專利名稱：一種克隆原病毒插入位點的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種以生物素-鏈霉親和素為基礎(chǔ)的純化，采用納米級鏈霉親和素磁珠，并以補加末端腺苷的引物延伸反應(yīng)，來改進克隆原病毒插入位點的方法。
背景技術(shù)：
人類基因組及大部分模式生物基因組序列的確定和利用，極大地推動了生命科學和生物技術(shù)逐漸進入功能基因組時代。隨著越來越多的生物醫(yī)學有機體和工業(yè)上重要物種的序列被測定，了解這些序列所攜帶的生命信息，以及它們是如 何影響細胞的發(fā)育、個體的健康和行為、甚至是生物的進化，是一個重要有趣且長期的工作。插入誘變方法，在很多功能基因組學的研究工作中，已經(jīng)被證明是一種卓有成效的方法。在過去的十年里，我們已經(jīng)見證插入誘變在探索腫瘤相關(guān)的遺傳問題方面的應(yīng)用，這涉及到不同方面的細胞活性調(diào)節(jié)，包括細胞周期、增殖、分化、細胞凋亡及衰老。而這一策略的成功運用，核心在于是否能夠獲得一種高效鑒定誘變劑插入位點的技術(shù)方法。在已開發(fā)的各種方法里，以連接介導的聚合酶鏈式反應(yīng)(簡稱，LM-PCR)為基礎(chǔ)的方法，已經(jīng)被成功地應(yīng)用于鑒定不同的插入誘變劑的位點中，如逆轉(zhuǎn)錄病毒和轉(zhuǎn)座子，等。目前，已經(jīng)報道了兩種基于連接介導PCR的、用于分離原病毒插入位點(簡稱，PISs)的方法，即=SplinkBlunt-PCR和SplinkTA-PCR(STA-PCR)。這兩種方法已經(jīng)被用于鑒定由近交系小鼠BXH-2衍生出來的白血病細胞里存在的PISs位點。BXH-2小鼠可以在生命的早期，自發(fā)產(chǎn)生一種鼠白血病病毒(簡稱，B-MuLV)。這種BXH-2MuLV不僅可以作為一種DNA插入誘變劑引起白血病，而且可以作為一種白血病相關(guān)基因的標簽，幫助人們來尋找白血病基因。所以，由BXH-2小鼠生成的白血病細胞中的遺傳基因突變，可以通過分離BXH-2MuLV的PISs位點來鑒定。然而為了獲得最大的PISs回收率，以往需要對每一個DNA樣本同時運用兩種PCR方法。這不僅需要很多繁瑣的操作，而且會耗費更多常常得來不易、數(shù)量有限、寶貴的DNA樣本資源。因此，設(shè)計和評估出可以用于有效研究DNA元件的PISs及其他類型的插入位點的新方法是迫切需要的。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的，在于提供一種效率更高、更簡便節(jié)約的克隆原病毒插入位點的方法。為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)—種克隆原病毒插入位點的方法,首先,提取基因組DNA為起始材料,然后,進行以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方案，最后，在基礎(chǔ)的鼠基因組數(shù)據(jù)庫中通過BLAST尋找比對分析得到基因組DNA序列的側(cè)翼原病毒插入物序列；所述以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方案包括以下步驟
3. I)酶切，使用限制性內(nèi)切酶混合物Hind III，Pvu II and Xho I (Thermo)對不同基因組DNA進行酶切，37°C孵育2 3hrs，然后，使用AxyPi^p PCR純化試劑盒(Axygen, California, CA, USA)依照使用說明對酶切產(chǎn)物進行純化；簡而言之，加入3倍體積的Buffer PCR-A，混勻并轉(zhuǎn)移至AxyPapTMPCR洗脫柱中，12，000 Xg離心lmin，用700μ IBuffer W2進行洗滌，然后用拖O洗脫出DNA ；3. 2)延伸;3.3)純化，為了捕獲所述延伸產(chǎn)物，使用鏈霉親和素 包裹的磁珠和引物延伸產(chǎn)物混合，室溫20_25°C孵育O. 5-2hrs ;所述磁珠在使用前需洗漆并重懸于2X封閉洗漆緩沖液中，所述緩沖液包含IOmMTris-HCl，pH 7. 5, ImM EDTA和2M NaCl ;然后，使用磁力架收集帶有生物素的DNA片段；3.4)連接，使用T4DNA連接酶將捕獲到的帶有生物素的DNA連接到適量的SplinkTA上，16°C孵育16_20h ;所述SplinkTA是將等分子量的寡核苷酸splinkerette和PrimerLongTA混勻，92°C孵育2min后緩慢降溫至室溫20_25°C而制得；3. 5) PCR及巢式PCR，使用捕獲連接的帶有生物素的DNA片段，并以此作為PCR模板；首輪 PCR 是在含有 I. 5mM MgCl2、O. 2mMdNTPs、20pmol 引物 AKVp7774、20pmol 引物P-short及2. 