專利名稱：一種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
Y -氨基丁酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理活性。Y-氨基丁酸可以降低神經(jīng)元活性、降血壓、抗焦慮、改善睡眠、調(diào)節(jié)激素分泌。
Y-氨基丁酸作為一種新型功能性因子，已經(jīng)廣泛應用于食品、醫(yī)療等領域。已經(jīng)報道在有些細菌中存在Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白。例如在大腸桿菌中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白基因位于與Y-氨基丁酸代謝相關的基因簇中。而在枯草芽孢桿菌中Y-氨·基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白基因與Y-氨基丁酸代謝相關的基因并不相鄰。大腸桿菌的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白與枯草芽孢桿菌的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白屬于氨基酸一多聚胺一有機金屬離子(amino acid-polyamine-organocation)超家族(APC Superfamily)。在棒桿菌屬細菌中還沒有報道有Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白存在。轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在細胞代謝過程中起關鍵作用，營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，代謝物的分泌，能量和信息的交換都與轉(zhuǎn)運系統(tǒng)密切相關。氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)普遍存在于真核和原核細胞。細胞可以利用氨基酸內(nèi)運系統(tǒng)從環(huán)境中攝入可利用的氨基酸，而直接用于蛋白質(zhì)或肽的合成，或通過分解代謝為細胞提供碳源、氮源或能源。氨基酸外運系統(tǒng)在產(chǎn)物分泌過程中起重要作用。氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)除了其生理上的重要性以外，在氨基酸生產(chǎn)方面也是十分重要的。多種氨基酸都可以通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。氨基酸外運系統(tǒng)在產(chǎn)物分泌中起重要作用，而氨基酸內(nèi)運系統(tǒng)會使已分泌的產(chǎn)物重新被細胞攝入，造成代謝能量的浪費，對細胞內(nèi)代謝途徑上的關鍵酶產(chǎn)生抑制，阻礙產(chǎn)物的進一步合成，并使氨基酸生產(chǎn)速率降低。迄今為止，已報道了在氨基酸發(fā)酵工業(yè)中，為提高氨基酸產(chǎn)量，使用與氨基酸轉(zhuǎn)運有關的基因，例如發(fā)生突變的大腸桿菌蘇氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)提高蘇氨酸產(chǎn)量以及發(fā)生突變的棒桿菌色氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可以提高色氨酸產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白名稱為GabP,其編碼基因命名為GabP,是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由415個氨基酸殘基組成。上述蛋白中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護的范圍。上述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子；
(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子。其編碼基因的讀碼框序列I由1248個核苷酸組成。上述基因中的嚴格條件具體可以為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。在本發(fā)明的實施例中，上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入pXMJ19載體的XbaI和EcoRI酶切位點間，得到表達上述蛋白的重組載體。擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組菌A。本發(fā)明提供的重組菌A，為抑制目的菌中上述蛋白的表達或活性得到的重組菌。上述重組菌A中的目的菌為原核細菌，所述原核細菌具體為谷氨酸棒桿菌；在本發(fā)明的實施例中具體為谷氨酸棒桿菌RES167。上述抑制目的菌中上述蛋白的表達或活性為沉默或缺失目的菌中上述蛋白的編碼基因?qū)е乱种粕鲜龅鞍椎谋磉_或活性。上述重組菌A中，所述抑制目的菌中上述蛋白的表達或活性通過同源重組實現(xiàn)。上述的同源重組的方法具體為將DNA分子導入目的菌；所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列3。在上述同源重組的方法中，將DNA分子導入目的菌為通過重組載體A導入目的菌；所述重組載體A為將所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位點間得到的載體,具體為將上述DNA分子插入pK18mobsacB的SphI和SmaI酶切位點間得到的載體。