專利名稱：分離和擴增臍帶新鮮組織間充質干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從臍帶新鮮組織中分離和擴增干細胞的方法，特別涉及從臍帶新鮮組 織中分離和擴增間充質干細胞的方法。
背景技術：
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚 層，具有多向分化潛能、免疫調節(jié)和自我復制等特點，日益受到人們的關注。間充質干細胞 在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心 肌、內皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的 種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，尤其對治療衰老和組織器官損傷修復 有很大的臨床應用價值。MSC在骨髓中蘊含豐富，但隨著年齡的老化，骨髓中的干細胞數(shù)目也會顯著降低、 增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植給異體可能引起免疫反應，且提取干細胞 過程對患者的損傷性和在采集時遇到的其他問題，都直接影響了骨髓MSC的臨床應用，使 得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題。近期的研究顯示，臍帶組織中也含有間充質干細胞并且能成功分離。這種組織來 源的間充質干細胞不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且分離出來的干細胞更原 始，有更強的增殖分化能力。其免疫細胞的功能活性低，大大減低了觸發(fā)免疫反應及引起移 植物抗宿主病的風險。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對 產(chǎn)婦及新生兒無任何危害及損傷。以上原因足以令臍帶間充質干細胞成為骨髓間充質干細 胞的理想替代物。但是，目前關于臍帶MSC的分離和擴增方法不一，且大多步驟復雜，獲得較多數(shù)量 臍帶MSC也存在一定困難。因此，本領域需要有從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的簡單、 有效的方法，以滿足醫(yī)藥、科研、臨床應用等領域的需求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有獲取臍帶間充質干細胞方法的缺陷，提供一種簡單有效 的從離體臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用一種組織消化法可以有 效地從臍帶組織分離原代間充質干細并進行培養(yǎng)。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。因此，本發(fā)明第一方面提供了從臍帶離體新鮮組織中分離和擴增間充質干細胞的 方法，該方法包括以下步驟(1)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶剪開， 平鋪，通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗臍帶組織，以減少臍帶組織上紅細胞；(2)消化處理將步驟(1)得到的臍帶組織剪成組織塊，將組織塊放入消化酶溶液 (例如其非限制性地包含I型膠原酶、DMEM-F12)中，消化處理0. 5-3小時(例如1_2小時， 例如1. 5小時)，過濾清除組織塊后，加入間充質干細胞培養(yǎng)基以終止消化，然后對消化得到的細胞進行細胞清洗，最終獲得細胞懸液；(3)細胞培養(yǎng)將步驟(2)得到的細胞懸液放入培養(yǎng)容器，再將培養(yǎng)容器放進培養(yǎng) 箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)時將培養(yǎng)容器從 培養(yǎng)箱中取出，補加適量(例如3ml)間充質干細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第8-11天(例如 第9天)時將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，進行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每1-3天(例 如2天)進行一次全換液；(4)細胞傳代當培養(yǎng)容器中的貼壁細胞融合率達到40%-70%(例如60%)以后，利 用消化酶(例如TrypLe Express)將貼壁細胞脫離容器底部，離心，抽走上清液，加入充質 干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再接種于培養(yǎng)容器進行傳代并進行擴增培養(yǎng)，此后每1-3天 (例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得臍帶間充質干細胞， 必要時進行傳代；以及任選的下列一個或多個步驟(5)針對步驟(4)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、 細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(6)將步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述臍帶是臍帶的新鮮離體組織。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(1)所述臍帶組織是在生物安全柜內進行處理。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(1)所述平鋪的步驟是將臍帶組織平鋪在 培養(yǎng)平皿內，所述培養(yǎng)平皿直徑為5-20cm的培養(yǎng)平皿，優(yōu)選培養(yǎng)皿直徑為10cm的培養(yǎng)平 皿。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述酒精的濃度為25%_95%，優(yōu)選75%。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述PBS緩沖液是磷酸的鈉鹽和/或鉀鹽配制 的，其pH為5. 0-8. 0，優(yōu)選pH為5. 5-76，優(yōu)選pH為6. 0-7. 0。在一個實施方案中，所述PBS 緩沖液中磷酸根的濃度為0. 01-0. 5M，優(yōu)選0. 02-0. 1M。在本發(fā)明下文試驗中，所用PBS緩 沖液是磷酸鈉鹽，其中磷酸根的濃度為0.025M，pH為6.5。