5UTaq DNA聚合酶的反應(yīng)體系中進行，其反應(yīng)程序是95 °C lmin 30s ；94°C 15s，70°C 2min 40s，共 10 個循環(huán)；94°C 15s，64°C 30s, 70°C 2min 10s，共 20 個循環(huán)；最后70°C延伸IOmin ;在二輪PCR中，除了是使用首輪PCR產(chǎn)物作為模板并將引物替代為巢式引物AKVp8712和P-nested，所有反應(yīng)成分和首輪PCR相同，其熱循環(huán)參數(shù)改為95°C lmin30s -M0C 15s,70°C 2min 10s，共 11 個循環(huán)；94°C 15s,64°C 30s, 70°C lmin 45s，共 25 個循環(huán)；最后70°C延伸IOmin ;最后，使用I %瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗。3. 6) PCR產(chǎn)物克??；使用所述AxyPi^p PCR純化試劑盒純化第二輪PCR的產(chǎn)物，根據(jù)操作說明連接到pMD 19-T載體上，然后進行轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆并測序。進一步的，所述基因組DNA可以、但不限于通過以下方法獲得步驟I)培養(yǎng)細胞系所述細胞系是BXH-2小鼠白血病細胞系，培養(yǎng)在常規(guī)的ASM培養(yǎng)液中并在含有5% CO2的潮濕的環(huán)境中37°C孵育；步驟2)提取基因組DNA :使用天根基因組提取試劑盒依據(jù)操作說明對收集的細胞進行基因組DNA的提取，然后溶解于超純水中并在_30°C的溫度下貯存。進一步的，所述延伸通過以下過程實現(xiàn)，每一個酶切的DNA均在含有I. 5mMMgC12,0. 2mM dNTPs，20pmol 生物素化的引物 Bio_AKVp7711 及 2. 5U Taq DNA polymerase的緩沖液中95°C孵育5min，然后64°C孵育30min、72°C中孵育20min ;然后將所得延伸產(chǎn)物用AxyPrep PCR純化試劑盒進行純化。優(yōu)選的，步驟3. 3的純化過程中使用納米級鏈霉親和素包裹的磁珠得到更多的特異性目的條帶，表明該方法克隆PIS位點的效率更高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法是一種高效率的、更便宜快速的用于克隆篩選PIS位點的工具，具體的說，具有以下有益效果(I)采用了 SplinkTA,它是由splinkerette變型而來,末端延伸的胸苷可以提高雙鏈DNA的連接效率，并減少形成平末端連接產(chǎn)物而可能造成的錯誤判斷。(2)純化時用納米級磁珠替代微米級鏈霉親和素的磁珠可以產(chǎn)生更清晰的背景并獲得更高的效率。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。本發(fā)明的具體實施方式
由以下實施例及其附圖詳細給出。


此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中圖I為用于克隆基因組DNA側(cè)翼序列的原病毒插入位點的APE-PCR方法的原理流程圖。由一組限制性內(nèi)切酶混合物(X，Y andz)對包含有原病毒基因組序列(黑框)的基因組DNA(水平線)進行酶切，且在用于首輪和第二輪PCR的引物(水平箭頭)的下游沒有識別位點。對酶切后的雙鏈DNA進行變性，5’末端生物素化(實心圓圈)的原病毒序列特異性的引物退火結(jié)合到單鏈DNA片段上的互補區(qū)域，立即使用Taq DNA聚合酶進行引物延伸， 其合成的DNA在3’末端產(chǎn)生額外的腺苷(空星形)，然后將引物延伸產(chǎn)物連接到SplinkTA上,SplinkTA是在Splinkerette末端添加一個胸苷(實星形)變型而來的連接物(13,14)。隨后將產(chǎn)物連接到SplinkBlunt上。用鏈霉親和素包裹的磁珠對帶有生物素化的DNA片段進行純化。然后進行兩輪PCR，并將PCR產(chǎn)物進行克隆和測序。圖2是兩種不同的細胞系，使用以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)和SplinkBlunt-PCR兩種方法的結(jié)果比較；其中，圖2(a)為B117H，圖2(b)為B139，分別是BXH2小鼠衍生的白血病樣本；M DL10, 000DNA marker.白色箭頭顯示的是比較后多出的條帶；空心圈指示的是不清晰的條帶；DNA Marker的大小標注在了電泳圖的右側(cè)。