專利名稱：稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP及其方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是對水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的病害之一,姆年都造成嚴(yán)重的糧食損失。從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的觀點(diǎn)來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。傳統(tǒng)的水稻抗性育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者必須具備豐富的接種、調(diào)查經(jīng)驗(yàn)，而且還容易受到環(huán)境以及人為因素的影響，鑒定結(jié)果容易造成誤差，目標(biāo)基因的選擇效率往往較低。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生以及利用，其 方便、直接、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)使得該技術(shù)的應(yīng)用價值及前景越來越受到關(guān)注。在育種方面，通過開發(fā)與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，特別是在基因內(nèi)部開發(fā)其功能特異性的分子標(biāo)記來對目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，不僅選擇可靠性高，而且還大大加快了育種步伐。水稻稻瘟病抗病基因Pia被定位于第11染色體短臂端(Zeng et al. 2011.Characterization ana fine mapping of the rice blast resistance gene Pia.Science China Life Sciences 54:372-378)上，并已成功地被克隆(Okuyama et al. 2011.A multifaceted genomics approach allows the isolationoi the rice Pia—blastresistance gene consisting of two adjacent NBS-LRR protein genes. Plant Journal66:467-479)o研究表明，Pia基因的稻瘟病抗性須由2個相鄰的NBS-LRR類型的抗病基因共同介導(dǎo)。同時，在水稻群體中，包含該基因的基因組區(qū)域存在著基因型的分化，即當(dāng)相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時存在時，該基因型定義為A型；當(dāng)相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時不存在時，該基因型定義為N型(基因型與感病水稻參考品種日本睛的相同)。Pia所具有的獨(dú)特抗譜(Zeng et al. 2011. Characterization and fine mappingof the rice blast resistance gene Pia. science China Lne Sciences 54:^72-378),使之可以廣泛地應(yīng)用于稻瘟病抗性育種計劃中。因此，為了加快Pia在抗病育種工作中的應(yīng)用，如在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、抗性基因Pia與其他功能基因的聚合育種、以及轉(zhuǎn)基因育種等，開發(fā)出準(zhǔn)確有效的Pia功能特異性分子標(biāo)記顯得尤其重要。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的是提供一種稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP。本發(fā)明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的檢測方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP，它由Pia-IFNP和Pia-2FNP組合而成，分別由引物對SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2，以及SEQ IDN0:3和SEQID N0:4從水稻總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列，前者直接電泳檢測，后者則經(jīng)特異性酶切之后電泳檢測，與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的分子標(biāo)記；所述引物對的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I (5’ _3，)CTTTTGAGCTTGATTGGTCTGC ；SEQ ID NO. 2 (5’ _3，)CTATTGCACCAGAGGGACCAG ；
SEQ ID NO. 3 (5，_3，)GCGCCGCCACAAGGTTG ；SEQ ID NO. 4 (5，_3，)CGTCACCAAGCTGGTACCTCTAG ；所述的水稻品種為Aichi Asahi ；所述稻瘟病抗性基因Pia包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pia-Ι和Pia_2 ；所述的特異性酶切指的是Xba I酶切；所述的稻瘟病抗性基因Pia的功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的檢測方法，通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pia的等位基因序列與Pia-I及Pia-2序列做比對的方法，分析得到能區(qū)別于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-I功能特異性的I處序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-tagged site, STS),以及Pia_2功能特異性的I處單堿基差異(singlenucleotide polymorphism, SNP);再通過引物設(shè)計分別得到 