專利名稱：一種陽離子聚合物基因載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種新型陽離子聚合物基因載體的合成。
背景技術(shù)：
基因治療是ー種將外源基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)，從而達(dá)到治病目的的治療方法。裸露的外源基因DNA帶負(fù)電，難以滲入同樣帶負(fù)電的細(xì)胞膜且容易被機體或細(xì)胞降解，因而難以表達(dá)。所以基因治療的關(guān)鍵是選擇合適的基因載體及基因?qū)敕椒ǎ鼓康幕蚰軌蛟诎屑?xì)胞中獲得安全、高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)?；蜉d體主要有病毒載體和非病毒載體兩類。I.病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但也有能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)、潛在的致瘤性、裝載容量有限、代價高等缺點，限制了它們的應(yīng)用。2.非病毒載體是目前公認(rèn)可替代病毒載體的基因載體系統(tǒng)，它可避免諸如免疫原性、毒性等病毒載體的缺陷。具有低毒、低免疫反應(yīng)，外源基因隨機整合率低且攜帶基因大小類型不受限制等優(yōu)點。雖然非病毒載體安全性好，但存在轉(zhuǎn)染、整合效率低等缺點。因此，如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因藥物載體，如何提高非病毒性基因載體的靶向特異性和體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，已經(jīng)是迫在眉睫的關(guān)鍵問題。陽離子聚合物載體是ー種非病毒性基因載體。它是利用帶正電的高聚物靜電結(jié)合濃縮DNA，再通過靜電作用結(jié)合細(xì)胞膜或通過攜帶的靶向配體與細(xì)胞膜上的帶負(fù)電荷的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞、逃離內(nèi)體和胞質(zhì)轉(zhuǎn)運的方式，使DNA進(jìn)入細(xì)胞核，從而表達(dá)目的基因。聚甲基丙烯酸N, N- ニ 甲氨基こ酯(Poly (2_ (dimethylamino) ethylmethacrylate), PDMAEMA)是ー種具有溫度和pH敏感性的高分子，在中性或酸性條件下具有很好地結(jié)合DNA的能力。PDMAEMA分子結(jié)構(gòu)中同時具有親水性的叔胺基、羰基和疏水性的烷基基團，且兩類基團在空間結(jié)構(gòu)上互相匹配，當(dāng)環(huán)境改變時會造成氫鍵的形成與破壞，從而導(dǎo)致高分子相態(tài)的變化。類似于聚こ烯亞胺(PEI)，PDMAEMA在生物體內(nèi)不可降解，高相對分子質(zhì)量(通常>3萬)的PDMAEMA已無法通過腎臟排出，在使用高相對分子質(zhì)量PDMAEMA作為載體時，會不可避免在體內(nèi)殘留。借鑒改性PEI的方法，低相對分子質(zhì)量的PDMAEMA可通過體內(nèi)可斷裂的化學(xué)鍵連接起來形成高相對分子質(zhì)量的PDMAEMA衍生物。聚こ烯批咯燒酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)是ー種水溶性酰胺類高分子聚合物，PVP具有很多優(yōu)良的特性，如優(yōu)良的溶解性、增溶性、成膜性、絡(luò)合性、黏接性及一定的表面活性，特別是具有良好的生理相容性，因而使其在醫(yī)藥領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。PVP優(yōu)良的生理惰性，不參與人體新陳代謝.又具有優(yōu)良的生物相容性，對皮膚、粘膜、眼等不形成任何刺激。PVP尤其指PVP水凝膠和PVP與其他聚合物共混或共聚的水凝膠，由于其良好的生理相容性，在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，說明了它具有作為基因載體輔料的潛在能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于降低現(xiàn)有的聚甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯的細(xì)胞毒性，提供ー種轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小的陽離子聚合物基因載體。本發(fā)明的第二個目的是提供一種陽離子聚合物基因載體的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種陽離子聚合物基因載體，是由主鏈聚こ烯吡咯烷酮和支鏈聚甲基丙烯酸N, N- ニ甲氨基こ酯接枝而成，所述接枝的聚合物含有8. 8%-40%的接枝度。所述聚こ烯吡咯烷酮的相對分子量為1000(Γ6000 0。所述每條支鏈聚甲基丙烯酸N，N ニ甲氨基こ酯的分子量為100(Γ4000。陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟(I)按質(zhì)量比1:5 20將聚こ烯吡咯烷酮溶于雙蒸水中，攪拌I 2h溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:2 3加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按N-溴代琥珀亞酰胺與聚こ烯吡咯烷酮質(zhì)量比為I. 6 3:1的比例加入N-溴代琥珀亞酰胺，再按聚こ烯吡咯烷酮與偶氮ニ異丁腈質(zhì)量比為1:0. 