本發(fā)明的第三個目的是提供一種重組菌B。本發(fā)明提供的重組菌B，為將谷氨酸脫羧酶編碼基因?qū)肷鲜龅闹亟M菌A中得到的重組菌；其中，所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列具體為序列表中的序列5 ;所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。上述重組菌B中，所述谷氨酸脫羧酶編碼基因通過重組載體B導入上述的重組菌A中；所述重組載體B具體為將所述谷氨酸脫羧酶編碼基因插入表達載體pXMJ19中，得到表達谷氨酸脫羧酶的載體；在本發(fā)明的實施例中重組載體B為將序列表中序列4插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體。上述的重組菌B在制備Y-氨基丁酸中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備Y-氨基丁酸的方法。本發(fā)明提供了一種制備Y -氨基丁酸的方法，為將上述的重組菌B在含有L-谷氨酸的培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)化反應，收集上清液，得到Y(jié) -氨基丁酸。上述收集上清液采用離心方式。

上述轉(zhuǎn)化反應的條件為30°C反應I小時。上述含有L-谷氨酸的培養(yǎng)基為含有L-谷氨酸的麗II培養(yǎng)基；在上述方法中，在轉(zhuǎn)化反應前，還包括將重組菌B接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的第五個目的是提供一種DNA分子、含有所述DNA分子的重組載體A、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌或重組載體B。本發(fā)明提供的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列3。本發(fā)明提供的重組載體A具體為將所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位點間得到的載體；具體為將上述DNA分子插入pK18mobSaCB的SphI和SmaI酶切位點間得到的載體。本發(fā)明提供的重組載體B，為將谷氨酸脫羧酶編碼基因插入表達載體PXMJ19中，得到表達谷氨酸脫羧酶的載體，具體為將序列表中序列4插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體；所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列具體為序列表中的序列5 ;所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸酸序列具體為序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明在谷氨酸棒桿菌RES167 (C. glutamicum)中發(fā)現(xiàn)了一個新基因，其編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸的功能，將該基因缺失部分片段，則表達的蛋白不具有轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸的功能，說明該基因的確和轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸有關，該蛋白為轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸的蛋白。將谷氨酸棒桿菌RES167中的該蛋白編碼基因缺失后，再導入谷氨酸脫羧酶，得到重組菌，利用該重組菌可以生產(chǎn)Y -氨基丁酸。


圖I為C. glutamicum中GabP的蛋白結(jié)構(gòu)特征圖2為RES167 AGabP Y -氨基丁酸基因的凝膠電泳3為HPLC測定結(jié)果圖4為14C標記Y -氨基丁酸測定結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、GabP基因的克隆設計引物(464F和 464R),以谷氨酸棒桿菌 RES167 (C. glutamicum, Liebl W etal.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，65 (3) : 299-304，1989，公眾可從中國科學院微生物所獲得。該菌株為定向敲除了 cglM、cglIR和CglIIR基因的谷氨酸棒桿菌ATCC13032得到)的基因組為模板，進行PCR擴增。上游引物464F:5’ -GCCTCTAGAAAGGAGGACAACCATGACTACCGAATCAATAG-3，下游引物464R:5’ -CGCGAATTCAAGTGACTATGCCCAACC-3’得到1285bpPCR產(chǎn)物，連接到克隆載體pMD19-T simple (寶生物工程(大連)有限公司，TAKARA Code :D104)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落，提取質(zhì)粒送去測序，質(zhì)粒中含有的PCR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸，該PCR產(chǎn)物的基因命名為GabP，該基因的核苷酸序列為序列表中的序列I ;該基因編碼的蛋白命名為GabP，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;該質(zhì)粒為將包含序列表中的序列I的PCR產(chǎn)物插入pMD19-T simple中得到的載體，命名為T-GabP，將含有該載體的菌命名為DH5 a /T-GabP0·
