檢測(cè)腹地病毒的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)腹地病毒的實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)檢測(cè)試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腹地病毒（Hearstlands Virus)屬于布尼亞病毒科腹地病毒組成員，最近被分到 白蛉病毒屬中。該病毒于2012年在兩名密蘇里州的公民因?yàn)榘l(fā)燒和頭痛而住院就診時(shí)，這 種傳染病才被第一次記述。人和家畜可被攜帶有該病毒的蜱蟲叮咬而感染，出現(xiàn)中樞神經(jīng) 系統(tǒng)癥狀，不但造成人類疾病和死亡，更會(huì)造成家畜死亡，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失，引起公共衛(wèi)生問(wèn) 題。
[0003] 目前，腹地病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離，但因其操作繁瑣、技術(shù)難度大、耗時(shí)長(zhǎng)、 實(shí)驗(yàn)條件要求高、在實(shí)際工作中難以推廣應(yīng)用。近年來(lái)應(yīng)用廣泛的常規(guī)核酸擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒 光定量PCR在病毒的檢測(cè)方面發(fā)揮了重要作用。但是，鑒于蜱蟲樣本中病原載量較低等原 因，建立一種快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，更利于蜱中載量較低的病毒檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一組用于檢測(cè)腹地病毒的引物對(duì)和核 酸序列；本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)腹地病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒及其檢測(cè)方 法。本發(fā)明利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，建立一種快速、敏感的檢測(cè)方法，應(yīng)用于腹 地病毒的監(jiān)測(cè)檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] -種檢測(cè)腹地病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物對(duì)，所述引物對(duì)的核苷酸序列如 序列表中序列1和序列2所示。
[0007] -組檢測(cè)腹地病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR核酸，該組核酸包括引物對(duì)、探針和作 為陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中序列1和序列表中序列2所 示，所述探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述作為陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物包含有 如序列表中序列4所示的核苷酸序列。
[0008] -種檢測(cè)腹地病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒，該試劑盒主要包括該試劑盒 包括：2XRT-PCR反應(yīng)液、25XRT-PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探針、陰性對(duì)照和陽(yáng) 性對(duì)照；具體組成如下：
[0009] 2 X RT-PCR 反應(yīng)液（2 X RT-PCR buffer);
[0010] 25 X RT-PCR 酶混合液（25 X RT-PCR Enzyme Mix);
[0011] 上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0012] 下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0013] 探針：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探針的5 '端連接熒光基團(tuán)，3 ' 端連接淬滅基團(tuán)；
[0014] 陰性對(duì)照：無(wú)核酸酶滅菌超純水；
[0015] 陽(yáng)性對(duì)照：包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。
[0016] 如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、CY3中任意一種，所述淬滅基團(tuán) 為BHQl、TAMARA和BHQ2中任意一種。
[0017] -種利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)腹地病毒的非診斷性方法， 該方法包括以下步驟：
[0018] (1)從樣品中提取病毒RNA ;
[0019] (2)對(duì)提取的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，其中，反應(yīng)體系按如下配制： I X RT-PCR 反應(yīng)液（I X RT-PCR Buffer)，I X RT-PCR 酶混合液（I X RT-PCR Enzyme Mix)， 上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所 示；探針：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探針5 '端連接熒光基團(tuán)，3 '端連接淬 滅基團(tuán)；上下游引物和探針濃度為〇. 01~1 μΜ，樣品RNA ;同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶滅菌超純水 為陰性對(duì)照；
[0020] 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)程序：
[0022] (3)收集熒光信號(hào)，選擇上述熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán) 的熒光信號(hào)，以閾值線超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；
[0023] (4)結(jié)果判定：待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判 斷為陽(yáng)性，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明建立了比較高效、靈敏的腹地病毒的快速檢測(cè)方法，提供實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒。提供的檢測(cè)試劑盒使用方便，操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，有效替代傳統(tǒng)病毒分 離來(lái)獲得檢測(cè)結(jié)果，且試劑盒所用的試劑少，大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，并減少了在操作過(guò)程的 污染，檢測(cè)效果好，特異性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒最低檢出限為14. 9Χ 10 1Vg/ μ L0