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2,以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4引物，分別對水稻基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增、酶切，分別得到Pia功能特異性分子標(biāo)記Pia-IFNP和Pia_2FNP，二者組合為Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP0優(yōu)選的，所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的檢測方法，包括以下步驟(I)通過常規(guī)PCR法擴(kuò)增，獲得多個A型及N型水稻品種的Pia等位基因的編碼區(qū)DNA序列；(2)利用多序列比對軟件エ具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，將步驟(I)所獲得的序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后進(jìn)行比對，得到Pia-I抗性基因所特異的STS，該STS位于Pia-I之C末端區(qū)域；Pia_2抗性基因所特異的SNP，該SNP位于Pia-2之CC區(qū)域，最終導(dǎo)致功能特異性氨基酸的改變；(3)根據(jù)步驟(2)所得到的I處STS及SNP，分別設(shè)計出引物對SEQ IDN0. I和SEQID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;并用這2組引物分別對不同水稻的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物A和擴(kuò)增產(chǎn)物B ;前者直接電泳檢測，后者則經(jīng)特異性酶切之后電泳檢測，然后比較驗(yàn)證，分別獲得與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段 Pia-IFNP 和 Pia_2FNP ；(4)對步驟(3)所獲得的分子標(biāo)記分別在不同水稻品種中進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定Pia抗性基因的功能特異性的分子標(biāo)記PiaFNP (由Pia-IFNP和Pia_2FNP組合而成)。更優(yōu)選的，
步驟(I)所述的水稻品種為Aichi Asahi和Fukunishiki,以及2個水稻亞種的參考品種Nipponbare和93-11 (全基因組已經(jīng)測序并公開于http: IIwm. ncbi. nlm. nih.gov) ο步驟(2)中所述的序列比對優(yōu)選為將核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后進(jìn)行比對；步驟(3)中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物A的大小為116bp，即水稻品種為A型；所述的擴(kuò)增產(chǎn)物A的大小為125bp，即水稻品種為N型；步驟(3)中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物B酶切后的大小為142bp，即水稻品種為N型；所述的擴(kuò)增產(chǎn)物B酶切后為123bp，即水稻品種為A型；
步驟(3)中在Pia-I的STS上下游60 IOObp處分別設(shè)計引物SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，在Pia-2的SNP處設(shè)計帶有錯配堿基的功能特異性下游引物SEQ ID NO. 4，而在其上游100 200bp處設(shè)計功能特異性上游引物SEQ IDN0. 3 ；步驟(3)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中Pia-IFNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下
IOxPCR 緩沖液2.0 μ
dNTPs (2.5 mM each)1.6 μ I SEQ ID NO. I (10 μΜ)0.5 μ I SEQ 1DN0.2 (10 μΜ )0.5 μ
TaqmA 聚合酶(5υ/μ1)0.1 μ
DNA 模板(50 ng/μ )1.0 μ
無菌雙蒸水補(bǔ)至20.0 μ Pia-IFNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溫度循環(huán)條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、65°C 30秒、720C 30秒，30個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取適量樣品在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測，電泳條件為90V，3小時。擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物分別為116bp和125bp，前者即為抗性基因Pia-I的功能特異性分子標(biāo)記Pia-IFNP。步驟(3)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中Pia_2FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下IOxPCR 緩沖液2_0μΙ dNTPs (2.5 mM each)1.6 μ SEQ IDN0.3 ( 10 μΜ)0.5 μ SEQ ID Ν0.4 (ΙΟμΜ)0.5 μ
TaqDNA 聚合酶(5 /μ1)0.1 μ
DNA 模板(50 ng/μ )I .O μ I
無菌雙蒸水補(bǔ)至20.0 μ Pia-2FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溫度循環(huán)條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、53°C 30秒、720C 30秒，35個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用限制性內(nèi)切酶Xba I對所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，反應(yīng)體
系如下
無菌雙蒸水5.3 μ
IOxbufferMI 2 ui
PCR 產(chǎn)物5.0 μ