序列表中序列I自5’端的第I到第1248位堿基，長度為1248bp，該基因ORF片段的讀碼框編碼415個氨基酸(序列2)。用TMHMM 服務器(http://genome. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)對該蛋白質(zhì)序列進行了跨膜區(qū)分析，結(jié)果如圖I所示，顯示該蛋白存在11個跨膜區(qū)，分別位于27-49位，59-81 位，100-122 位，129-151 位，163-185 位，193-215 位，239-261 位，277-299 位，319-341位，346-367位，386-408位氨基酸殘基處，具有典型的轉(zhuǎn)運蛋白特征。實施例2、GabP基因的應用I、基因敲除菌株RES167 AGabP的構(gòu)建設計引物(464Fk和 464Rk )上游引物464Fk:5， -ATAGCATGCTCGCAGCACTAGTGGATGA-3’下游引物464Rk:5’ -CTACCCGGGATGATGCCATCAAATGA-3'以谷氨酸棒桿菌RES167的基因組DNA為模板，464Fk和464Rk為引物，進行PCR擴增，得到1961bp的帶有GabP的DNA大片段(含有GabP基因完整的核苷酸序列和該基因上游和下游的各一部分序列)，將其連接到克隆載體PMD19-T simple，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取單菌落，進行菌落PCR檢測(引物為464Fk和464Rk)，得到1961bp的為陽性克隆，將其命名為DH5 a /T-GabPk，將該質(zhì)粒命名為T_GabPk。從DH5a/T-GabPk中提取質(zhì)粒T-GabPk，用內(nèi)切酶HincII酶切，回收大片段，自連，得到質(zhì)粒T- Δ GabP,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，得到轉(zhuǎn)化子DH5 a /T- Δ Gab。提取轉(zhuǎn)化子DH5 a /T- Δ Gab的質(zhì)粒T- Δ GabP,送去測序,結(jié)果該質(zhì)粒上攜帶序列表中的序列3所示的DNA分子，共1625bp，命名為AGabP DNA片段，該片段為將GabP基因中第340bp到675bp的核苷酸去除(即序列表中序列I的自5’末端的第340到675位去除)。也可人工合成序列3,與pMD19_T連接，也可得到質(zhì)粒T-Δ GabP。將上述質(zhì)粒T-AGabP用Sphl/Smal雙酶切后回收1806kb片段，與經(jīng)由同樣酶切的 pK18mobsacB(SchaferA et al. , Gene, 145 (I) : 69-73,1994,公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。)的大片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為將序列表中的序列3的DNA片段插入pK18mobsacB的Sphl/Smal酶切位點間得到的載體，命名為PGXKZ8質(zhì)粒，將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為DH5 a /PGXKZ8。將質(zhì)粒pGXKZ8電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌RES167中，轉(zhuǎn)化液涂布于含20 μ g/mL卡那霉素的LB平板，質(zhì)粒pGXKZS與谷氨酸棒桿菌RES167的染色體同源重組，得到重組子(具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子)。然后將具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子涂布在含有10%蔗糖的LB平板上，進行二次篩選。將得到的重組子分別點種到LB平板和含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上。
挑選不具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，以464F和464R為引物進行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，M泳道為Marker ;泳道I為出發(fā)菌株RES167的PCR產(chǎn)物，約為I. 3kb ；泳道2和3為轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物，得到PCR產(chǎn)物約為O. 9kb的轉(zhuǎn)化子為基因敲除菌株RES167 AGabP,進一步以PCR產(chǎn)物約為O. 9kb的轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，464Fk和464Rk為引物進行擴增，得到的I. 6kb PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果為序列3，進一步證明了泳道2和3得到的轉(zhuǎn)化子即為基因敲除菌株RES167AGabP。2、表達載體pGXKZ7的構(gòu)建將由實施例I得到的質(zhì)粒T-GabP，用Xbal/EcoRI雙酶切后回收I. 25kb片段，與經(jīng)由同樣酶切的 pXMJ19 (Jakoby M et al. , Biotechnology Techniques, 13 (6) :437-441,1999，公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。)