圖3為使用不同量的基因組DNA測定以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法的敏感性；PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定；M1 DL1, 000DNA marker ；M2 DL1, 000DNAmarker.基因組DNA來源于B140pA細胞系；加入基因組DNA的質(zhì)量由少到多分別是0. 1，O. 5,1. O, I. 5 μ g. DNA marker的大小標注在電泳圖的兩側(cè)。圖4為使用以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法時，采用不同尺寸大小的磁珠、鑒定原病毒插入位點間的比較；基因組DNA來源于B114細胞系；M1 DL1, 000DNA marker ；M2 DLl, 000DNA marker. DNA marker的大小標注在電泳圖的兩側(cè)。
具體實施例方式下面將參考附圖并結(jié)合實施例，來詳細說明本發(fā)明。一種克隆原病毒插入位點的方法，其包括以下步驟步驟I)培養(yǎng)細胞系，所述細胞系是BXH-2小鼠白血病細胞系，培養(yǎng)在常規(guī)的ASM培養(yǎng)液中并在含有5% CO2的潮濕的環(huán)境中37°C孵育；步驟2)提取基因組DNA，使用天根基因組提取試劑盒依據(jù)操作說明對收集的細胞進行基因組DNA的提取，然后溶解于超純水中的DNA貯存在-30°C中；步驟3)進行以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)(APE-PCR)，所述以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)包括以下步驟3. I)酶切，使用限制性內(nèi)切酶混合物Hind III，Pvu II and Xho I (Thermo)對不同基因組DNA進行酶切，37°C孵育2 3hrs ;然后，使用AXyPapTM PCR純化試劑盒(Axygen，California, CA，USA)依照使用說明對酶切產(chǎn)物進行純化；3. 2)延伸，每一個酶切的DNA均在含有L 5mM MgCl2，O. 2mMdNTPs, 20pmol生物素化的引物 Bio-AKVp7711 及 2. 5U Taq DNApolymerase 的緩沖液中 95°C孵育 5min，然后 64°C孵育30min、72°C中孵育20min ;然后將所得延伸產(chǎn)物用AxyPi^p PCR純化試劑盒進行純化；3.3)純化，為了捕獲所述延伸產(chǎn)物，使用鏈霉親和素包裹的磁珠和引物延伸產(chǎn)物混合，室溫20_25°C孵育O. 5-2hrs ;所述磁珠在使用前需洗漆并重懸于2X封閉洗漆緩沖液 中，所述緩沖液包含IOmMTris-HCl，pH 7. 5, ImM EDTA和2M NaCl ;然后，使用磁力架收集帶有生物素的DNA片段；3.4)連接，使用T4DNA連接酶將捕獲到的帶有生物素的DNA連接到適量的SplinkTA上，16°C孵育16_20h ;所述SplinkTA是將等分子量的寡核苷酸splinkerette和PrimerLongTA混勻，92°C孵育2min后緩慢降溫至室溫20_25°C而制得；3.5)首輪PCR及第二輪PCR，使用捕獲連接的帶有生物素的DNA片段，并以此作為 PCR 模板；首輪 PCR 是在含有 I. 5mM MgCl2、O. 2mM dNTPs、20pmol 引物 AKVp7774、20pmol引物P-short及2. 5U Taq DNA聚合酶的反應(yīng)體系中進行，其反應(yīng)程序是95°C lmin 30s ；94°C 15s，70°C 2min 40s，共 10 個循環(huán)；94°C 15s，64°C 30s, 70°C 2min 10s，共 20 個循環(huán)；最后70°C延伸IOmin ;在二輪PCR中，除了是使用首輪PCR產(chǎn)物作為模板并將引物替代為巢式引物AKVp8712和P-nested，所有反應(yīng)成分和首輪PCR相同，其熱循環(huán)參數(shù)改為95°C lmin30s -M0C 15s,70°C 2min 10s，共 11 個循環(huán)；94°C 15s,64°C 30s, 70°C lmin 45s，共 25 個循環(huán)；最后70°C延伸IOmin ;最后，使用I %瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗。3. 6) PCR產(chǎn)物克?。