需要說明的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 在上述范圍內的PBS緩沖液濃度和pH值對于本發(fā)明方法的效果影響不大。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述消化酶溶液是將I型膠原酶加入 DMEM-F12，通過過濾器過濾得到的，其消化酶為0. 05g-0. 5g，優(yōu)選消化酶為0. 08g-0. 2g，優(yōu) 選消化酶為 0. lg，其 DMEM-F12 為 50-500ml，優(yōu)選 DMEM-F12 為 80_200ml，優(yōu)選 DMEM-F12 為 100ml，其過濾器為5-50 u m過濾器，優(yōu)選20 y m過濾器。在一個實施方案中，所述消化酶溶 液是將0. lg的I型膠原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混勻，過濾(例如用20um過濾器 過濾)得到的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)是將臍帶組織轉移至另一個細胞培養(yǎng) 平皿中，然后進行臍帶組織剪成組織塊的，所述培養(yǎng)平皿直徑為5-20cm的培養(yǎng)平皿，優(yōu)選 培養(yǎng)皿直徑為10cm的培養(yǎng)平皿。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，組織塊的大小約為0. 2-2. 5立方厘 米，優(yōu)選約為0. 5-1. 5立方厘米，優(yōu)選約1立方厘米的立方形塊狀。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，組織塊大小在0. 5-1. 5立方厘米，優(yōu)選0. 5-1. 0立方厘米，特別是大小約1立方厘米時是非常優(yōu)選的。盡管預期組織碎塊小 有利于本發(fā)明方法的實現(xiàn)，然而本發(fā)明人在試驗中發(fā)現(xiàn)在0. 2立方厘米、0. 5立方厘米、1立 方厘米三種狀態(tài)下，它們對消化酶的消化處理效果基本一致，而體積大于1.5立方厘米以 后對消化酶的消化效果有顯著不利影響，該不利影響可以通過延長消化時間在一定程度上 弱化。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑵中，消化處理的時間為0. 5-3小時，優(yōu) 選1-2. 5小時，優(yōu)選1. 5-2小時。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在1-2. 5小時的消化處理時間內，對組織塊 的消化處理效果是最佳的，既可保證組織塊得到充分的消化處理，也能避免細胞被破壞。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，消化處理是在人體體溫附近的溫 度范圍內進行的，優(yōu)選34-40 V，優(yōu)選36-38 V，優(yōu)選37 °C。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，消化處理是在恒溫搖床里進行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，過濾清除組織塊是通過濾網(wǎng)進行 的，所述濾網(wǎng)為50-150 V- m濾網(wǎng)，優(yōu)選約100 u m濾網(wǎng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，終止消化的間充質干細胞培養(yǎng)基 是按照2:廣1:2的比例加入，優(yōu)選1:1的比例，所述比例為體積比。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中，細胞清洗的具體步驟是離心5-15 分鐘,去除上清液,加入PBS緩沖液重懸細胞，再離心5-15分鐘，去除上清液，加入間充質干 細胞培養(yǎng)基，抽取小量樣本進行細胞計數(shù)。離心轉速為800-2000rpm，優(yōu)選1250rpm，離心時 間為優(yōu)選10分鐘。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述間充質干細胞培養(yǎng)基中包含F(xiàn)BS、 L-Glutamine (L-谷氨酸)、Gentamicin (慶大霉素)和DMEM-F12。在一個實施方案中，所 述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有10-20%的FBS。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養(yǎng) 基中含有約15%的FBS。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有0. 5-2%的 L-Glutamine。在一個實施方案中,所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有約1%的L-Glutamine。 在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有約0. 01-0. 1%的Gentamicin。在一個 實施方案中，所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有約0. 05%的Gentamicin。在一個實施方案中， 所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有80-90%的DMEM-F12。在一個實施方案中，所述間充質干細 胞培養(yǎng)基中含有約84%的DMEM-F12。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有 約15重量份的FBS、約1重量份的L-Glutamine、約0. 05重量份的Gentamicin和約84重 量份的DMEM-F12。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有約15重量份的FBS、約1重量份的L-Glutamine、約 0. 05重量份的Gentamicin和約84重量份的DMEM-F12的間充質干細胞培養(yǎng)基是特別優(yōu)選 的，比之于使該培養(yǎng)基的任一成分含量變化10%以上的配方在增加臍帶組織貼壁、減短貼 壁細胞從組織爬出的時間等效果方面具有顯著優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中培養(yǎng)容器為T25細胞培養(yǎng)瓶。