專(zhuān)利名稱：嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶及其晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到用X射線晶體衍射方法確定的一種嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)，屬于分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醒脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase, ALDH)在所有的生物體內(nèi)普遍存在,這一類(lèi)酶利用NAD+或NADP+作為輔酶因子將醛類(lèi)物質(zhì)氧化成羧基酸類(lèi)物質(zhì)。在生物體中，醛脫氫酶將細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)機(jī)體有毒的醛類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行氧化從而完成解毒過(guò)程。此外，在烷烴類(lèi)物質(zhì)降解的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中也有醛脫氫酶的參與，在這個(gè)過(guò)程中烷基醛作為反應(yīng)的中間產(chǎn)物出現(xiàn)，在醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變成羧基酸進(jìn)入到細(xì)菌下一步新陳代謝過(guò)程中。
很多細(xì)菌源的ALDH可以氧化較短鏈長(zhǎng)到中等鏈長(zhǎng)的烷基醛(C1-C14)，例如，Ishige等人分離到來(lái)源于不動(dòng)桿菌屬的菌株M-I中的Aldl，該酶可以氧化含有4-14個(gè)碳原子的烷基醛；0kibe等人分離到一種石油降解菌中的HD-1，其可以降解含有2-12個(gè)碳原子的燒基醒Jaureguibeitia等人分離到的紅串紅球菌中的ThcA,該酶可以氧化含有1_8個(gè)碳原子的烷基醛；Yamanaka等人分離得到的噬細(xì)胞菌屬的菌株KUC-I同樣也只能降解含有1-8個(gè)碳原子的烷基醛。據(jù)我們所知，到目前為止，沒(méi)有關(guān)于降解長(zhǎng)鏈烷醛(碳鏈長(zhǎng)度大于16個(gè)碳原子的烷醛)的醛脫氫酶的報(bào)道。為了更加深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2中參與正烷烴末端降解途徑中的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，本發(fā)明通過(guò)基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和懸滴氣相擴(kuò)散結(jié)晶方法獲得了該嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的晶體，并通過(guò)X射線衍射方法對(duì)醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)相同的公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過(guò)X射線衍射方法,確定嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrif icans) NG80-2中參與正燒烴末端降解途徑中的嗜熱長(zhǎng)鏈燒醒醒脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步研究該醛脫氫酶的降解機(jī)理、理解其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，及將該酶用于環(huán)境石油污染治理中提供理論上的指導(dǎo)。本發(fā)明中涉及的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶其底物為從甲醛到二十烷醛的直鏈烷醛以及幾種芳香醛包括苯甲醛、苯乙醛、鄰苯二醛和鄰氯苯甲醛。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該醛脫氫酶屬于第14個(gè)ALDH家族的脂肪族子群，該家族中包含的醛脫氫酶作用的底物不具有很強(qiáng)的特異性。在石油烴降解途徑中，長(zhǎng)鏈烷醛脫氫酶是十分重要的關(guān)鍵酶，它能夠耐高溫并高效利用長(zhǎng)鏈烷醇脫氫酶的催化產(chǎn)物長(zhǎng)鏈烷醛，使其進(jìn)一步脫氫，提高烷烴降解途徑中的催化效率，對(duì)該酶的研究為深入研究嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2降解長(zhǎng)鏈燒烴代謝途徑的機(jī)制提供了更有利的證據(jù)，也為探索其他烷烴降解菌的代謝途徑提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，該酶的嗜熱性及降解長(zhǎng)鏈烷醛的能力具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，可以應(yīng)用于石油污染物、石油廢水的處理過(guò)程及提高微生物石油采收率。為了更加深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans)NG80-2中參與正烷烴末端降解途徑中的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，本發(fā)明通過(guò)基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和懸滴氣相擴(kuò)散結(jié)晶方法獲得了醛脫氫酶的晶體，并通過(guò)X射線衍射方法對(duì)醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。