Xha I0.5 μ 在37で條件下酶切3小時后，取適量酶切樣品在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測，電泳條件為90V，3小吋。擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物為142bp，能夠被酶切的(酶切后為123bp)即為抗性基因Pia-2的功能特異性分子標(biāo)記Pia_2FNP。 所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的應(yīng)用，包括在水稻種質(zhì)資源中快速、直接地鑒定該抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明的Pia功能特異性選擇標(biāo)記以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，不僅能區(qū)分水稻品種的基因型，而且能夠方便、快捷、直接地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因Pia在水稻種質(zhì)資源中以及育種后代中的鑒定，特別是等位基因之間的鑒別，且不受環(huán)境以及人為因素的影響。因此，能夠得到廣泛的應(yīng)用，對降低勞動成本，提高育種工作效率起到重要的作用。


圖I是具有功能特異性STS的水稻稻瘟病抗性基因Pia的組成基因之一 Pia-I與I個Pia等位基因及2個感病等位基因的氨基酸序列比對圖；黑色方框表示由Pia-IFNP造成的功能特異性的序列標(biāo)簽位點(diǎn)。
圖2是具有功能特異性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pia的組成基因之一 Pia_2與I個Pia等位基因及2個感病等位基因的氨基酸序列比對圖；黑色方框表示由Pia-2FNP造成的功能特異性氨基酸的改變。圖3是驗(yàn)證圖，其中圖A是Pia功能特異性分子標(biāo)記Pia-IFNP在8個水稻品種中的驗(yàn)證；圖B是Pia功能特異性分子標(biāo)記Pia_2FNP在8個水稻品種中的驗(yàn)證；其中，泳道I為抗性基因供體品種Aichi Asahi (Pia);泳道2為抗病品種 ClOlLAC(Pia);泳道3為抗病品種C101A51 (Pia);泳道4為抗病品種C101PKT (Pia);泳道5為感病品種Nipponbare ;泳道6為感病品種Shin 2 ;泳道7為抗病品種BL I (Pib);泳道8為抗病品種 Fukunishiki (Pib);泳道 DL2000 為 DNAladder。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)ー步的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I :Pia等位基因編碼區(qū)序列的比對及STS和SNP的鑒定通過常規(guī)的PCR擴(kuò)增(Yuan et al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely 丄inked CC-NBS-LRR genes. TheorAppl Genet 122:1017-1028)、測序(上海英駿生物技術(shù)有限公司，廣州分公司)，從2個水稻品種Aichi Asahi和Fukunishiki(Zeng et al. 2011. Characterization and fine mappingof the rice blast resistance gene Pia. Science China 54:372-378)中獲得相應(yīng)的Pia等位基因編碼區(qū) DNA 序列[Pia_l (AB604622)，Pia-2 (AB604627)，已經(jīng)公開于 http://www.ncbi. nlm. nih. gov]，以及2個水稻亞種的參考品種Nipponbare和93-11的Pia等位基因編碼區(qū) DNA 序列(直接從 http://www. ncbi. nlm. nih. gov 獲得)。利用多序列比對軟件工具(http://multalin.toulouse. inra. fr/multalin/)，通過對這些序列翻譯后的蛋白質(zhì)序列(Pia-Ι來自Aichi Asahi，Pial_93來自93_ll，Pial_NP來自Nipponbare，Pial-Fu來自Fukunishiki )，進(jìn)行比對分析，鑒定到Pia-I抗性基因所特異的I個STS (抗性基因存在3個氨基酸的缺失，而感病等位基因則不存在缺失)(圖1)，該處缺失可以將Pia-I與感病等位基因區(qū)分開。同樣的方法分析Pia-2(Pia-2是來自AichiAsahi, Pial-93 來自 93-11，Pia2_NP 來自 Nipponbare, Pia2_Fu 來自 Fukunishiki )。在第422位點(diǎn)處，Pia-2編碼的第141位氨基酸為亮氨酸(L)，而感病等位基因在該位點(diǎn)則編碼組氨酸(H)，因此，存在于Pia-2 cDNA第422位點(diǎn)的功能特異性SNP可以將Pia-2與感病等位基因區(qū)分開(圖2)。實(shí)施例2 Pia功能特異性分子標(biāo)記及其引物設(shè)計與檢測根據(jù)STS 標(biāo)記的設(shè)計原理(Olson et al. A common language for physicalmapping of the human genome. Science 29:1434-1435)，在上述 STS 上游 60 IOObp 處設(shè)計功能特異性上游引物Pia-IFNP-F，如SEQ ID NO. I所示；在上述STS下游60 IOObp處設(shè)計功能特異性下游引物Pia-IFNP-R JnSEQ ID NO. 2所示。根據(jù)dCAPS 標(biāo)記的設(shè)計原理(Neff et al. 2002. Web-based primer design forthe single nucleotide polymorphism analysis. Trends m Genetics 18:61 j-o_l5)，在上述SNP上游100 200bp處設(shè)計功能特異性上游引物Pia-2FNP-F，如SEQ IDNO. 3所示；在上述SNP處設(shè)計帶有錯配堿基的功能特異性下游引物Pia-2FNP-R，如SEQ ID NO. 4所示。通過這2組引物對攜帶有Pia基因以及其他等位基因的品種DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物A和擴(kuò)增產(chǎn)物B ;然后分別對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接電泳，或酶切后電泳，比較驗(yàn)證，分別得到與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段Pia-IFNP和Pia_2FNP。Pia-IFNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下
