B為對(duì)照組發(fā)病/死亡比例，C為試驗(yàn)組發(fā)病/死亡豬數(shù)。表I各組試驗(yàn)豬干擾素注射量(IO8TCID5tl/只)
Λ1Ι試驗(yàn)紐X (X=A成B 1 C)對(duì)照汛
1\ I m —————
XlX2X3X4
I0.51.01.5-
_I_oj_u_y_=_以IO8TCID5tl/頭劑量的豬mIFN a重組腺病毒肌肉注射治療，斷奶仔豬可以獲得80%以上的保護(hù)率；以2X IO8TCID5tl/頭劑量的豬mIFN a重組腺病毒肌肉注射治療，斷奶仔豬可以獲得95%以上的保護(hù)率。肌肉注射治療使用時(shí)以2X IO8TCID5tl/頭為宜。案例二豬mIFNa重組腺病毒對(duì)豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)的治療30日齡斷奶仔豬160頭，隨機(jī)分成I、II組，每組80頭。每組中再隨機(jī)分成4小組，每小組20頭，包括樣品I和樣品2兩個(gè)試驗(yàn)小組各3個(gè)不同劑量組和2個(gè)對(duì)照組。分別于攻毒后肌肉注射兩個(gè)樣品的豬mIFN a重組腺病毒108TCID5(I、2 X 108TCID5(I、3 X IO8TCID5tl,非治療對(duì)照組注射ImL生理鹽水。攻毒后2天開始治療，肌肉注射豬mIFN a重組腺病毒，每天一次，連續(xù)使用三天。連續(xù)觀察14天。保護(hù)率=(AXB-C)/AXB，A為試驗(yàn)組豬，B為對(duì)照組發(fā)病/死亡比例，C為試驗(yàn)組發(fā)病/死亡豬數(shù)。表2各組試驗(yàn)豬干擾素注射量(IO8TCID5tl/只)
權(quán)利要求
1.一種豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒，其特征在于，將豬α干擾素表達(dá)基因插入到穿梭載體 pShuttle-CMV 中，制得 pShuttle-CMV-mlFN α ;然后將 pShuttle-CMV-mlFN α 與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι發(fā)生同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAchmIFN α ;再經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、包裝，獲得豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒rAd-mlFNa。
2.如權(quán)利要求I所述的豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒，其特征在于，所述的豬α干擾素表達(dá)基因序列如SEQ ID NO. I所示。
3.如權(quán)利要求I所述的豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFN α的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.如權(quán)利要求I所述的豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒，其特征在于，所述的脂質(zhì)體為脂質(zhì)體 Lipofectamine2000 或 293Fectin。
5.如權(quán)利要求I所述的豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒，其特征在于，所述的細(xì)胞為293細(xì)胞或AD293細(xì)胞。
6.權(quán)利要求I所述豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)提取豬的外周血單核淋巴細(xì)胞的總RNA，然后利用RT-PCR擴(kuò)增豬α干擾素成熟蛋白基因，制得核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的基因片段； (2)將步驟(I)制得的基因片段插入穿梭載體pShuttle-CMV中，制得含有豬mIFNa的重組腺病毒穿梭載體pShutt I e-CMV-mIFN a ； (3)將腺病毒骨架載體pAdEasy-1轉(zhuǎn)化至由BJ5183大腸桿菌制備的感受態(tài)細(xì)胞，制得含pAdEasy-Ι的BJ5183細(xì)胞，然后制備含pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞； (4)將步驟(2)制得的重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-mlFNa電轉(zhuǎn)化至由步驟(3)制得的含pAdEasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)同源重組后，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNα ； (5)將步驟(4)制得的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mlFNa經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、包裝，獲得豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒rAd-mlFNa。
7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(I)中，RT-PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
8.權(quán)利要求I所述豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒在制備豬抗病毒感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，它是將豬α干擾素表達(dá)基因插入到穿梭載體pShuttle-CMV中，制得pShuttle-CMV-mIFNα；然后將pShuttle-CMV-mIFNα與腺病毒骨架載體pAdEasy-1發(fā)生同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mIFNα；再經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、包裝，獲得豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒rAd-mIFNα。本發(fā)明構(gòu)建的豬α干擾素成熟蛋白重組腺病毒外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定，且滴度高而穩(wěn)定，重組腺病毒的滴度穩(wěn)定在108.67TCID50/mL，與現(xiàn)有干擾素相比，本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒滴度提高了10000倍。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102787102SQ201210324020
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者叢曉燕, 任素芳, 呂偉, 吳家強(qiáng), 孫文博, 宋恩亮, 時(shí)建立, 李俊, 杜以軍, 王金寶, 郭立輝, 黃保華 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所