014 O. 03加入偶氮ニ異丁腈，于85-95°C回流反應(yīng)20 60h ;除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量3500^10000的透析袋透析2 5天；產(chǎn)物冷凍干燥后得到大分子引發(fā)劑溴化聚こ烯吡咯烷酮，所述溴化聚こ烯吡咯烷酮用PVP-Br表示；(2)按質(zhì)量比為1:5 20的比例將PVP-Br溶于雙蒸水中，按所述PVP-Br與Iユ' -聯(lián)吡啶的質(zhì)量比為1:0. 08 O. 125的比例，加入2ブ-聯(lián)吡啶；通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；依次加入CuBr和甲基丙烯酸N，N- ニ甲氨基こ酷，所述PVP-Br、CuBr和甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯的質(zhì)量比1:0. 03 O. I: I. 5 14，通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；于58 62°C反應(yīng)10 15h ;用截止分子量3500 10000的透析袋在純水中透析2 14天；透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到含有8. 8%-40%的接枝度的陽離子聚合物基因載體。所述聚こ烯吡咯烷酮的相對分子量為1000(Γ60000。本發(fā)明的優(yōu)點(I)本發(fā)明的陽離子聚合物基因載體具有很好的結(jié)合DNA的能力。(2)本發(fā)明的陽離子聚合物基因載體生物相容性好，對人體無刺激毒性低；(3)本發(fā)明方法生產(chǎn)的陽離子聚合物基因載體分子量分布小，反應(yīng)可控，幾乎不生成PDMAEMA均聚物，產(chǎn)物易純化；(4)用本發(fā)明的陽離子聚合物基因載體運載質(zhì)粒DNA，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高，超過了PDMAEMA均聚物的轉(zhuǎn)染效率。


圖I 為 PVP、PVP-Br 和 PVP_g_PDMAEMA 的 HlNMR 的核磁譜圖，其中PVP (A)、PVP-Br (B)、PVP-g-PDMAEMA (C)。圖2 為 PVP、PVP-Br 和 PVP-g-PDMAEMA 的紅外譜圖，其中PVP (A)、PVP-Br (B)、PVP-g-PDMAEMA (C)。圖3為PVP-g-PDMAEMA/pDNA復(fù)合物的凝膠電泳照片，其中PVP-g-PDMAEMA-I/pDNA (al)、PVP-g-PDMAEMA-2/pDNA (a2)。圖4為PVP-g-PDMAEMA/pDNA復(fù)合物的粒徑和zeta電位圖，其中
PVP-g-PDMAEMA-1/pDNA( 表示粒徑)(▲表示 zeta 電位)、PVP-g-PDMAEMA_2/pDNA(■表示粒徑)(▼表示zeta電位)。圖5為PVP-g-PDMAEMA復(fù)合DNA納米粒的透射電鏡圖。圖6為不同N/P的PVP-g-PDMAEMA復(fù)合DNA納米粒影響下的細(xì)胞活性。圖7為不同N/P的PVP-g-PDMA EMA復(fù)合DNA納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的說明。實施例I陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟(I)將1.99g PVP加入到IOOmL的三ロ瓶中，加入20mL雙蒸水，攪拌Ih溶解形成水凝膠，再加入四氯化碳50mL，攪拌使PVP水溶膠充分分散在四氯化碳中；繼續(xù)依次加入3. 20g純化的NBS和0.042g AIBN ;油浴升溫至90° C回流反應(yīng)30h，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸掉有機相即四氯化碳，將剩余水相在截止分子量8500的透析袋中透析2天；每4h換一次水，透析結(jié)束后產(chǎn)物冷凍干燥48h，制得大分子引發(fā)劑溴化聚こ烯吡咯烷酮，所述溴化聚こ烯吡咯烷酮用PVP-Br表示；通過GPC測試Mn為58000左右，PDI=L 27 ;通過核磁和紅外表征產(chǎn)物，計算溴化度為8. 8% ；(2)取PVP-Br O. 2g，加入至反應(yīng)管中，用2mL雙蒸水完全溶解，加入16. 4mg2,2'-聯(lián)吡啶；重復(fù)三次液氮冷凍-抽真空-融化-通氮氣的操作完全除去體系中的氧；再依次加入CuBr 7. 85mg和DMAEMAO. 44g ;再重復(fù)三次液氮冷凍ー抽真空ー融化-通氮氣的操作完全除去體系中的氧；置于60°C水浴反應(yīng)12h ;用截止分子量8500的透析袋在純水中透析2天，每4h換一次水；透析結(jié)束后離心，取上層清液冷凍干燥48h，得到PVP-g-PDMAEMA ο通過核磁和紅外表征產(chǎn)物(見圖I和圖2)，通過GPC計算接枝度8. 8%和支鏈PDMAEMA的聚合度為15，支鏈平均分子量為2000。