的大片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入PXMJ19的Xbal/EcoRI酶切位點間，將該質(zhì)粒命名為pGXKZ7，將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為DH5 a /pGXKZ7。將pGXKZ7質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌基因敲除菌株RES167AGabP的感受態(tài)細胞，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測序，該質(zhì)粒為PGXKZ7,將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為 RES167AGabP/pGXKZ7。3、HPLC法測定轉(zhuǎn)運活力分別在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) RES167 Δ GabP、RES167 Δ GabP/pGXZ7、RES167 細胞，當細胞生長到指數(shù)期收集細胞，用含有0. IM葡萄糖和補加0. 2mg Γ1硫胺素的無其它氮源基礎培養(yǎng)基 MMI (Na2HPO4 · 12H20, 2. Og ；KH2PO4,0. 5g ；MgS04 · 7H20,0. 03g ;微量元素溶液 2mL ;生物素，50 μ g ;硫胺素，50μ g JjfpH至7. 5。微量元素溶液組成為=EDTA, 0. 500g ；ZnSO4 ·7Η20，0. 220g ；CaCl2, 0. 055g ；MnCl2 · 4Η20，0· 051g ；FeS04 · 7Η20，0· 0499g ； (NH4)6MO7O24 · 4H20,0. Ollg ；CuSO4 · 5H20，0. 0157g ；CoCl2 · 6H20，0. 0161g ;H20，1000ml ；pH6. 0。Konopka et al,1993)洗2次。收集的細胞懸浮在含有ImM Y -氨基丁酸的麗I培養(yǎng)基中(OD6tltl 3)。30 °C溫育，不同時間取樣，樣品立即用0. 45 μ m的一次性過濾器過濾，HPLC [Agi lent 1200 型 HPLC 儀，Agilent Zorbax Eclipse-AAA 色譜柱，4. 6x75mm, 3. 5 μ m,OPA法自動柱前衍生。流動相A :40mM磷酸二氫鈉pH 7. 8，B :乙腈甲醇/Κ 45 :45 10(v/v/v),流速2mL/min]分析濾液中殘余Y-氨基丁酸的濃度。結(jié)果如圖3 所示，RES167( ■ ) ,RES167 Δ GabP ( Δ )和 RES167 Λ GabP/pGXZ7 ( ▲)，可以看出，RES167 ( ■)濾液在 0min、60min、120min、180min、240min 時殘余 Y-氨基丁酸的濃度百分比分別為100%,83%,39%,0%,0% ；RES167 Δ GabP ( Λ )濾液在 0min、60min、120min、180min、240min 時殘余 Y-氨基丁酸的濃度分別為 100%,97%,97%,101%,104% ；RES167AGabP/pGXZ7( ▲)濾液在 0min、60min、UOmin、l80min、240min 時殘余Y-氨基丁酸的濃度分別為100%、53%、28%、、0%、0% ；上述結(jié)果表明，溫育出發(fā)菌株RES167的濾液中的Y _氨基丁酸含量迅速降低，溫育GabP部分基因缺失菌株RES167 AGabP的濾液中的Y -氨基丁酸含量沒有明顯變化，而溫育互補菌株RES167AGabP/pGXZ7的濾液中的Y _氨基丁酸含量也迅速降低；說明GabP具有轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸的能力，轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)。4、14C同位素標記法測定轉(zhuǎn)運活力RES167 Δ GabP、RES167 Δ GabP/pGXZ7、RES167 細胞的培養(yǎng)和收集與上述 3 相同。收·集后的細胞用O. IM Tris磷酸緩沖液(pH6. 5)洗2次，然后重懸于同一緩沖液中。反應體系(ImL) 100 μ mo I Tris 憐酸緩沖液(pH 6. 5), I μ mo I MgSO4 · 7H20,10 μ mo I 葡萄糖，100 μ g氯霉素，and O. ImL細胞懸液(相當于O. 2mg細胞干重)。當反應體系中加入Y-[4-14C]_氨基丁酸(美國放射性化學試劑公司，產(chǎn)品號ARC0693A)，反應開始。不同時間從反應體系中取出50 μ I反應液，真空抽濾，通過孔徑0.45 μ m的濾膜，隨即用預冷的2mL O. IM LiCl水溶液快速的洗兩次。然后將帶有細胞的濾膜放置到帶有約I. 8mL閃爍液的2. OmL離心管中。通過PerkinElmer MicroBeta液體閃爍計數(shù)器測定細胞的放射性。細胞的吸收活力為單位時間每毫克細胞干重吸收氨基酸的納摩爾數(shù)。結(jié)果如圖4 所示，RES167( ■ )、RES167AGabP( Δ )和 RES167AGabP/pGXKZ7 ( ▲)；RES167( ■)在 0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s 時氨基丁酸的單位轉(zhuǎn)運量(吸收量)分別為 O. Onmol (mg Dff) \5. 3nmol (mg Dff) \9. 8nmol (mg Dff) \ 12. 6nmol (mgDff) \ 15. Onmol (mg Dff) \ 16. 4nmol (mg Dff) \ 16. 2nmol (mg Dff) S細胞的吸收活力分別為 0. Onmol min 1 (mg Dff) \ 10. 6nmol min 1 (mg Dff) ^9. 8nmolmin 1 (mg Dff) \8. 3nmolmin 1 (mg Dff) \7. 5nmol min 1 (mg Dff) \6. 56nmol min 1 (mg Dff) \5. 4nmol min 1 (mg Dff) 1 ；RES167AGabP( Δ )在 0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s 時氨基丁酸的單位轉(zhuǎn)運量(吸收量)分別為 0. Onmol (mg Dff) >0. Onmol (mg Dff) >0. Onmol (mg Dff) >