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為腹地病毒普通PCR檢測(cè)的電泳圖。
[0027] 圖2為本發(fā)明熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)腹地病毒的擴(kuò)增曲線。
[0028] 圖3為腹地病毒熒光定量PCR特異性擴(kuò)增曲線。
[0029] 圖4為本發(fā)明熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)腹地病毒的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030] 圖5為利用本發(fā)明試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的 實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無(wú)特殊說(shuō) 明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0032] 實(shí)施例1 :普通PCR檢測(cè)腹地病毒
[0033] 在本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)中，篩選腹地病毒S基因片段的保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡 聚核苷酸序列（引物）和探針，利用引物可特異地?cái)U(kuò)增腹地病毒的S基因片段，引物擴(kuò)增片 段大小為113bp，核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0034] 序列 4 :
[0035] GTGAGAGCAAATACAATGATGTACTTCACATCATTCCTCCAGTTCTCACCCCCCCTCTCACGAAGCAGC CCAAAGATCACAGCAGGATCCAGGCCCTCATAAGCTATCTCCT。
[0036] 設(shè)計(jì)的引物和探針如下：
[0037] HRTV-F (序列表中序列 1) :5，-GTGAGAGCAAATACAATGA-3，
[0038] HRTV-R(序列表中序列 2) :5，-AGGAGATAGCTTATGAGG-3，
[0039] HRTV-FAM(序列表中序列 3) :5' -TCACATCATTCCTCCAGTTCTCACC-3'
[0040] 應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物對(duì)腹地病毒進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，采用25 μ L反應(yīng)體系： HRTV-F、HRTV-R 引物終濃度各為 0. 4Χ 103nmol/L ;Mg2+終濃度 2mmol/L ;dNTP 終濃度為 0.8 X IO6 μ mol/L;l X RT-PCR 反應(yīng)液（IX RT-PCR Buffer) ;Taq 聚合酶用量 1 單位（unit)， 模板2 yL。
[0041 ] PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：
[0042] 95°C預(yù)變性3分鐘，接著進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)：95°C變性30秒，49°C退火30秒，72°C延伸 30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；
[0043] 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳：陰性對(duì)照為滅菌生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照為攜帶有如序列表序 列4所示序列的質(zhì)粒DNA，起始濃度為14. 9X10 3ng/μ L，并按10倍比進(jìn)行梯度稀釋。結(jié)果 如圖1所示，可以看到所設(shè)計(jì)的引物可有效擴(kuò)增腹地病毒。
[0044] 實(shí)施例2 :腹地病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的制備
[0045] 腹地病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒包括以下成分：
[0046] 2 X RT-PCR 反應(yīng)液（2 X RT-PCR Buf fer);
[0047] 25 X RT-PCR 酶混合液（25XRT-PCR Enzyme Mix);
[0048] 上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0049] 下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0050] 探針：核苷酸序列如序列表中序列3所示；
[0051] 陰性對(duì)照：無(wú)核酸酶滅菌超純水；
[0052] 陽(yáng)性對(duì)照：攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中 序列4所示。
[0053] 其中，所述2XRT-PCR反應(yīng)液和25XRT-PCR酶混合液可選用ABI公司 AgPath-IDTM One-stepRT-PCR Kit;引物、探針、質(zhì)粒委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合 成，探針在合成時(shí)探針5 '端連接FAM熒光基團(tuán)和3 '端連接BHQl淬滅基團(tuán)。
[0054] 實(shí)施例3 :腹地病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的方法
[0055] 本發(fā)明檢測(cè)腹地病毒方法包括以下步驟：
[0056] (1)病毒RNA提取
[0057] 病毒RNA提取可選用QIAamp Viral RNA提取試劑盒進(jìn)行提取。
[0058] (? RT-PCR 擴(kuò)增
[0059] 采用實(shí)施例2制備的試劑盒配置反應(yīng)體系，其組分及其體積見表1。
[0060] 表1反應(yīng)體系
[0065] (3)收集熒光信號(hào)，選擇FAM的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán)的熒光信 號(hào)，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；
[0066] (4)結(jié)果判定：待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判 斷為陽(yáng)性，即樣品中含有腹地病毒核酸，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。<