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(3)所述細胞懸液以密度0.2-2X104/cm2 加入培養(yǎng)容器中，優(yōu)選以密度約lX104/cm2加入。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(3)所述培養(yǎng)箱中C02濃度為3-7%，優(yōu)選濃 度為5%，培養(yǎng)箱溫度控制在人體體溫附近范圍內，優(yōu)選34-40°C，優(yōu)選36-38°C，優(yōu)選37°C。根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法，在步驟(5)中，所述細胞污染檢測利用少量細胞培養(yǎng)，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。在一個實施方案中，所述細胞污染檢測是利 用病原學方法，檢測細胞是否受到選自下列的一項或多項的感染乙肝兩對半、丙肝、艾滋 病毒、巨細胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HbcAb、HbeAb、HbsAb、HCVAb、HIV_l/2Ab、 CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(5)中，所述遺傳病檢測是利用分子遺傳學 的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(5)中，所述HLA-ABC/DR配型是檢測細胞 HLA-ABC/DR 表型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(6)中，所述臍帶間充質干細胞是經(jīng)程序降 溫過程凍存于液氮中。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(6)中，所述臍帶間充質干細胞存在于細胞 凍存液中。在一個實施方案中，該細胞凍存液包含DMEM-F12、二甲基亞砜和人血白蛋白。在 一個實施方案中，該細胞凍存液包含約65份的DMEM-F12、約10份的二甲基亞砜、約15份的 人血白蛋白。在一個實施方案中，該細胞凍存液包含50%低糖DMEM培養(yǎng)液、40%FBS、10% 二 甲基亞諷。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟(1)消毒和清洗在生物安全柜內，用酒精對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶從中 間剪開，平鋪在無菌10cm細胞培養(yǎng)平皿上，利用PBS緩沖液清洗組織，以減少組織上面的紅 細胞；(2)消化處理把0. lg的I型膠原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用20 u m過濾 器過濾得到消化液，將步驟(1)得到的臍帶組織轉移至另一個10cm細胞培養(yǎng)平皿中，把臍 帶組織剪成1cm3大小的組織塊，把組織塊放入已配好的消化液里，在37°C的恒溫搖床里消 化1. 5小時，利用100 濾網(wǎng)清除余下的組織塊，按1:1的體積比加入間充質干細胞培養(yǎng) 基(15%FBS+l%L-Glutamine+0. 05%Gentamicin+84%DMEM-F 12)以終止消化，以轉速 1250rpm 離心10分鐘，把上清液去掉并加入PBS緩沖液重懸細胞后再以轉速1250rpm離心10分鐘， 去上清液并加入間充質干細胞培養(yǎng)基，抽取小量樣本進行細胞計數(shù)；(3)細胞培養(yǎng)將步驟(2)得到的細胞懸液加入T25細胞培養(yǎng)瓶里，把T25細胞培 養(yǎng)瓶放進C02濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5天時將T25細胞培養(yǎng)瓶從培 養(yǎng)箱中取出，補加3ml間充質干細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第9天時將T25細胞培養(yǎng)瓶從培 養(yǎng)箱中取出，進行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每2天進行一次全換液；(4)細胞傳代當T25細胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞融合率達到60%以后，利用消化酶 (TrypLe Express)將貼壁細胞脫離T25細胞培養(yǎng)瓶底部，離心，抽走上清液，加入充質干細 胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再接種于T25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代并進行擴增培養(yǎng)，此后每2天換 液一次，直至融合率達到80%，即得臍帶間充質干細胞，必要時進行傳代。進一步地，可以針對以上步驟(4)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少 一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。進一步地，可以針對以上步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中冷 凍，備用。進一步地，可以將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特征及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相 關數(shù)據(jù)，建立臍帶干細胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細胞進行關聯(lián)。因此，本發(fā)明在一個方面中，提 供了建立臍帶干細胞的步驟，以及如下步驟將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎 兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷， 保存細胞的所有相關數(shù)據(jù)，建立臍帶干細胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細胞進行關聯(lián)。此外，在本發(fā)明的第一方面，提供了從臍帶新鮮組織中分離和擴增間充質干細胞 的方法。