IOxPCR 緩沖液2.0 μ dNTPs (2.5 mM each)1.6 μ SEQ ID NO.I (10 μΜ)0.5 μ SEQ !D Ν0.2 (ΙΟμΜ)0.5 μ
T^DNA 聚合酶(5 U/μΙ)0.1 μ
DNA 模板(50 ng/μ )1.0 μ
無菌雙蒸水補(bǔ)至20.0 μ Pia-IFNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溫度循環(huán)條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、65°C 30秒、720C 30秒，30個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取適量樣品在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測，電泳條件為90V，3小時，擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物為116bp和125bp，前者即為抗性基因Pia-I的功能特異性分子標(biāo)記。步驟(3)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中Pia_2FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下
IOxPCR 緩沖液2.0 μ
dNTPs (2.5 mM each)I 6 ul
SEQ1DN0.3 (ΙΟμΜ)0.5 μ
SEQ ID NO. 4 (ΙΟμΜ)0.5 μ
^DNA 聚合酶(5 U/μΙ)O.I μ
DNA 模板(50 ng/μ )1.0 μ
無菌雙蒸水補(bǔ)至20.0 μ Pia-2FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溫度循環(huán)條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、53°C 30秒、720C 30秒，35個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用限制性內(nèi)切酶Xba I對所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，反應(yīng)體
系如下
無菌雙蒸水5.3 μ
IOxbuffer M1.2 μ
PCR 產(chǎn)物5.0 μ Xha 丨0.5 μ 在37°C條件下酶切3小時后，取適量酶切樣品在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳 檢測，電泳條件為90V，3小吋。擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物為142bp，酶切后為123bp，后者(能 夠被酶切的)即為抗性基因Pia-2的功能特異性分子標(biāo)記。實(shí)施例3 :抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記在鑒別不同稻瘟病抗性基因中的應(yīng)用采集含有不同的稻瘟病抗性基因的8個水稻品種[分別為Aichi Asahi,C101LAC、C101A51、C101PKT、Nipponbare、Shin 2,BL I及Fukunishiki (Zeng et al. 2011.Characterization and fine mapping 01 tne rice Dlast resistance gene Pia. scienceChina 54:372-378)的基因組DNA，并以此為模板，利用實(shí)施例2中描述的Pia-IFNP和Pia-2FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對抗性基因Pia功能特異性的分子標(biāo)記分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切及電泳檢測。電泳結(jié)果分別如圖A和圖B所示，可見，含有抗性基因Pia的品種(泳道I 4)和不含有抗性基因Pia的品種(泳道5 8)能被成功鑒定區(qū)別。如

的那樣，試驗(yàn)結(jié)果與設(shè)計分析的相吻合，說明抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記可在鑒別Pia基因與其他稻瘟病抗性基因得到應(yīng)用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP，其特征在于它由Pia-IFNP和Pia-2FNP組合而成;分別為通過引物對SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4從水稻總DNA中擴(kuò)增出來的核苷酸序列；Pia_lFNP直接通過電泳檢測，Pia-2FNP則經(jīng)特異性酶切之后電泳檢測，與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的分子標(biāo)記； 所述引物對SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5，-CTTTTGAGCTTGATTGGTCTGC ；SEQ ID NO. 2 :5’ -CTATTGCACCAGAGGGACCAG ；SEQ ID NO. 3 :5’ -GCGCCGCCACAAGGTTG ；SEQ ID NO. 4 :5’ -CGTCACCAAGCTGGTACCTCTAG。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP，其特征在于所述的水稻為水稻品種Aichi Asahi0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pia包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pia-I和Pia_2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP，其特征在于所述的特異性酶切為Xba I酶切。