本發(fā)明通過(guò)對(duì)含有嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans)NG80-2正烷烴降解途徑中的醛脫氫酶基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌E. coli甘油菌液，其載 體為pET-28a (+),接種到5ml經(jīng)過(guò)滅菌且添加了 100mg/l kanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)后,轉(zhuǎn)接到IL經(jīng)過(guò)滅菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)5-6個(gè)小時(shí)后，利用0. ImM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)，45°C下誘導(dǎo)2. 5個(gè)小時(shí)后利用離心機(jī)收集菌體，收集到的菌體在緩沖液50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，pH8. 0中重新溶解；利用超聲波破碎菌體的細(xì)胞壁并利用高速離心機(jī)進(jìn)行離心，離心后的上清液利用鎳離子金屬螯合親和層析柱進(jìn)行初步純化，洗脫下的蛋白質(zhì)濃縮后利用AKTA蛋白質(zhì)純化儀的陰離子交換柱ResourceQ和分子排阻凝膠色譜柱Superdex200 10/300GL進(jìn)行純化。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白酶的純度。在獲得電泳純(>95%)的蛋白酶后用Amicon超濾濃縮管(Millipore，USA)將其濃縮到較高濃度，然后使用懸滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行晶體培養(yǎng)。結(jié)晶條件的篩選使用Hampton(USA)公司的結(jié)晶條件篩選試劑盒。在獲得好的篩選條件后，即在該條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體的優(yōu)化培養(yǎng)。獲得的晶體在X光機(jī)上衍射。使用HKL2000，CCP4等軟件進(jìn)行處理，最終獲得該蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。對(duì)結(jié)構(gòu)活性部位的保守殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過(guò)分子克隆一系列手段得到突變體菌株，并利用前述相同的步驟進(jìn)行突變體蛋白的純化，得到電泳純蛋白之后將醛脫氫酶的野生型蛋白和突變體蛋白同時(shí)進(jìn)行酶活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示突變體蛋白沒(méi)有酶活性。本發(fā)明所涉及的菌株為嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans)NG80-2，該菌株已于2004年10月09日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 1228，已申請(qǐng)國(guó)內(nèi)發(fā)明專(zhuān)利并獲得授權(quán)(發(fā)明名稱為《嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應(yīng)用》，專(zhuān)利號(hào)ZL200410072759. 7)。本發(fā)明提供的嗜熱脫氮芽孢桿菌內(nèi)的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶，其晶體結(jié)構(gòu)如下分辨率為22A晶體的空間群為C2221，晶體為四聚體，在每個(gè)不對(duì)稱單元中含有兩個(gè)分子。在A鏈中能夠看見(jiàn)1-477個(gè)殘基，在B鏈中能夠看到6-477個(gè)殘基；每個(gè)亞單位含有24個(gè)^片層和13個(gè)a螺旋；該單體的結(jié)構(gòu)含有一個(gè)特征性的ALDH折疊，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個(gè)輔酶結(jié)合域，包括殘基1-119，141-247和439-462，構(gòu)成一個(gè)羅斯曼折疊，用于結(jié)合輔酶NAD+ ;—個(gè)催化域，包括殘基248-43 ;—個(gè)寡聚化域，包括殘基120-140和463-477，用于二聚化。所述的醛脫氫酶的活性中心結(jié)構(gòu)特征為三個(gè)結(jié)構(gòu)域的交界面處構(gòu)成一個(gè)長(zhǎng)度為HA的漏斗形的通道，該通道有一個(gè)6xl2A的開(kāi)口通向催化口袋；該通道的核心部分排列著疏水殘基，這些疏水殘基允許底物進(jìn)入催化部位；起催化作用的殘基Cys281位于底物結(jié)合通道的最底部，這個(gè)殘基具有極性，這樣可以滿足去質(zhì)子化、親核攻擊并形成一個(gè)氧離子的催化需求；輔酶NAD+的結(jié)合位點(diǎn)處于一個(gè)由羅斯曼折疊形成的伸長(zhǎng)的口袋狀的輔酶結(jié)合域，該輔酶結(jié)合域處在催化域的對(duì)面。本發(fā)明所述的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)，經(jīng)如下步驟得到I、嗜熱脫氮芽抱桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans )NG80_2 基因組 DNA 的提取利用酌■抽提法從(Geobacillus thermodenitrif icans) NG80-2菌體中提取其基因組DNA。2、含有嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌E. coli的構(gòu)建I)以NG80-2的基因組DNA作為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增NG80-2的 aldh基因(GT3117)，擴(kuò)增引物分別為FPl:GTAGAATTCATGATTTACGCACAACCAGGCC 和RPl:AGGCTCGAGTTAGAACAAGCCGAGTTTTTTC。