因此，本發(fā)明第二方面提供了一種臍帶間充質干細胞。根據(jù)本發(fā)明第二方面的臍帶間充質干細胞，其是根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方 案所述方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的臍帶間充質干細胞，其細胞純度大于90%，例如大于95%。 在一個實施方案中，所述臍帶間充質干細胞經(jīng)3代以上傳代后，細胞純度大于90%，例如大 于 95%。下面對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明所引用的文獻，以及該文獻中所引用的文 獻，它們的全部內容通過弓I用并入本文。 在本發(fā)明中，本發(fā)明任一方面的任一技術方案中，其任一技術特征同樣適用于本 發(fā)明的任一方面的任一實施方案，只要它們不會引起矛盾，并且這種相互適用在必要時可 以作適當?shù)男薷摹Ｔ诒景l(fā)明中，術語“臍帶間充質干細胞”是指來源于臍帶的間充質干細胞。因此在 本發(fā)明中，特別是涉及本發(fā)明的語境中，術語“臍帶間充質干細胞”可以與“臍帶干細胞”、 “干細胞”、“間充質干細胞”互換使用，除非另有明確指明。在本發(fā)明中，術語“PBS緩沖液”或者“PBS”是指磷酸鹽緩沖液。本領域技術人員 熟知在本發(fā)明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它們的一般性質例如pH值 或pH范圍。在本發(fā)明中，術語“臍帶”是指新生兒臍帶，特別是指產(chǎn)后4小時之內的臍帶。間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人類的間充質干細胞最早是 從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的一類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干 細胞，在體內和體外特定條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經(jīng)細 胞、肌細胞、肝細胞等多種成體細胞分化的能力(Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991, 9:641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284:143-147)。最新 的研究表明間充質干細胞具有免疫調節(jié)和造血支持作用，而且易于外源基因導入表達。因 此間充質干細胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構建中的種子細胞，基因治療中重要的 載體細胞，而且由于間充質干細胞促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應功能，在造血干 細胞移植和器官移植中具有廣泛的應用前景。間充質干細胞具有體外貼壁生長的特性，利 用這種特性，人們已經(jīng)成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離 培養(yǎng)出間充質干細胞。目前所報道的間充質干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分 離方法簡便，但供者取髓需要經(jīng)歷一個比較痛苦的手術，并在取材過程中及取材后會有很 高的感染機會；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每105 106個單個核細胞中大約只有1個，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質干細胞的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降， 使其在研究和應用尤其是臨床應用中受到限制。起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層的臍帶是由 間質、血管及滋養(yǎng)細胞組成，含有大量的間充質成分。最新的研究表明臍帶中含有豐富的干細胞，從臍帶中分離培養(yǎng)出這些多能干細胞 將為實驗研究和臨床應用開辟一個嶄新而豐富的來源?，F(xiàn)有的分離干細胞從而建立干細胞庫的方法尚有諸多缺點，例如純度不足、和/ 或數(shù)量不高，進而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如CN 101270349A(中國專利 申請?zhí)?00810061267. 6，
公開日2008年9月24日)公開的題為“胎盤間充質干細胞分離 和體外擴增培養(yǎng)方法”的發(fā)明；CN 101693884A(中國專利申請?zhí)?00910117522. 9，
公開日
2010年4月14日)公開的題為“一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細胞的方法” 的發(fā)明；CN 102146359A(中國專利申請?zhí)?01110005964. 1，
公開日2011年8月10日)公 開的題為“從胎盤中提取原始間充質干細胞及無血清擴增的方法”的發(fā)明。這些方法在提 取物的純度和/或回收率方面是有待進一步改善的。本發(fā)明公開了一種從臍帶中大量分離間充質干細胞的方法，并可利用這種方法保 存臍帶間充質干細胞并建立臍帶干細胞庫。本發(fā)明的發(fā)明人在總結以往分離培養(yǎng)間充質干 細胞的基礎上，利用組織消化酶消化臍帶組織塊，結合貼壁培養(yǎng)法，成功自臍帶中分離得到 大量間充質干細胞。本發(fā)明方法得到的間充質干細胞純度高、數(shù)量多，具有與骨髓間充質干 細胞相同的生物學特性，能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經(jīng)細胞等分化。 由于臍帶中干細胞較成體干細胞幼稚，含量豐富，在臨床上具有廣泛的應用前景，我們運用 常規(guī)的細胞凍存方法將間充質干細胞像臍血一樣凍存起來，建立臍帶干細胞庫，為以后干 細胞的深入研究和臨床治療奠定基礎。由于臍血中含有豐富的造血干細胞，人們建立臍血庫把臍血造血干細胞這一重要 的生物資源儲存起來，為多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病提供一種治療手段。同樣臍帶 間充質干細胞作為一種更加重要的干細胞資源，我們運用常規(guī)的細胞凍存方法將其冷凍 在-196攝氏度的深低溫液氮中長期保存，建立臍帶干細胞庫，為日后的干細胞治療保存種 子。