專利名稱：水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及一種水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應用。
背景技術：
水稻是我國最主要的糧食作物之一，其播種面積、總產和單產均居糧食作物首位。水稻冷害是目前水稻育種和生產上的一個難題，苗期冷害導致秧苗黃葉、生長遲鈍、卷葉，甚至死亡，不僅嚴重影響早稻的產量，還會影響晚稻的生產計劃(詹慶才等，水稻苗期耐冷性QTLs的分子定位.湖南農業(yè)大學學報，2003，29: 7_11);我國東北和西南地區(qū)，較大低溫災害多數發(fā)生在水稻孕穗期和花期，導致不育率的急劇上升和產量的大幅度下降，對水稻生產帶來更大的損失(王連敏等，寒地水稻耐冷基礎的研究III花期低溫對水稻結實的 影響.中國農業(yè)氣象，1997，18: 9-11);據不完全統(tǒng)計，我國每年因低溫冷害損失稻谷約50億公斤(陳大洲等，東鄉(xiāng)野生稻抗寒基因的利用與前景展望.江西農業(yè)學報，1998，10:65-68)。招毒是酸性土壤中限制植物生長的最主要的限制因素(Kochian et al.,How do crop plants tolerate acid soils Mechanisms of aluminum tolerance andphosphorous efficiency. Annu Rev plant Biol. 2004， 55: 459—493 ；von Uexkull,Mutert， Global extent, development and economic impact of acid soils. In:Date RA, Grundon NJj Raymet GE，Probert ME, eds. Plant-Soil Interactions atLow pH: Principles and management. Dorrecht， The Neth: Kluwer Academic, 1995，pp. 5-19.)。全世界酸性土壤總面積達39. 5億hm2，占世界可耕地土壤的40%，主要分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)(Kochain, Cellular mechanisms of aluminum toxicity andresistance of wheat in plants. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995, 46:237-260)。更令人擔憂的是，日趨嚴重的酸沉降問題還在不斷加劇土壤的酸化，以致其范圍和強度仍在增加(張健，鋁毒害與森林衰退研究評述.世界林業(yè)研究，1999，12(2):28-30 ;劉菊秀，酸沉降對森林生態(tài)系統(tǒng)影響的研究現狀及展望.生態(tài)學雜志，2003，22(5): 113-117)。因此，鋁毒和冷害已成為影響作物生產最為嚴重的問題之一，水稻抗鋁和抗冷相關基因的克隆和研究，不但對闡明水稻抗鋁和抗冷機理具有重要的意義，同時對用于其它敏感作物的分子改良具有較高的應用價值。一般認為，水稻的耐冷性是由多基因控制的數量性狀，在多基因的調控下完成復雜的適應性反應。目前，已有部分水稻耐冷基因被克隆，如能抑制冰晶形成和生長的抗凍蛋白 AFP (Wang et al. , The dual effect of antifreeze protein on cryopreservationof rice {Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells. Cryo letters, 2001, 22:175-182)，胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白LEA(張妍等，轉LEA3基因水稻的抗性分析.河北農業(yè)大學學報，2005,28: 33-36),冷相關蛋白和分子伴侶蛋白(Cui et al. , A proteomicanalysis of cold stress responses in rice seedlings. Proteomics, 2005, 5:3162-3172)，這些基因表達產物均是與植物耐冷性直接相關的功能性蛋白；而另外一些耐冷基因如 CBF 轉錄因子(Lissarre et al. , Cold-responsive gene regulation duringcold acclimation in plants. Plant Signaling and Behavior, 2010，5: 948-952)、 丐依賴性蛋白激酶(Ludwig et al.，CDPK-mediated signalling pathways: specificityand cross-talk. J Exp Botj 2004，55: 181-188)、細胞分裂蛋白激活激酶(Jonak etal.， Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling.Curr Opin Plant Biol. 2002，5: 415-424)等則為調控性蛋白，調控冷信號傳導、耐冷基因表達、相關蛋白和酶活性提高水稻的抗冷性。