皇褂盟鯝xyPi^p PCR純化試劑盒純化第二輪PCR的產(chǎn)物，根據(jù)操作說明連接到pMD 19-T載體上，然后進行轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆并測序。步驟4)在基礎(chǔ)的鼠基因組數(shù)據(jù)庫中通過BLAST尋找比對分析得到基因組DNA序列的側(cè)翼原病毒插入物序列。本實施例比較分析SplinkBlunt-PCR和以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)新的操作方法可知，限制性內(nèi)切酶可被替換為Hindlll，pvu II和Xho I，而引物延伸反應(yīng)是由Axygen純化試劑盒純化而不是YM-30洗脫柱.我們嘗試了改進的方法，證明使用得很好而且便宜效率又高。我們之前的研究顯示，對于一些樣本單獨使用SplinkBlunt-PCR和SplinkTA-PCR這兩種方法不能獲得完整的PIS位點回收，表明我們需要同時運用這兩種方法，才可以獲得更好的Pis回收率。但這種做法，顯然浪費人力物力。APE-PCR采用了我們先前研究的與Taq DNA聚合酶通過非模板聚合機制產(chǎn)生額外的腺苷形成黏性連接，它不僅可以提高連接效率，減少形成假的串聯(lián)的平末端連接的DNA片段的可能性，去除大多數(shù)的非特異性的模板DNA，還可以使用不同的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生不同的酶切片段可以使相容性最大化。這樣可以在PCR膠上產(chǎn)生更少的背景并使PCR條帶更易回收。顯然，以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)的方法可以提高原病毒插入位點的篩選率。所以我們進行了一系列的實驗來證明我們的猜想。具體的，參見圖I所示用于克隆基因組DNA側(cè)翼序列的原病毒插入位點的APE-PCR方法的原理流程圖。由一組限制性內(nèi)切酶混合物(X，Y and Z)對包含有原病毒基因組序列(黑框)的基因組DNA(水平線)進行酶切，且在用于首輪和第二輪PCR的引物(水平箭頭)的下游沒有識別位點。對酶切后的雙鏈DNA進行變性，5’末端生物素化(實心圓圈)的原病毒序列特異性的引物退火結(jié)合到單鏈DNA片段上的互補區(qū)域，立即使用Taq DNA聚合酶進行引物延伸，其合成的DNA在3’末端產(chǎn)生額外的腺苷(空星形)，然后將引物延伸產(chǎn)物連接到SplinkTA上,SplinkTA是在Splinkerette末端添加一個胸苷(實星形)變型而來的連接物(13，14)。隨后將產(chǎn)物連接到SplinkBlunt上。用鏈霉親和素包裹的磁珠對帶有生物素化的DNA片段進行純化。然后進行兩輪PCR，并將PCR產(chǎn)物進行克隆和測序。參見圖2所不，圖2為兩種不冋的細胞系，使用以腺昔為末端的弓I物延伸反應(yīng)和SplinkBlunt-PCR兩種方法的結(jié)果比較。其中，圖2(a)為B117H，圖2(b)為B139分別是BXH2小鼠衍生的白血病樣本；M:DL 10, 000DNA marker.白色箭頭顯示的是比較后多出的條帶；空心圈指示的是不清晰的條帶；DNA Marker的大小標注在了電泳圖的右側(cè)。
本實施例中選擇的兩種不同的細胞系都是BXH-2急性髓性白血病細胞系。這兩種基因組DNA分別使用SplinkBlunt-PCR和以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法進行操作。此后選擇1%凝膠進行電泳。雖然使用不同的細胞系，但是得到相似的結(jié)果。由以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法得到的條帶比使用SplinkBlum-PCR方法得到的條帶要明顯增多。我們發(fā)現(xiàn)使用以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法得到的部分產(chǎn)物長度達到了幾千bp (見圖2)。此外，單獨收集第二輪PCR產(chǎn)物，然后克隆到pMD 19-T載體中進行藍白斑篩選并測序。測序得到的結(jié)論與電泳圖譜得到的結(jié)論是一致的(數(shù)據(jù)沒有顯示)?？偠灾@些實驗數(shù)據(jù)證實了本實施例的方法的有效性，同時也是一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的鑒定原病毒插入位點較好的方法。參見圖3所示，所述圖3為使用不同質(zhì)量的基因組DNA測定以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法的敏感性；PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定；M1 DL1, 000DNA marker ；M2 DL1, OOODNAmarker.