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中間充質干細胞培養(yǎng)基配方能成功并有效的對臍帶間充質 干細胞進行體外擴增。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中換液和組織清除時間的設定縮短了貼壁細 胞達到指定融合率的時間。根據(jù)本發(fā)明的方法，消化酶的配方和臍帶組織的消化時間和方 法能成功并有效地把組織里的全細胞分離出來。本發(fā)明操作簡單，方便實用，能得到大量的間充質干細胞，分化性能好，具有向成 骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、神經(jīng)細胞等細胞分化的能力。與現(xiàn)有方法的比較 目前MSC主要采用手術法抽取供者骨髓或灌流法分離臍帶，貼壁培養(yǎng)獲得。該法分得細胞 數(shù)量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本發(fā)明成功自臍帶中分離獲得大量 純度較高的間充質干細胞，并運用此法建立臍帶干細胞庫來儲備這種極具應用前景的干細 胞。該法簡便易行，且由于臍帶與臍血一樣，細胞成份較幼稚，來源廣泛，方便易得，因此本 發(fā)明的方法在干細胞的臨床應用上將具有廣泛的前景。
具體實施方式
通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限 于下述實施例。本領域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可 以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般 性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知 的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細的描述。實施例1、從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法(1)消毒和清洗在生物安全柜內，用酒精對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶從中 間剪開，平鋪在無菌10cm細胞培養(yǎng)平皿上，利用PBS緩沖液清洗組織，以盡量減少組織上面 的紅細胞；(2)消化處理把0. lg的I型膠原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用20 y m過濾 器過濾得到消化液，將步驟(1)得到的臍帶組織轉移至另一個10cm細胞培養(yǎng)平皿中，把臍 帶組織剪成1cm3大小的組織塊，把組織塊放入已配好的消化液里，在37°C的恒溫搖床里消 化1. 5小時，利用100 濾網(wǎng)清除余下的組織塊，按1:1的體積比加入間充質干細胞培養(yǎng) 基(15%FBS+l%L-Glutamine+0. 05%Gentamicin+84%DMEM-F 12)以終止消化，以轉速 1250rpm 離心10分鐘，把上清液去掉并加入PBS緩沖液重懸細胞后再以轉速1250rpm離心10分鐘， 去上清液并加入間充質干細胞培養(yǎng)基，抽取小量樣本進行細胞計數(shù)；(3)細胞培養(yǎng)將終止消化得到的細胞懸液加入T25細胞培養(yǎng)瓶里，把T25細胞培 養(yǎng)瓶放進C02濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5天時將T25細胞培養(yǎng)瓶從培 養(yǎng)箱中取出，補加3ml間充質干細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第9天時將T25細胞培養(yǎng)瓶從培 養(yǎng)箱中取出，進行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每2天進行一次全換液；(4)細胞傳代當T25細胞培養(yǎng)瓶里面的貼壁細胞融合率達到60%左右，可利用消 化酶(TrypLE Express)把貼壁細胞脫離平皿底部，離心后把上清轉移并加入間充質干細胞 培養(yǎng)基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代并進行擴增培養(yǎng)。往后每兩天換液 一次直至融合率達到80%后再進行傳代。在以上步驟的測試中，消化后獲得的臍帶組織全細胞在培養(yǎng)的第7天開始有貼壁 細胞爬出，在第19天融合率達到90%。經(jīng)3代傳代后，細胞純度大于95%。在以上步驟的測試中，間充質干細胞培養(yǎng)基中包含15重量份FBS、1重量份 L_Glutamine、0. 05重量份Gentamicin和84重量份DMEM-F12。該培養(yǎng)基的四種組份中， 其中的任意三種比例固定時，另一種的比率在偏離上述配比10%以上時，傳代至T25培養(yǎng) 瓶后，在第17天融合率均未達到75%。例如當使用的間充質干細胞培養(yǎng)基中包含1重量份 L_Glutamine、0. 05 重量份 Gentamicin 和 84 重量份 DMEM-F12，以及 12 重量份 FBS、13. 5 重 量份FBS、16. 5重量份FBS、或18重量份FBS時，四種情況下，傳代至T25培養(yǎng)瓶后，在第17 天融合率均在53-76%之間。 在以上步驟的測試中，換液時間為細胞培養(yǎng)的第9天第一次全換液，往后為每2天 一次全換液，其中的任意換液時間在偏離上述時間10%以上時，貼壁細胞未在20天內達到 融合率80%。例如換液時間為細胞培養(yǎng)的第12天第一次全換液，或往后為每4天一次全換 液，兩種情況下，貼壁細胞在第22-25天達到80% 在以上步驟的測試中，消化液為把0. lg的I型膠原酶加入100ml的DMEM-F12，消 化時間為1. 5小時。在培養(yǎng)液中I型膠原酶含量偏離上述含量10%以上時，或在消化時間偏離上述時間10%以上時，組織里的全細胞不能高效分離，分離是否高效根據(jù)抽取小量樣 本的細胞計數(shù)判斷。實施例2、從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法參考實施例1的方法進行。消化后獲得的臍帶組織全細胞在培養(yǎng)的第8天開始有 貼壁細胞爬出，在第20天融合率達到90%。經(jīng)3代傳代后，細胞純度大于95%。實施例3、從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法參考實施例1的方法進行。消化后獲得的臍帶組織全細胞在培養(yǎng)的第7天開始有 貼壁細胞爬出，在第18天融合率達到90%。