另外，近年已從植物中分離克隆到不少鋁毒響應基因(楊志敏和汪瑾，植物耐鋁的生物化學與分子機理.植物生理與分子生物學學報，2003，29(5) : 361-366 ;劉強等，植物適應鋁毒脅迫的生理及分子生物學機理.應用生態(tài)學報，2004，15(9) : 1641-1649 ；Mao et al.，Identification of aluminum-regulated genes by cDNA—AFLP in rice{Oryza sativa L.) : Aluminum-regulated genes for the metabolism of cell wallcomponents. J Exp Bot. 2004，55(394): 137-143 ;Zhang et al. , Identificationof aluminum-responsive genes in rice cultivars with different aluminum sensitivities. J Exp Bot. 2007，58(8) : 2269-2278)，但抗鋁相關的基因很少，目前只確定從小麥、大麥和高粱中克隆到3個抗鋁基因，分別為1#77，執(zhí)4^77和姑紛招(Sasaki et al.，A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.Plant J. 2004， 37: 645-653 ；Furukawa et al. , An aluminum-activated citratetransporter in barley. Plant Cell Physiol. 2007，48(8): 1081-1091 ;Magalhaes etal., A gene in the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family confersaluminum tolerance in sorghum. Nature Genetics. 2007，39: 1156-1161)，它們分別編碼蘋果酸和檸檬酸通道蛋白，通過增加蘋果酸和檸檬酸的分泌提高抗鋁的能力；在水稻中，STARl(sensitive to Al rhizotoxicity I)和 STAR2相互作用形成一個細菌型ABC通道蛋白復合體(ATP binding cassette transporter)，該復合體可以特異運輸尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)修飾細胞壁，通過掩蓋細胞壁上鋁結合位點提高水稻的抗鋁性(Huanget al.，A bacterial-type ABC transporter is involved in aluminum tolerance inrice. Plant Cell. 2009， 21: 655—667)。異梓檬酸裂解酶(isocitrate lyase, I CL)在植物、原生動物、藻類、真菌分布在乙醒酸循環(huán)體中，而在細菌中則存在于細胞質中。Xu等(Xu et al.，Inducibleantisense suppression of glycolate oxidase reveals its strong regulation overphotosynthesis in rice. J Exp Bot, 2009，60(6): 1799-1809)研究發(fā)現當光呼吸途徑的乙醇酸氧化酶活性供給不足時，ICL受到顯著的誘導，乙醛酸循環(huán)體可被激活，引起乙醛酸的含量以及下游基因和代謝物的變化，補充光呼吸中乙醛酸的不足，從而維持細胞的穩(wěn)定狀態(tài)。Appanna (Appanna et al.，The metabolism of aluminum citrate andbiosynthesis of oxalic acid in Pseudomonas uorescens. Current Microbiology.2003，47(1): 32-39)研究熒光假單胞菌在Al3+大量存在時，ICL被大量誘導，草酸等酸性物質大量生成，以此緩解Al3+對菌株的毒害。已有的研究表明ICL參與植物或微生物對非生物脅迫的反應，通過提高ICL的酶活性或激起下游反應增強對非生物逆境的抗性。目前，沒有報道OsICL與水稻抗冷和抗鋁性有關。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種稻OsICL蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述稻OsICL蛋白的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供上述稻OsICL蛋白的編碼基因在制備轉基因植物中的應用。本發(fā)明通過以下技術方案實現上述目的
水稻OsICL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，或該序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且功能與SEQ ID NO: I所示序列相同的序列。