基因組DNA來源于B140pA細胞系；加入基因組DNA的質(zhì)量由少到多分別是O. 1,0. 5，I. O, I. 5μ g. DNA marker的大小標注在電泳圖的兩側(cè)。此外，運用本實施的方法對基因組DNA質(zhì)量敏感性進行了一些初步探索研究。測定了四種細胞系，從中得知，DNA質(zhì)量從O. 1μ g_3y g都是可以的。使用O. 01 μ g的基因組DNA可以得到模糊的部分條帶但不清晰(見圖3，數(shù)據(jù)沒有顯示完全)。我們還發(fā)現(xiàn)對于不同的細胞系需要基因組DNA的最佳量是不同的，但是I. 5μ g基因組DNA是最佳的選擇。參見圖4所示，所述圖4為使用以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法時，采用不同尺寸大小磁珠鑒定不同原病毒插入位點間的比較；基因組DNA來源于BI 14細胞系；Ml :DLl, 000DNA marker ；M2 DL1, 000DNA marker. DNA marker 的大小標注在電泳圖的兩側(cè)。NanoLink 鏈霉親和素磁珠是O. 8 μ m，而Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠是2. 8 μ m大小。它們都是超順磁顆粒并包含有共價交聯(lián)的鏈霉親和素，具有親水性，內(nèi)層包裹有多聚合物(沒有裸露的鐵原子)，而且有快速的磁鐵反應(yīng)時間。在這個方法里,本實施例使用以往常用的微米級的鏈霉親和素磁珠(Invitrogen,直徑2.8 μ m)純化得到特異性目的條帶。包裹有鏈霉親和素的磁珠作為一種固相基質(zhì)可以簡單有效地結(jié)合生物素化的寡核苷酸。理論上來說，減小磁珠的直徑可以增大有效面積比和負載能力，同時用量少、可減少大量的大顆粒可能帶來的不利影響，如可能的空間位阻效應(yīng)。減少固定結(jié)合生物素化產(chǎn)物的磁珠顆粒使用量還可以降低成本、減少非特異性的產(chǎn)物背景。本實施例使用納米級鏈霉親和素磁珠(Solulink, diameter 150_850nm)來驗證這一理論猜想。本實施例的方法對不同的DNA樣本進行這一實驗猜想。實驗結(jié)果表明，納米級磁珠的效果更好。這里本實施例展示了使用微米級磁珠和納米級磁珠鑒卻114細胞系中原病毒插入位點的比較(豳)。電泳圖中顯示了較小尺寸的磁珠可以得到更多的條帶以及更清晰的電泳圖背景。綜上所述，我們的實驗數(shù)據(jù)顯示，在以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)方法中使用納米級鏈霉親和素磁珠可以得到更好的結(jié)果。本實施例的方法已經(jīng)在BXH-2小鼠白血病細胞中鑒定PIS位點獲得了成功，而這也同樣適用于篩選其他種類的逆轉(zhuǎn)錄病毒導致的癌癥模型的插入位點，或者是繪制其它類型插入誘變核酸片段的插入位點，如轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(又稱逆轉(zhuǎn)座子)等插入位點的鑒定。這個技術(shù)也可以用來測定基因組DNA片段的終止子，染色體斷點的缺失和易位，內(nèi)含子-外顯子的連接以及基因調(diào)控區(qū)域。
術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種克隆原病毒插入位點的方法，首先，提取基因組DNA為起始材料，其特征在于然后，進行以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)，最后，在基礎(chǔ)的鼠基因組數(shù)據(jù)庫中通過BLAST尋找比對分析得到基因組DNA序列的側(cè)翼原病毒插入物序列；所述以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)包括以下步驟 3.I)酶切，使用限制性內(nèi)切酶混合物Hind III，Pvu II and Xho I對不同基因組DNA進行酶切，37°C孵育2 3hrs ;然后，使用AxyPi^p PCR純化試劑盒依照使用說明對酶切產(chǎn)物進行純化； 3.2)延伸； 3.3)純化，為了捕獲所述延伸的產(chǎn)物，使用鏈霉親和素包裹的磁珠和引物延伸產(chǎn)物混合，室溫20-25°C孵育O. 5-2hrs ;所述磁珠在使用前需洗漆并重懸于2X封閉洗漆緩沖液中，所述緩沖液包含IOmM Tris-HCl,pH 7. 