經(jīng)3代傳代后，細胞純度大于90%。實施例4、從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法參考實施例1的方法進行。消化后獲得的臍帶組織全細胞在培養(yǎng)的第7天開始有 貼壁細胞爬出，在第20天融合率達到90%。實施例5、從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法參考實施例1的方法進行。消化后獲得的臍帶組織全細胞在培養(yǎng)的第8天開始有 貼壁細胞爬出，在第19天融合率達到90%。實施例6、臍帶MSC的傳代培養(yǎng)及其凍存將實施例1-5任一項獲得的細胞進行消化，消化后取1 X 106細胞加入到1ml細胞 凍存液(含65份DMEM-F12+10份二甲基亞砜+15份人血白蛋白)中，經(jīng)過程序降溫最后進入 到液氮罐中凍存。實施例7、臍帶MSC的牛物學特件鑒定1、細胞牛長及其形杰學特點通過實施例1和實施例6的分離培養(yǎng)，臍帶單個核細胞培養(yǎng)72小時后在顯微鏡下 可明顯見到梭形貼壁細胞，10天左右會形成渦輪狀細胞克隆，消化傳代后會形成80%左右 融合的貼壁層。培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)這種細胞形態(tài)相對均一，增殖速度快，貼壁速度快，易被胰 酶消化，傳代至5-15代，其形態(tài)及生長特點亦無明顯改變。2、流式細胞術鑒定MSC表面標志分別取第3、6、9、12、15代細胞，流式細胞術檢測細胞表面標志，動態(tài)觀察培養(yǎng)過 程中細胞表面標志的變化。消化收集細胞，計數(shù)后取8X106個細胞，分裝16管；PBS洗一 次，1500rpm離心lOmin ;棄上清，殘留100 200 u 1，吹打混勻細胞；加入PE標記的⑶14、 CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗體以及 FITC 標記的 CD45、CD105、 HLA-ABC、HLA-DR、UEA-1抗體各10 yl，并設一管為空白對照；在4°C下，避光反應30min ； PBS洗一次，1500rpm離心lOmin ;直接標記的細胞棄上清，加入200 u 1 PBS吹打混勻細胞， 200 yl的1%多聚甲醛固定，置4°C待測，3天內上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測細胞的表面標志，動態(tài)觀察第3、6、9、12、15代的細胞，無明顯改 變。不表達造血細胞表面標志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及內皮細胞陽性)、⑶45 (白細胞陽 性)、CD54 (ICAM-1)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC_II 類分子)持續(xù)陰性，CD29 和 ⑶44 (纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質細胞表達)、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、 CD166 (間充質細胞表達)、HLA-ABC(MHC-I類分子)和UEA-1 (內皮細胞的表面標志)持續(xù) 為陽性。經(jīng)3代以上傳代后，細胞成分均一，純度在95%以上。3、流式細胞術檢測臍帶MSC的細胞周期
細胞長至80%左右融合時，消化收集細胞約1 X 106個，PBS洗一次，加入70%的乙 醇固定，4°C待測。檢測時，先離心去乙醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反應 30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，終濃度50 y g/ml) 1ml，室溫避光反應20min，上機檢
測細胞DNA含量。經(jīng)測定第3代和第6代細胞的DNA含量，細胞周期分析，期、S期和G2M期所 占比例分別為96. 35%,96. 66%，1. 11%,0. 09%，和2. 54%,3. 25%。結果表明體外培養(yǎng)的細胞具 有典型的干細胞增殖特點，即只有少數(shù)細胞處于活躍的增殖期(1. 11%、0. 09%)，大部分的細 胞處于靜息期(96. 35%、96. 66%)。4、臍帶MSC生長曲線的繪制及對數(shù)生長期倍增時間的測定取對數(shù)生長期細胞，消化計數(shù)，以10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液 (2X 104/ml)，24孔板中每孔接種0. 5ml,37°C，5%C02,飽和濕度下培養(yǎng)。每天取3復孔，臺 盼藍染色后計數(shù)活細胞數(shù)，計算平均值，連續(xù)觀察7天。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸， 繪制細胞生長曲線。以Patterson公式計算細胞在對數(shù)生長期的倍增時間，即Td=Tlg2/ Lg(Nt/No)，Td :倍增時間(h)，T :細胞由No增至Nt所用的時間(h)，N :細胞數(shù)。通過每天細胞計數(shù)的結果繪制細胞生長曲線，計算倍增時間。由細胞生長曲線可 以看出，細胞在第2-4天處于指數(shù)生長期。根據(jù)公式計算出第5代細胞在指數(shù)生長期的倍 增時間在18-30小時范圍內。5、臍帶MSC多向分化潛能的鑒定(1)成骨誘導3代以上MSC，按1 X 105/孔接種六孔板，放于37°C、5%C02、飽和濕度下，MSC培養(yǎng)基 中培養(yǎng)24h后，換用含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG并加入地塞米松0. 1 u M、抗壞血酸磷酸 鹽50iiM、磷酸甘油10mM，放于37°C、5%C02、在飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，共誘 導2-4周。堿性磷酸酶染色鑒定成骨細胞形成，Von Kossa染色鑒定骨結節(jié)形成。在含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松0. 1 u M、抗壞血酸磷酸鹽50 u M、 3 -磷酸甘油10mM培養(yǎng)1周，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，由紡錘形的成纖維細胞樣變?yōu)槎?角形，類似于神經(jīng)元細胞樣，細胞周邊出現(xiàn)長絲狀突出，并可向周圍延伸。繼續(xù)培養(yǎng)2周以 上后，細胞基質中出現(xiàn)鈣化斑，礦化物逐漸出現(xiàn)，并且開始形成多層小結結構，至培養(yǎng)4周 后，可見明顯鈣化結節(jié)。2周時堿性磷酸酶染色呈強陽性反應，達到95%以上，而未加以誘 導的對照組則大部分為陰性，只有不到5%顯示為弱陽性，表明細胞已向成骨細胞轉化。von Kossa染色可將骨結節(jié)中沉積的鈣染成黑色，誘導組可見大量的黑色骨結節(jié)，有明顯的立體 結構，而對照組在任何時間都沒有陽性反應。