上述水稻OsICL蛋白的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID NO:2所示?；蛟趪栏駰l件下可與SEQ ID NO: 2雜交并且編碼上述水稻OsICL蛋白的DNA分子，所述的嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0. 1% SDS和I X SSC, 0. 1% SDS各洗雜交膜一次?；蛘吲cSEQ ID NO: 2的序列有90%以上的同源性(優(yōu)選95%以上同源性)，并且編碼上述水稻OsICL蛋白的DNA分子。上述水稻OsICL蛋白的編碼基因的啟動子，序列如SEQ ID N0:3所示；或嚴格條件下可與SEQ ID N0:3所示的DNA分子雜交且具有啟動子功能的DNA分子，上述的嚴格條件是:在 6XSSC，0. 5%SDS 的溶液中，在 65°C下雜交，然后用 2XSSC,0. 1% SDS和 1XSSC，0. 1%SDS各洗雜交膜一次。一種表達載體，是由上述水稻OsICL蛋白的編碼基因插入到植物表達載體的多克隆位點構建而成。作為一種優(yōu)選方案，該表達載體還包括啟動子，該啟動子為增強型啟動子、組成型啟動子、組織特異型啟動子或誘導型啟動子，花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(Pubi)等,他們可單獨使用或與其他的植物啟動子結合使用。此外，使用本發(fā)明的的基因構建植物表達載體時，還可以使用增強子，包括翻譯增強子或者轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或是鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和其實密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構區(qū)域。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達可以產生顏色變化的酶或是發(fā)光化合物的基因(如GUS基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除秀劑基因)等。以上所述任意一種表達載體，所述的植物表達載體優(yōu)選為PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI 121，或其他衍生植物表達載體。所述水稻OsICL蛋白在制備提高植物抗鋁和抗冷性藥劑中的應用。所述水稻OsICL蛋白的編碼基因在制備抗鋁和抗冷性轉基因植物中的應用。攜帶有本發(fā)明的水稻OsICL蛋白的編碼基因的植物表達載體可以通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化到植物細胞或是組織中。被轉化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
實驗結果表明，轉OsICL基因植株表現對鋁毒和低溫的抗性明顯增強，其蛋白質和編碼基因對水稻抗鋁和抗冷性的調控具有重要的實際意義，在實際應用中可以將OsICL基因轉入不同的水稻品種中以培育更加理想的水稻栽培品種或者轉入到其他感鋁和感冷的作物提高抗性。OsICL蛋白及其編碼基因在農業(yè)領域具有廣闊的應用和市場前景。


圖I.水稻OsICL的擴增產物電泳結果，泳道M為分子量標記DL2000 (購自TAKARA);泳道1-3為目的基因。圖2.重組OsICL的過量表達載體酶切鑒定電泳結果，泳道M為分子量標記DL2000 (購自TAKARA);泳道1，4和5為含OsICL的植物重組表達載體質粒，泳道2和3為空載體質粒。 圖3.重組OsICL的過量表達載體轉化農桿菌后穩(wěn)定性檢測結果，泳道M為分子量標記DL2000 (購自TAKARA);泳道1_6為含OsICL的植物重組表達載體質粒。圖4.經農桿菌介導得到的轉化植株分化及生根，A :繼代培養(yǎng)中的愈傷組織，B 篩選中的愈傷組織，C :預分化中的抗性愈傷組織，D :預分化中的抗性愈傷組織轉為綠點，E :分化出幼苗，F :生根壯苗培養(yǎng)基中生長的幼苗。圖5.半定量RT-PCR分析轉基因植株中OsICL的表達，WT為野生型植株中花11 ；3-1和3-2為OsICL過量表達植株。圖6. Western Blot分析轉基因植株中OsICL的表達，WT為野生型植株中花11 ；3-1和3-2為OsICL過量表達植株。圖7.轉基因植株與對照植株中ICL的活性檢測，WT為野生型植株中花11 ;3_1和
3-2為OsICL過量表達植株。圖8.轉基因植株的抗鋁性鑒定，WT為野生型植株中花11 ;3_1和3-2為OsICL過量表達植株，CK為對照處理；A1為lmmol/L AlCl3處理，A為lmmol/L AlCl3處理4天；B為Immol /T, AlCl3 處理 12 天。圖9.轉基因植株的抗冷性鑒定，WT為野生型植株中花11 ;3_1和3-2為OsICL過量表達植株，抗冷性鑒定轉基因植株發(fā)芽后木村B培養(yǎng)至4葉期，平均溫度12. 80C -18. 8°C，濕度約 80-90%, pH 為 4. 5-5. 0，冷處理 26 天。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步解釋本發(fā)明，實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物合成及測序工作由北京奧科生物技術有限公司完成.