5, ImM EDTA和2M NaCl ;然后，使用磁力架收集帶有生物素的DNA片段； 3.4)連接，使用T4DNA連接酶將捕獲到的帶有生物素的DNA連接到適量的SplinkTA上，16 V孵育16-20h ；所述SplinkTA是將等分子量的寡核苷酸splinkerette和PrimerLongTA混勻，92°C孵育2min后緩慢降溫至室溫20_25°C而制得； 3.5)首輪PCR及第二糊CR，使用捕獲連接的帶有生物素的DNA片段，并以此作為首輪 PCR 的模板；所述首輪 PCR 是在含有 I. 5mMMgCl2、0. 2mM dNTPs、20pmol 引物 AKVp7774、20pmol引物P-short及2. 5U Taq DNA聚合酶的反應(yīng)體系中進行，其反應(yīng)程序是95°C Imin30s -M0C 15s,70°C 2min 40s，共 10 個循環(huán)；94°C 15s,64°C 30s, 70°C 2min 10s，共 20 個循環(huán)；最后70°C延伸IOmin ;在二輪PCR中，除了是使用所述首輪PCR的產(chǎn)物作為模板并將引物替代為巢式引物AKVp8712和P-nested，所有反應(yīng)成分和所述首輪PCR相同，其熱循環(huán)參數(shù)為 95°C Imin 30s ；94°C 15s，70°C 2min 10s，共 11 個循環(huán)；94°C 15s，64°C 30s, 70°C Imin45s，共25個循環(huán)；最后70°C延伸IOmin ;最后，使用I %瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗。
3.6) PCR產(chǎn)物克?。皇褂盟鯝xyPrep PCR純化試劑盒純化第二輪PCR的產(chǎn)物，根據(jù)操作說明連接到pMD 19-T載體上，然后進行轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆并測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的克隆原病毒插入位點的方法，其特征在于，所述基因組DNA通過以下方法獲得 步驟I)培養(yǎng)細胞系所述細胞系是BXH-2小鼠白血病細胞系，培養(yǎng)在常規(guī)的ASM培養(yǎng)液中并在含有5% CO2的潮濕的環(huán)境中37°C孵育； 步驟2)提取基因組DNA :使用天根基因組提取試劑盒依據(jù)操作說明對收集的細胞進行基因組DNA的提取，然后溶解于超純水中并在_30°C的溫度下貯存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的克隆原病毒插入位點的方法，其特征在于所述延伸通過以下過程實現(xiàn)，每一個酶切的DNA均在含有I. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTPs,20pmol生物素化的引物 Bio-AKVp7711 及 2. 5U Taq DNA polymerase 的緩沖液中 95°C孵育 5min，然后 64°C孵育30min、72°C中孵育20min ;然后將所得延伸產(chǎn)物用所述AxyPi^p PCR純化試劑盒進行純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的克隆原病毒插入位點的方法，其特征在于在所述的步驟3. 3純化過程中，使用納米級鏈霉親和素包裹的磁珠得到特異性目的條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克隆原病毒插入位點的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)細胞系；2)提取基因組DNA；3)進行以腺苷為末端的引物延伸反應(yīng)，包括酶切、延伸、純化、連接、首輪PCR及第二輪PCR和PCR產(chǎn)物克?。?)在基礎(chǔ)的鼠基因組數(shù)據(jù)庫中通過BLAST尋找比對分析得到基因組DNA序列的側(cè)翼原病毒插入物序列。本發(fā)明是一種高效率的、更便宜、快速的用于精確定位外源遺傳元件在另一個遺傳物質(zhì)中插入位點的工具；即使是微量的樣品DNA，也可以從中分離、分析其病毒插入位點。該方法將不僅應(yīng)用于定位白血病細胞中的病毒插入位點、尋找白血病相關(guān)基因，而且也將在定位其它DNA片段的插入位點時發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/10GK102816755SQ201210323558
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
發(fā)明者尹斌, 毛政偉, 徐中娟 申請人:蘇州大學