2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用EcoRI (Takara)和XhoI (Takara)進(jìn)行雙酶切，同時(shí)質(zhì)粒pET-28a(+) (Novagen)也利用相同的酶進(jìn)行雙酶切，以使目的基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒形成相同的黏性末端。在連接酶的作用下，將酶切后的目的基因片段連接到pET-28a(+)的質(zhì)粒中，形成重組質(zhì)粒。3)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21 (DE3) (Novagen)中；將菌液送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，以確定連接片段的正確性。將含有該醛脫氫酶基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌E. coli的菌液,接種到5ml經(jīng)過(guò)滅菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中過(guò)夜培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)后，轉(zhuǎn)到IL經(jīng)過(guò)滅菌且添加IOOmg/Ikanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5_6個(gè)小時(shí)后，經(jīng)高溫條件及低濃度IPTG誘導(dǎo)后，E. coli BL21大量表達(dá)有活性的醛脫氫酶。誘導(dǎo)結(jié)束后，利用離心機(jī)收集菌體，收集到的菌體在適當(dāng)?shù)木彌_液中重新溶解。3、蛋白酶的純化利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞壁并利用低溫高速離心機(jī)進(jìn)行離心，離心后的上清液利用鎳離子金屬螯合親和層析柱進(jìn)行初步純化，洗脫下的蛋白質(zhì)濃縮后利用AKTA蛋白質(zhì)純化儀的陰離子交換柱Resource Q和分子排阻凝膠色譜柱Superdex20010/300 GL進(jìn)行純化。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白酶的純度。4、蛋白酶的結(jié)晶I)通過(guò)以上純化步驟獲得電泳純的蛋白酶樣品，將此蛋白酶溶液加入Amicon(Millipore, USA)超濾濃縮管中于4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心濃縮,濃縮過(guò)程中將蛋白酶溶液中的300mM NaCl利用不含NaCl但其他組分相同的緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)档偷鞍酌溉芤褐械碾x子濃度，使NaCl濃度低于10mM。利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。2)將測(cè)定濃度后的蛋白酶溶液利用緩沖液稀釋至15mg/ml后,利用懸滴結(jié)晶法于pH6. 5(0. IM MES)U9%(w/v)PEG3350的結(jié)晶條件下獲得醛脫氫酶的晶體。5、晶體的X射線衍射和結(jié)構(gòu)解析蛋白酶晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)收集步驟如下首先使用Hampton Research公司的尼龍晶體環(huán)，從晶體浸泡液中獲取適宜X射線衍射的晶體,并迅速使用Oxford Cyrosystem公司的冷卻系統(tǒng)產(chǎn)生的低溫氮?dú)饬髦欣鋬鲋亮阆?50-180°C;使X射線通過(guò)晶體，利用旋進(jìn)法收集X射線衍射數(shù)據(jù)。收集到晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)后，按照下述步驟進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理首先使用HKL2000等軟件對(duì)上一步驟中收集得到的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等軟件，利用分子置換(MR，Molecular Replacement)方法，以人體肝臟中線粒體內(nèi)的醒脫氫酶(PDB code 1CW3)為搜索模型，得到蛋白酶ALDH的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明解析得到的醛脫氫酶的總體結(jié)構(gòu)特征如上所述。6、ALDH活性部位關(guān)鍵殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行重新構(gòu)建，利
將ALDH的301位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?Cys301Ala)，采用重疊延伸法進(jìn)行該