實施例IOsICL基因的獲得
根據NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的關于該基因的cDNA序列設計引物，引物序列如下(46-1852bp)
OsICLFl: tcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:4)；
OsICLRl: gctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO:5)。以粳稻品種中花11號(購自廣東省農科院)2周的幼苗淹水2天的水稻葉片cDNA為模版，以OsICLFI和OsICLRl為引物，常規(guī)PCR擴增OsICL基因。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段大約1800bp，回收并純化該DNA片段，克隆到PMD18-T載體(購自TAKARA公司)上，獲得pMD18-T_0sICL載體，送北京奧科生物技術有限公司測序，測序結果表明，該DNA片段的序列如SEQ ID N0:2所示。根據實施例I所得OsICL基因的核苷酸序列設計引物對0sICLF2和0sICLR2，并在引物兩端分別引入限制性內切酶//hdIII和分el識別位點和保護堿基，引物序列如下
0sICLF2: ggccgaagctttcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:6,下劃線為限制性內切酶Hindlll識別位點)；
0sICLR2: tatatactagtgctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO: 7,下劃線為限制性內切酶Spel識別位點)o以pMD18-T-0sICL載體DNA為模版，在引物0sICLF2和0sICLR2的引導下，用常規(guī) PCR方法擴增OsICL基因。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化大約1800bp左右的DNA片段，將該片段克隆到pMD18-T載體(購自TAKARA公司)上，獲得新的重組載體命名為pMD18-T-0sICL-E，送北京奧科生物技術有限公司測序，測序結果表明，該DNA片段的序列如SEQ ID N0:2所示，在其DNA兩端引入了合適的酶切位點。實施例2遺傳轉化鑒定目標基因的功能
將OsICL基因克隆入植物過量表達載體pCAMBIA1380 (購自澳大利亞CAMBIA公司)多克隆位點的VifldIII和分el酶切位點之間，得到含有OsICL基因的植物表達載體，然后利用農桿菌介導的方法轉化粳稻品種中花11號的成熟胚的愈傷組織，方法如下述文獻描述(Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T—DNA, Plant J.1994，6: 271-282)，經過預分化、分化，得到12株轉化植株，經過PCR鑒定，全部為陽性，PCR引物序列如下
引物 I : 5，- CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC -3’ (SEQ ID N0:8)；
引物 2 :5，- TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA -3，(SEQ ID NO:9);
PCR 擴增條件為94 0C 2 min ；94°C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72°C I min，35 個循環(huán)；72 °C 5 min。經過PCR鑒定為陽性的轉基因植株后，提取Tl代轉基因植株葉片基因組DNA進行Southern Blot檢測插入基因的拷貝數，選擇單拷貝的轉基因植株分單株收取種子，然后取100粒以上種子發(fā)芽后利用潮霉素進行篩選，若沒有死亡則表明種子已經純合；選擇已經純合的轉基因種子和野生型水稻中花11種子萌發(fā)后，利用木村B營養(yǎng)液(調pH為4. 8)培養(yǎng)水稻至4葉期，然后提取水稻RNA，檢測總RNA濃度和完整度后再合成cDNA第一鏈，以水稻Jdi/ 作為內參基因，加入等量的cDNA模板，擴增Jdi/ 和tts/a，等體積PCR產物上樣后檢測OsICL的表達，從圖5可以看出，在轉基因植株根和葉片中As/a的表達都得到較大的提高；所用PCR引物序列如下
Actin-F: 5’ - GACATTCAGCGTTCCAGCCATGTAT-3’ (SEQ ID NO:10)；
Actin-R: 5’ - TGGAGCTTCCATGCCGATGAGAGAA-3’ (SEQ ID NO:11)；
ICL-F: 5’ - GGTGGGGAACGGACAGGT-3’ (SEQ ID NO:12)；