_9] (2)成脂肪誘導 3代以上MSC，按1 X 105/孔接種于六孔板，放于37°C、5%C02、飽和濕度下，在MSC 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10%經(jīng)篩選FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松1 y M、消炎痛 60 u M、IBMX 0. 5mM、胰島素5 u g/ml，放于37°C，5%C02，飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液， 共誘導2周，油紅染色鑒定脂滴形成。 在含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松1 y M、消炎痛200 u M、IBMX 0. 5mM、 胰島素10 u g/ml培養(yǎng)3天，細胞即發(fā)生形態(tài)改變，由紡錘形的成纖維細胞樣逐漸收縮變 短，90%以上細胞成為立方形或多角形；連續(xù)培養(yǎng)7天，鏡下可見細胞內有微小脂滴出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，脂滴逐漸增大并融合，至培養(yǎng)2周時，可見融合成團的脂滴充滿整個細 胞。油紅0染色可見細胞內產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色。(3)成軟骨誘導3代以上細胞，按照每管2X 105細胞分裝到15ml聚丙烯離心管，低速離心使 細胞在試管中形成微團，在含2. 5%FBS的DMEM-HG中加入胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉各 6. 25 u g/ml, BSA 1. 25 u g/ml,丙麗酸納 ImM/L,抗壞血酸憐酸 37. 5 u g/ml, TGF- 3 jOng/ ml，放于37°C、5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)2周。誘導2周后將細胞微團打散涂片，阿辛藍(Alcian blue)染色可見II型膠原形成 細胞外基質呈藍色，對照組無藍染。通過以上一系列數(shù)據(jù)指標的檢測，顯示出應用本發(fā)明方法分離得到的MSC，具有向 成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞分化的能力，證實本發(fā)明方法獲得的MSC具有干細胞特性。實施例8、臍帶干細胞庫的建立1、細胞活性的檢測利用臺盼藍染色法計數(shù)凍存前后活細胞的數(shù)目。2、細胞污染的檢測利用少量細胞培養(yǎng)，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。利用病原學方法，檢測 細胞是否受到乙肝兩對半、丙肝、艾滋、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、 HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST 感染。3、遺傳病的檢測利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。4、HLA-ABC/DR 配型檢測細胞HLA-ABC/DR表型，并記錄在案。5、細胞來源的調杳記錄胎兒及其父母的詳細資料，并記錄在案。6、臍帶干細胞數(shù)據(jù)庫的津立在保存正常的臍帶干細胞后，建立臍帶干細胞的數(shù)據(jù)庫，其中包括前五項資料，并 建立與凍存細胞的關聯(lián)。
權利要求
1.從臍帶新鮮組織中分離和擴增間充質干細胞的方法，該方法包括以下步驟 (1)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶剪開，平鋪，通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗臍帶組織，以減少臍帶組織上紅細胞； (2)消化處理將步驟(I)得到的臍帶組織剪成組織塊，將組織塊放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型膠原酶、DMEM-F12)中，消化處理0. 5-3小時(例如1_2小時，例如I. 5小時)，過濾清除組織塊后，加入間充質干細胞培養(yǎng)基以終止消化，然后對消化得到的細胞進行細胞清洗，最終獲得細胞懸液； (3)細胞培養(yǎng)將步驟(2)得到的細胞懸液放入培養(yǎng)容器，再將培養(yǎng)容器放進培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)時將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，補加適量(例如3ml)間充質干細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第8-11天(例如第9天)時將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，進行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每1-3天(例如2天)進行一次全換液； (4)細胞傳代當培養(yǎng)容器中的貼壁細胞融合率達到40%-70%(例如60%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)將貼壁細胞脫離容器底部,離心,抽走上清液,加入充質干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再接種于培養(yǎng)容器進行傳代并進行擴增培養(yǎng)，此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得臍帶間充質干細胞，必要時進行傳代； 以及任選的下列一個或多個步驟 (5)針對步驟(4)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少ー項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型； (6)將步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。