實施例2陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟(I)按質(zhì)量比1:8將聚こ烯吡咯烷酮(相對分子量為10000)溶于雙蒸水中，攪拌Ih溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:2加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按NBS與PVP質(zhì)量比為1.6:1的比例加入NBS，再按PVP與AIBN質(zhì)量比為1:0. 02加入AIBN，于85°C回流反應(yīng)60h ;旋蒸除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量3500的透析袋中透析2天；產(chǎn)物冷凍干燥后得到大分子引發(fā)劑PVP-Br ；(2)按質(zhì)量比為1:5的比例將PVP-Br溶于雙蒸水中，按所述PVP-Br與2,2'-聯(lián)吡啶的質(zhì)量比為1:0.08的比例，加入2，2'-聯(lián)吡啶；通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；依次加入Cufc和DMAEMA，所述PVP-Br、Cufc和DMAEMA的質(zhì)量比1:0. 03:1. 1，通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；于58°C水浴反應(yīng)15h ;用截止分子量3500的透析袋在純水中透析2天；透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到含有10%的接枝度的陽離子聚合物基因載體，支鏈PDMAEMA的聚合度為8，支鏈平均分子量為1000。實施例3陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟
(I)按質(zhì)量比1:5將聚こ烯吡咯烷酮(相對分子量為30000)溶于雙蒸水中，攪拌2h溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:3加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按NBS與PVP質(zhì)量比為1.8:1的比例加入NBS，再按PVP與AIBN質(zhì)量比為1:0. 014加入AIBN，于95°C回流反應(yīng)20h ;減壓蒸餾除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量10000的透析袋中透析5天；產(chǎn)物冷凍干燥后得到大分子引發(fā)劑PVP-Br ；(2)按質(zhì)量比為1:20的比例將PVP -Br溶于雙蒸水中，按所述PVP-Br與2，2'-聯(lián)吡啶的質(zhì)量比為1:0. 125的比例，加入2，2'-聯(lián)吡啶；通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；依次加入Cufc和DMAEMA，所述PVP_Br、CuBr和DMAEMA的質(zhì)量比I: O. 1: 4，通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；于62°C水浴反應(yīng)IOh ;用截止分子量10000的透析袋在純水中透析5天；透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到含有20%的接枝度的陽離子聚合物基因載體，支鏈PDMAEMA的聚合度為14，支鏈平均分子量為1900。實施例4陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟(I)按質(zhì)量比1:20將聚こ烯吡咯烷酮(相對分子量為10000)溶于雙蒸水中，攪拌1.5h溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:2. 5加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按NBS與PVP質(zhì)量比為3:1的比例加入NBS，再按PVP與AIBN質(zhì)量比為1:0. 03加入AIBN，于90°C回流反應(yīng)40h ;旋蒸除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量3500的透析袋中透析3天；產(chǎn)物冷凍干燥后得到大分子引發(fā)劑PVP-Br ；(2)按質(zhì)量比為1:12的比例將PVP-Br溶于雙蒸水中，按所述PVP-Br-ZJi -聯(lián)吡啶的質(zhì)量比為1:0.09的比例，加入2，2'-聯(lián)吡啶；通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；依次加入Cufc和DMAEMA，所述PVP_Br、CuBr和DMAEMA的質(zhì)量比I: O. 05:10，通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；于59°C水浴反應(yīng)13h ;用截止分子量8500的透析袋在純水中透析3天；透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到含有40%的接枝度的陽離子聚合物基因載體，支鏈PDMAEMA的聚合度為17，支鏈平均分子量為2400實施例5陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟(I)按質(zhì)量比1:12將聚こ烯吡咯烷酮(相對分子量為60000)溶于雙蒸水中，攪拌I. 2h溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:2加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按NBS與PVP質(zhì)量比為2:1的比例加入NBS，再按PVP與AIBN質(zhì)量比為1:0. 