0.Onmol (mg Dff)>0. Onmol (mg Dff)>0. Inmol (mg Dff)>0. Inmol (mg DW)—1;細胞的吸收活力分別為 0. Onmol min—1 (mg Dff)>0. Onmol min—1 (mg Dff)>0. Onmol min—1 (mg Dff)>0. Onmol mirT1 (mg DW)-1、0. Onmol mirT1 (mg Dff) >0. Onmol min-1 (mg Dff) >0. Onmolmirf1 (mg Dff) ；RES167AGabP/pGXZ7( ▲)在 0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s 時 Y -氨基丁酸的單位轉(zhuǎn)運量(吸收量)分別為 O. Onmol (mg Dff)> 10. 7nmol (mg Dff) 16. 2nmol (mg Dff) >17. 5nmol (mg Dff) \ 17. 2nmol (mg Dff) \ 17. 6nmol (mg Dff) \ 17. 8nmol (mg Dff) 1 ;細胞的吸收活力分別為 0. Onmol mirT1 (mg Dff)_1>21. 4nmol mirT1 (mg Dff)16. 2nmol mirT1 (mgDff) \ 11. 7nmol min 1 (mg Dff) \8. 6nmol min 1 (mg Dff) \7. Onmol min 1 (mg Dff) \5. 9nmolmirT1 (mg Dff)
以上結(jié)果表明，出發(fā)菌株C. glutamicum RES167具有較強的轉(zhuǎn)運Y -氨基丁酸的能力，GabP部分基因缺失菌株C. glutamicum RES167 Δ GabP喪失了轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸的能力，而互補菌株C. glutamicumRES167 AGabP/pGXZ7恢復了轉(zhuǎn)運Y -氨基丁酸的能力。實施例3、利用GabP基因敲除菌株制備Y -氨基丁酸I、重組菌株 RES167 Δ GabP/pGXKZ9 的構(gòu)建谷氨酸脫羧酶基因gadBl的核苷酸序列為序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸，其編碼的蛋白谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列為序列表中的序列5。上游引物1847F:
5’ -CGCAAGCTTAAAGGAGGACAACCATGGCTATGTTGTATGGA-3’下游引物1847R:5， -ACGGTCTAGAGCTACCGTAACCATTCACG-3’以短乳桿菌(Lactobacillusbrevis) CGMCC I. 2028 的基因組 DNA 為模板，1847F和1847R為引物，得到1516bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物具有序列4所示的核苷酸，為帶有gadBl的DNA片段。將其用HindIII/Xbal雙酶切PCR產(chǎn)物后回收大片段，與經(jīng)由同樣酶切的pXMJ19的大片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒。經(jīng)過測序，該質(zhì)粒為將序列表中序列4的PCR產(chǎn)物插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體，命名為PGXKZ9。將質(zhì)粒pGXKZ9分別電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌RES167和RES167 Δ GabP的感受態(tài)細胞，得到重組菌 RES167/pGXKZ9 和 RES167 Λ GabP/pGXKZ9 ;經(jīng)過提取質(zhì)粒并 Hindlll/Xbal酶切鑒定，得到I. 50kb和6. 58kb的片段均為陽性重組菌。2、菌株RES167AGabP/pGXKZ9產(chǎn)Y-氨基丁酸能力提高將上述鑒定陽性的重組菌RES167/pGXKZ9和RES167 Λ GabP/pGXKZ9分別在30mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，收集菌體(低溫離心機4°C，6000rpm，離心3min)，菌體(濕重
O.45g)接入到30mL含L-谷氨酸的MMII培養(yǎng)基中(每升含L-谷氨酸50g，葡萄糖4g，磷酸氫二鈉5g，磷酸二氫鈉Ig)轉(zhuǎn)化反應(30°C反應I小時)，收集轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，離心(低溫離心機4°C, 6000rpm,離心3min)收集上清液。對上述上清液用HPLC 檢測[Agilent 1200 型 HPLC 儀，Agilent ZorbaxEclipse-AAA色譜柱,4. 6x75mm, 3. 5 μ m, OPA法自動柱前衍生。流動相A :40mM磷酸二氫鈉pH7. 8, B :乙腈甲醇7jC 45 :45 10 (v/v/v),流速2mL/min] Y-氨基丁酸產(chǎn)量。標準品