定點(diǎn)突變。I)根據(jù)ALDH的核苷酸序列及欲突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別為F:CGGGATCCATGATTTACGCACAACCAGG，R:CCGCTCGAGTTAGAACAAGCCGAGTTTTTTC 及FM301:CGAAGTGGCCACATGC,RM301:GCATGTGGCCACTTCG。以ALDH的核苷酸序列為模板，分別利用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增突變位點(diǎn)前端片段和后端片段，兩個(gè)PCR反應(yīng)中使用的引物分別為F/RM301，R/FM301。通過(guò)兩個(gè)PCR反應(yīng)，已經(jīng)將突變位點(diǎn)前后的核苷酸序列分別克隆完成。利用F/R—對(duì)引物，以前面反應(yīng)得到的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR，得到目的位點(diǎn)突變的ALDH的全長(zhǎng)核苷酸序列。2)將上步反應(yīng)中得到的定點(diǎn)突變的PCR產(chǎn)物利用BamHI (Takara)和XhoI (Takara)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，同時(shí)載體質(zhì)粒pET_28a(+) (Novagen)也利用相同的酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，以使PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒形成相同的黏性末端。在連接酶的作用下，將酶切后的目的基因片段連接到pET-28a(+)的質(zhì)粒中。3)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21(DE3) (Novagen)中；將菌液送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，以確定連接片段的正確性。經(jīng)高溫條件及低濃度IPTG誘導(dǎo)后，E. coli BL21大量表達(dá)突變體C301A醛脫氫酶。4)利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞壁并利用高速離心機(jī)進(jìn)行離心，離心后的上清液利用鎳離子金屬螯合親和層析柱進(jìn)行初步純化，洗脫下的蛋白質(zhì)濃縮后利用AKTA蛋白質(zhì)純化儀的陰離子交換柱Resource Q和分子排阻凝膠色譜柱Superdex20010/300GL進(jìn)行純化。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白酶的純度。5)進(jìn)行野生型蛋白酶ALDH和突變體蛋白酶ALDHM的酶活性檢測(cè)，檢測(cè)方法馮露等人2010年在《Microbiological Research》上發(fā)表的文章《Characterizationof a broad-range aldehyde dehydrogenase involved in alkane degradation inGeobacillus thermodenitrif icans NG80-2》中所述的ALDH的酶活實(shí)驗(yàn)中的方法并稍加改進(jìn)后進(jìn)行。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)混合物組成如下50mM Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液，ImM NAD+，lmM甲醛和0. ImM酶。不添加底物甲醛的上述混合物作為空白。將上述混合物混勻之后60°C水浴反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，野生型ALDH由于具有催化活性催化甲醛反應(yīng)，產(chǎn)物中的NADH在340nm波長(zhǎng)處具有吸收，光吸收值利用GeneQuant 1300型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組有一定的光吸收值是因?yàn)镹AD+在340nm處也有一定的吸收值，只不過(guò)比NADH要弱，野生型的光吸收值很高，顯示出醛脫氫酶催化甲醛反應(yīng)產(chǎn)生了較多的NADH，而突變體的光吸收值與空白對(duì)照組的光吸收值相當(dāng)，表明其反應(yīng)體系中并未產(chǎn)生NADH，也即突變體不具有活性，沒(méi)有催化底物甲醛進(jìn)行反應(yīng)。由此確定了決定醛脫氫酶的反應(yīng)活性的關(guān)鍵殘基，使我們對(duì)于醛脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)及功能行使有了更加深入的了解。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明涉及到一株嗜熱脫氮芽抱桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans)NG80-2中參與正烷烴末端降解途徑中的醛脫氫酶及其晶體結(jié)構(gòu)。該醛脫氫酶的特點(diǎn)在于其 能夠氧化碳鏈長(zhǎng)度大于十六的直鏈烷基醛，此外還能夠氧化幾種芳香醛。且該醛脫氫酶還具有熱穩(wěn)定性，能夠在溫度高達(dá)70°C時(shí)發(fā)揮降解功能。其較強(qiáng)的降解能力及自身的熱穩(wěn)定性使其在工業(yè)上及在石油類(lèi)物質(zhì)的環(huán)境污染修復(fù)和治理上有很強(qiáng)應(yīng)用的潛力。此外，通過(guò)對(duì)其三維結(jié)構(gòu)分析，揭示其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，為進(jìn)一步提高醛脫氫酶的降解活性提供理論上的指導(dǎo)。