ICL-F: 5，- TTGCGGTCGTGGTAGAGC-3’ (SEQ ID NO:13)；PCR 擴增條件為94 °C 2 min ；94°C 30 sec, 56 V 30 sec, 72°C I min，25 個循環(huán)；72 °C 5 min。木村B 營養(yǎng)液具體配方為(NH4) 2S04 (0 . 36 5mM)，KH2PO4 (0. 182 mM)，KNO3(0.183 mM), K2SO4 (0.086 mM), Ca (NO3) 2 (0.366 mM), MgSO4 (0.548 mM), EDTA-Fem(0. 020 mM), MnCl2-4H20 (0.091 X 10_3 mM), ZnSO4 7H20 (0.77 X 10_3 mM), CuSO4 5H20(0. 32X10-3 mM), H3BO3 (0. 0462 mM), (NH4) 6Mo7024 4H20 (0. 145 X 1(T3 mM)。利用上述培養(yǎng)至4葉期的水稻根和葉片提取總蛋白，定量后進行SDS-PAGE電泳，利用OsICL多克隆抗體進行Western Blot分析，結果如圖6所示，轉基因植株根和葉片中ICL在蛋白水平與野生型相比均有較大的上調，并且野生型植株均檢測不到OsICL的表達。進一步測定水稻總蛋白中ICL的酶活性，轉基因植株根和葉中ICL的酶活性也提高40倍和25倍(圖7)。通過以上實驗，我們證實了 OsICL不論是在核酸和蛋白表達水平，還是在酶活性 上轉基因植株均較野生型有較大提高。為了檢驗轉基因純合植株對鋁毒和冷害的抗性，我們進一步對轉基因純合植株進行抗鋁和抗冷性鑒定，抗鋁性鑒定方法如下述文獻描述(Xuet al, Differential resistance of two subtropical rice cultivars to aluminumtoxicity. J Plant Nutrition, 2004, 27，1601-1609),具體如下轉基因純合植株和野生型水稻植株中花11發(fā)芽后木村B培養(yǎng)液培養(yǎng)至4葉期，然后在人工氣候箱中設置光照培養(yǎng)14小時(30°C):暗培養(yǎng)10小時(25°C)、濕度約60-80%，鋁毒(ImM AlCl3)處理12天，pH為4. 2，每3天換一次營養(yǎng)液；抗冷性鑒定方法如下轉基因純合植株和野生型水稻植株中花11發(fā)芽后木村B培養(yǎng)液培養(yǎng)至4葉期，然后在人工氣候箱中以平均溫度12. 80C -18. 8°C、濕度約80-90%、pH為4. 5-5. 0冷處理26天，每3天換一次營養(yǎng)液。結果表明轉基因植株的抗鋁和抗冷性明顯增強。轉化植株與對照植株相比，鋁處理下轉基因植株根的生長速率和相對生長量均較對照植株高(圖8);冷處理后轉基因植株根和地上部的生長速率和生長量均較對照植株聞(圖9)。
權利要求
1.水稻OsICL蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO: I所示。
2.權利要求I所述水稻OsICL蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述水稻OsICL蛋白的編碼基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.權利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的編碼基因的啟動子，其特征在于核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。
5.一種表達載體，其特征在于由權利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的編碼基因插入到植物表達載體的多克隆位點構建而成。
6.根據權利要求5所述表達載體，其特征在于該表達載體還包括啟動子，其特征在于啟動子為增強型啟動子、組成型啟動子、組織特異型啟動子或誘導型啟動子。
7.根據權利要求5所述表達載體，其特征在于所述植物表達載體為PCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或pBI121。
8.權利要求I所述水稻OsICL蛋白在制備提高植物抗鋁和抗冷性藥劑中的應用。
9.權利要求2所述水稻OsICL蛋白的編碼基因在制備抗鋁和抗冷性轉基因植物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述轉基因植物為轉基因水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應用，屬于植物基因工程技術領域。本發(fā)明的水稻OsICL蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，該蛋白的一種編碼基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明的水稻OsICL蛋白的編碼基因可以插入到植物表達載體的多克隆位點制備成重組表達載體，進一步構建轉基因植物，研究發(fā)現，導入該基因的水稻在抗冷和抗鋁性能方面都有明顯提高。本發(fā)明的OsICL蛋白及其編碼基因有助于研究水稻抗鋁和抗冷的分子機制，對生產上培育具有耐鋁和抗冷的水稻品種，或是通過轉基因的方法改良其他對鋁和冷敏感作物的抗性具有很大的應用價值。
文檔編號C12N15/113GK102766618SQ20121016390
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權日2012年5月24日
發(fā)明者張嬋, 張建軍, 彭新湘, 楊國珍, 陳燕 申請人:華南農業(yè)大學