02加入AIBN，于92°C回流反應(yīng)30h ;旋蒸除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量6500的透析袋中透析4天；產(chǎn)物冷凍干燥后得到大分子引發(fā)劑PVP-Br ；(2)按質(zhì)量比為1:8的比例將PVP-Br溶于雙蒸水中，按所述PVP-Br與2，2'-聯(lián)吡啶的質(zhì)量比為1:0. I的比例，加入2，2'-聯(lián)吡啶；通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；依次加入Cufc和DMAEMA，所述PVP_Br、CuBr和DMAEMA的質(zhì)量比1:0· 08:8，通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；于61°C水浴反應(yīng)12h ;用截止分子量6500的透析袋在純水中透析14天；透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到含有20%的接枝度的陽離子聚合物基因載體，支鏈PDMAEMA的聚合度為27，支鏈平均分子量為4000。表I 5個實施例中PVP-g-PDMAEMA的接枝度和支鏈長度
權(quán)利要求
1.一種陽離子聚合物基因載體，其特征是由主鏈聚こ烯吡咯烷酮和支鏈聚甲基丙烯酸N, N-甲氨基こ酯接枝而成，所述接枝的聚合物接枝度為8. 8%-40%。
2.如權(quán)利要求I所述的陽離子聚合物基因載體，其特征是所述聚こ烯吡咯烷酮的相對分子量為10000 60000。
3.如權(quán)利要求I所述的陽離子聚合物基因載體，其特征是所述每條支鏈聚甲基丙烯酸N，N ニ甲氨基こ酯的分子量為100(Γ4000。
4.權(quán)利要求I所述的陽離子聚合物基因載體的制備方法，其特征包括以下步驟 (1)按質(zhì)量比1:5 20將聚こ烯吡咯烷酮溶于雙蒸水中，攪拌I 2h溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:2 3加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按N-溴代琥珀亞酰胺與聚こ烯吡咯烷酮質(zhì)量比為I. 6 3:1的比例加入N-溴代琥珀亞酰胺，再按聚こ烯吡咯烷酮與偶氮ニ異丁腈質(zhì)量比為1:0. 014 O. 03加入偶氮ニ異丁腈，于85-95°C回流反應(yīng)20 60h ;除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量350(Tl0000的透析袋透析2 5天；產(chǎn)物冷凍干燥后得到大分子引發(fā)劑溴化聚こ烯吡咯烷酮，所述溴化聚こ烯吡咯烷酮用PVP-Br表示； (2)按質(zhì)量比為1:5 20的比例將PVP-Br溶于雙蒸水中，按所述PVP-Br-ZJi-聯(lián)吡啶的質(zhì)量比為1:0. 08 O. 125的比例，加入Iユ' -聯(lián)吡啶；通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；依次加入CuBr和甲基丙烯酸N，N- ニ甲氨基こ酯，所述PVP-Br、CuBr和甲基丙烯酸N, N-甲氨基こ酯的質(zhì)量比1:0. 03 O. 1:1. 5 14，通過抽真空通氮氣完全除去體系中的氧；于58 62°C反應(yīng)10 15h ;用截止分子量3500 10000的透析袋在純水中透析2 14天；透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到含有8. 8%-40%的接枝度的陽離子聚合物基因載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的陽離子聚合物基因載體的制備方法，其特征是所述聚こ烯吡咯烷酮的相對分子量為1000(Γ60000。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種陽離子聚合物基因載體及制備方法，陽離子聚合物基因載體是由主鏈聚乙烯吡咯烷酮和支鏈聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯接枝而成，所述接枝的聚合物接枝度為8.8%-40%。本發(fā)明的陽離子聚合物基因載體具有很好的結(jié)合DNA的能力；生物相容性好，對人體無刺激毒性低；分子量分布小，反應(yīng)可控，幾乎不生成PDMAEMA均聚物，產(chǎn)物易純化；運載質(zhì)粒DNA，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高，超過了PDMAEMA均聚物的轉(zhuǎn)染效率。
文檔編號C12N15/87GK102690843SQ20121016394
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者張彪, 王重夕, 董岸杰, 鄧聯(lián)東, 邢金峰 申請人:天津大學(xué)