Y_氨基丁酸(純度>98. 5%,生物質(zhì)公司，Bio Basic Inc,加拿大)。標準品的保留時間為7. 25min,實驗中收集的上清液保留時間為7. 25min，證明上清液中所含物質(zhì)為Y-氨基丁酸。結(jié)果如下重組菌RES167/PGXKZ9的產(chǎn)量為23. 6g/L，重組菌RES167 Δ GabP/PGXKZ9 的產(chǎn)量為 25. 6g/L。上述結(jié)果表明，未敲除GabP的重組菌RES167/pGXKZ9有轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸的能力，將胞外的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，因此胞外(上清液)中的Y-氨基丁酸含量低；而敲除GabP的重組菌RES167 Δ GabP/pGXKZ9缺失轉(zhuǎn)運Y -氨基丁酸的能力，不能將胞外的Y _氨基丁酸轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，因此胞外(上清液)中的Y-氨基丁酸含量較RES167/pGXKZ9高。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因； 所述基因具體是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子; (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸相關蛋白的DNA分子。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌； 或擴增權(quán)利要求2所述基因全長或其任意片段的引物對。
4.權(quán)利要求I所述蛋白、權(quán)利要求2所述基因或權(quán)利要求3所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在轉(zhuǎn)運Y-氨基丁酸中的應用。
5.一種重組菌A，為抑制目的菌中權(quán)利要求I所述蛋白的表達或活性得到的重組菌；所述目的菌具體為原核細菌，所述原核細菌進一步具體為谷氨酸棒桿菌；所述谷氨酸棒桿菌進一步具體為谷氨酸棒桿菌RES167。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌A，其特征在于 所述抑制目的菌中權(quán)利要求I所述蛋白的表達或活性通過同源重組實現(xiàn)； 所述同源重組的方法具體為將DNA分子導入目的菌；所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 所述DNA分子進一步具體通過重組載體A導入目的菌；所述重組載體A為將所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位點間得到的載體。
7.—種重組菌B，為將谷氨酸脫羧酶編碼基因?qū)霗?quán)利要求5或6所述的重組菌A中得到的重組菌； 所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列具體為序列表中的序列5 ； 所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌B，其特征在于所述谷氨酸脫羧酶編碼基因通過重組載體B導入權(quán)利要求5或6所述的重組菌A中；所述重組載體B具體為將所述谷氨酸脫羧酶編碼基因插入表達載體PXMJ19中，得到表達谷氨酸脫羧酶的載體。
9.權(quán)利要求7或8所述的重組菌B在制備Y-氨基丁酸中的應用； 或一種制備Y -氨基丁酸的方法，為將權(quán)利要求7或8所述的重組菌B在含有L-谷氨酸的培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)化反應，收集上清液，得到Y(jié) -氨基丁酸。
10.一種DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 或含有所述DNA分子的重組載體A、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌；所述重組載體A具體為將所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位點間得到的載體；或一種重組載體B，為將谷氨酸脫羧酶編碼基因插入表達載體PXMJ19中，得到表達谷氨酸脫羧酶的載體；所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列具體為序列表中的序列5 ;所述谷氨 酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸酸序列具體為序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供了一種蛋白，名稱為GabP，其編碼基因為GabP，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與轉(zhuǎn)運γ-氨基丁酸相關的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個新基因，該基因編碼的蛋白可以用來轉(zhuǎn)運γ-氨基丁酸。
文檔編號C12N1/15GK102838664SQ20121032425
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者丁久元, 趙 智, 劉雙江, 馬溫華 申請人:中國科學院微生物研究所