2.根據(jù)權利要求I的方法，其中所述臍帶是臍帶的新鮮離體組織。
3.根據(jù)權利要求I的方法，其中步驟(2)中，剪碎的組織是大小約0.2-2. 5立方厘米。
4.根據(jù)權利要求I的方法，其中步驟⑵中，消化處理的時間為1-2.5小時。
5.根據(jù)權利要求I的方法，其中所述間充質干細胞培養(yǎng)基中包含F(xiàn)BS、L-Glutamine,Gentamicin 和 DMEM-F12。
6.根據(jù)權利要求I的方法，其中 所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有10-20%的FBS ； 所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有0. 5-2%的L-Glutamine ； 所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有0. 02-0. 1%的Gentamicin ;和/或 所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有80-90%的DMEM-F12。
7.根據(jù)權利要求I的方法，其中所述間充質干細胞培養(yǎng)基中含有約15重量份的FBS、約I重量份的L-Glutamine、約0. 05重量份的Gentamicin和約84重量份的DMEM-F12。
8.根據(jù)權利要求I的方法，該方法包括以下步驟 (1)消毒和清洗在生物安全柜內，用酒精對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶從中間剪開，平鋪在無菌IOcm細胞培養(yǎng)平皿上，利用PBS緩沖液清洗組織，以減少組織上面的紅細胞； (2)消化處理把0.Ig的I型膠原酶加入IOOml的DMEM-F12，然后用20iim過濾器過濾得到消化液，將步驟(I)得到的臍帶組織轉移至另ー個IOcm細胞培養(yǎng)平皿中，把臍帶組織剪成Icm3大小的組織塊，把組織塊放入已配好的消化液里，在37°C的恒溫搖床里消化I. 5小時，利用100 濾網(wǎng)清除余下的組織塊，按I: I的體積比加入間充質干細胞培養(yǎng)基(15%FBS+l%L-Glutamine+0. 05%Gentamicin+84%DMEM-F12)以終止消化，以轉速 1250rpm 離心 10分鐘，把上清液去掉并加入PBS緩沖液重懸細胞后再以轉速1250rpm離心10分鐘，去上清并加入間充質干細胞培養(yǎng)基，抽取小量樣本進行細胞計數(shù)； (3)細胞培養(yǎng)將步驟(2)得到的細胞懸液加入T25細胞培養(yǎng)瓶里，把T25細胞培養(yǎng)瓶放進CO2濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5天時將T25細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，補加3ml間充質干細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第9天時將T25細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每2天進行一次全換液； (4)細胞傳代當T25細胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞融合率達到60%以后，利用消化酶(TrypLe Express)將貼壁細胞脫離T25細胞培養(yǎng)瓶底部，離心，抽走上清液，加入充質干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再接種于T25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代并進行擴增培養(yǎng)，此后每2天換液一次，直至融合率達到80%，即得臍帶間充質干細胞，必要時進行傳代； 和任選地， 針對以上步驟(4)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少ー項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；和/或 將以上步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中凍存，備用。
9.建立臍帶干細胞數(shù)據(jù)庫的方法，其包括權利要求1-8任一項所述方法的步驟，以及如下步驟將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相關數(shù)據(jù)，建立臍帶干細胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細胞進行關聯(lián)。
10.一種臍帶間充質干細胞，其是根據(jù)權利要求1-8任一項所述方法獲得的。
全文摘要
本發(fā)明涉及從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法。其包括如下步驟對臍帶組織進行消毒和清洗，將組織剪成塊狀，消化處理1-2.5小時，終止消化，對消化得到的細胞進行細胞清洗，獲得細胞懸液，將細胞懸液加入T25細胞培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3-6天并進行補，繼續(xù)培養(yǎng)，在第8-11天時進行第一次全換液，此后每1-3天進行一次全換液；當平皿內的貼壁細胞融合率達到50-70%左右時，使用消化酶使貼壁細胞脫離T25細胞培養(yǎng)瓶底部；離心去上清液，加入間充質干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再接種于T25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代并進行擴增培養(yǎng)，此后每1-3天換液一次，直至融合率達到70-90%后，即得臍帶間充質干細胞。本發(fā)明方法可有效用于分離和擴增間充質干細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102660501SQ201210159918
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權日2012年5月21日
發(fā)明者周丹, 朱業(yè)峰, 林卓衡, 陳俊峯 申請人:博雅干細胞科技有限公司