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pia的等位基因序列與Pia-I和Pia-2序列做比對的方法，分析得到能區(qū)別于感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia功能特異性的I處STS及I處SNP，再通過引物設(shè)計分別得到SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4引物，對水稻DNA擴(kuò)增分別得到Pia功能特異性分子標(biāo)記Pia-IFNP 和 Pia_2FNP。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的方法，其特征在于包含了以下步驟 (1)通過常規(guī)PCR法擴(kuò)增，獲得多個A型和N型水稻品種的Pia等位基因的編碼區(qū)DNA序列； (2)利用多序列比對軟件工具，將步驟(I)所獲得的序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后進(jìn)行比對，得到Pia-I抗性基因所特異的3處氨基酸缺失，該缺失位于Pia-I C末端區(qū)域；得到Pia-2抗性基因所特異的I處單堿基差異，該差異位于Pia-I CC區(qū)域； (3)根據(jù)步驟(2)所得到的序列差異及標(biāo)記設(shè)計原理，設(shè)計出引物對SEQIDNO. I和SEQID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;并用這2組引物分別對不同水稻的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物A和擴(kuò)增產(chǎn)物B ;前者直接電泳檢測，后者則經(jīng)特異性酶切之后電泳檢測，然后比較驗(yàn)證，分別獲得與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段 Pia-IFNP 和 Pia_2FNP ； (4)對步驟(3)所獲得的分子標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定Pia抗性基因的功能特異性的分子標(biāo)記PiaFNP。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的檢測方法，其特征在于步驟(I)中所述的水稻品種包括Aichi Asahi、9311、Nipponbare及Fukunishiki0
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物A的PCR反應(yīng)體系如下10\ 0 緩沖液2ロ1、.2.5mM dNTP I. 6 μ I、10 μ M 引物 SEQ ID NO. 10. 5 μ I、10 μ M 引物 SEQ ID NO. 20. 5 μ 1、5U/μ I TaqDNA 聚合酶 O. I μ l、50ng/ μ I DNA 模板 I μ I、雙蒸水補(bǔ)至 20 μ I ; 所述的PCR的反應(yīng)條件如下預(yù)變性94°C 3分鐘；94°C 30秒、65°C 30秒、72°C 30秒，.30個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存； 步驟(3)中所述的Pia-2FNP PCR的反應(yīng)體系如下10XPCR緩沖液2 μ 1、2. 5mM dNTPI. 6 μ I、10 μ M 引物 SEQ ID NO. 3 O. 5 μ I、10 μ M 引物 SEQ ID NO. 40. 5 μ 1、5U/μ I TaqDNA聚合酶O. I μ l、50ng/ μ I DNA模板I μ I、雙蒸水補(bǔ)至20 μ I ; 所述的PCR的反應(yīng)條件如下預(yù)變性94°C 3分鐘；94°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，.35個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存； Pia-IFNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溫度循環(huán)條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、65°C 30秒、.720C 30秒，30個循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的檢測方法，其特征在于 步驟(3)中所述的Pia-2FNP為利用限制性內(nèi)切酶Xba I對所述的擴(kuò)增產(chǎn)物B酶切得到的產(chǎn)物，其反應(yīng)體系如下=IOX酶切緩沖液I. 2μ 1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μ l、Xba I酶O. 5 μ 1，雙蒸水補(bǔ)至12 μ I。
10.權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP的應(yīng)用，其特征在于利用所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記PiaFNP在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用。該分子標(biāo)記由Pia-1FNP和Pia-2FNP組成。本發(fā)明通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pia的等位基因序列與Pia-1及Pia-2序列做比對的方法，分析得到能區(qū)別于其他感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-1功能特異性的1處STS，以及Pia-2功能特異性的1處SNP；通過引物設(shè)計，分別得到SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，對水稻總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別通過直接電泳檢測以及特異性酶切之后電泳檢測，得到Pia功能特異性分子標(biāo)記Pia-1FNP和Pia-2FNP，二者組合則可準(zhǔn)確地檢測功能性的Pia。本發(fā)明可在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的得到應(yīng)用。
文檔編號C12N15/10GK102703443SQ20121016388
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者張玉, 曾曉珊, 楊先鋒, 林菲, 潘慶華, 王玲 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)