圖I為醛脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)的飄帶模型。由圖可知該醛脫氫酶為四聚體，一個(gè)亞基含有24個(gè)0片層和13個(gè)a螺旋。該亞基的結(jié)構(gòu)含有一個(gè)特征性的ALDH折疊，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個(gè)輔酶結(jié)合域，包括殘基1-119，141-247和439-462，含有一個(gè)羅斯曼折疊，用于結(jié)合輔酶NAD+ ;—個(gè)催化域，包括殘基248-438 個(gè)寡聚化域包括殘基120-140和463-477，用于單體二聚化。圖2為醛脫氫酶的底物結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。為了更加詳細(xì)的解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的具體實(shí)施例。下述實(shí)施例僅僅是用于解釋本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制本發(fā)明范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的分子構(gòu)建及蛋白純化I. Geobacillus thermodenitrif icans NG80-2 基因組 DNA 的提取I)將嗜熱脫氮芽抱桿菌 Geobacillus thermodenitrif icans NG80-2 接種于 LB 液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)；2)取其過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml，離心收集菌體；3)菌體懸于250 ii L 50mM Tris(pH8. 0)緩沖液中，加入 10 y L 0. 4M EDTACpH8. 0),混勻后37°C保溫20min ；4)之后加入30 ii L 20mg/ml溶菌酶，混勻后37°C再保溫20min ；5)再加入5iiL 20mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20iiL 10%SDS，50°C保溫至
溶液澄清；
6)分別用等體積酚氯仿異戊醇抽提兩次，氯仿異戊醇抽提一次，最后一次的上清液，加入2. 5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100 u L TE緩沖液(PH8. 0，IOmM Tris, ImM EDTA)；7)加入10mg/ml RNase 2 ii L, 65°C保溫30min,分別用酹:氯仿:異戍醇、氯仿:異戊醇各抽提一次，上清液加入2. 5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50 y L TE緩沖液。2. Geobacillus thermodenitrif icans NG80-2 醒脫氫酶基因序列的獲得I) PCR擴(kuò)增體系
TemplateO.SpL
FPl0.5‘liL
RPI0.5 uL
dNTPsHiL
Hifi0.7‘liL
lO*Buffei 丨丨5j_iL
ddH2041.8^iL2) PCR反應(yīng)程序
1 !性(MT」5minI cycle
變性 94°CImin
退火 58 °CImin
延伸 72 °CImin32cycles
72'CIOmin
4"Cforever3. Geobacillus thermodenitrif icans NG80-2 醒脫氫酶基因序列 PCR 產(chǎn)物的回收PCR結(jié)束后，產(chǎn)物利用I %的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收I. 5kb的目的片段。具體步驟如下I)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察跑膠結(jié)果，切取目的片段放入I. 5ml滅菌的EP管中；2)在EP管中加入650 U L溶膠液，將EP管放入65°C水浴鍋中加熱，使膠塊溶解；3)將溶膠液分兩次加入樹(shù)脂柱中，冰上靜置2min，室溫下于離心機(jī)中12000rpm離心lmin。將管中液體倒回樹(shù)脂柱中重新結(jié)合一次，冰上靜置2min，室溫下于離心機(jī)中12000rpm離心lmin,棄去收集管中的液體；4)樹(shù)脂柱中加入600 ii L洗滌液，室溫放置2min后，于離心機(jī)中12000rpm離心lmin，棄去收集管中液體；重復(fù)此步驟一次；5)室溫下于尚心機(jī)中12000rpm尚心3min，使樹(shù)脂柱中酒精盡量減少；將樹(shù)脂柱轉(zhuǎn)移到1.5ml滅菌的EP管中；6)在樹(shù)脂柱上加入20iiL65°C預(yù)熱的TE溶液，室溫靜置3min，于離心機(jī)中12000rpm離心2min ;重復(fù)此步驟一次。
得到40 ii L醛脫氫酶基因。4. Geobacillus thermodenitrif icans NG80-2 醒脫氫酶基因序列 PCR 產(chǎn)物與載體的雙酶切將3中回收的目的片段PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pET_28a(+)同時(shí)進(jìn)行雙酶切，酶切體
系如下
10*H5wL
EcoRI:2f.iL
Xho!:2[iL·
CldH2O:KhiL
pET~28a(+) plasmid: IOOOng目的片段酶切體系與載體質(zhì)粒酶切體系相同，不同之處在于體系中添加的目的片段量為600ng。將反應(yīng)物全部加入滅菌后的EP管中，柔和混勻，于37°C水浴中進(jìn)行酶切，反應(yīng)18個(gè)小時(shí)以上。5. Geobacillus thermodenitrif icans NG80-2 醒脫氫酶基因序列 PCR 產(chǎn)物與載體的酶切產(chǎn)物的回收、連接酶切后的目的片段和載體質(zhì)粒進(jìn)行切膠回收，回收步驟同3?；厥战Y(jié)束后，進(jìn)行目的片段與載體質(zhì)粒的連接。連接反應(yīng)體系如下Solution I:5 U L載體質(zhì)粒0. 6 u L目的基因片段 4.5iiL反應(yīng)于16°C條件下進(jìn)行6小時(shí)。6.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E. coli trans5 aa.從_80°C冰箱中取出100 ii L感受態(tài)細(xì)胞懸液放在冰上解凍；b.將感受態(tài)細(xì)胞50 ii L加入到5中的連接產(chǎn)物中，冰浴30min ；c.冰浴結(jié)束后，將b中的反應(yīng)體系放入42°C水浴中熱激90s，熱激結(jié)束后，迅速轉(zhuǎn)入冰中冰浴2min ；d.冰浴結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入800 ii L LB培養(yǎng)基，于37°C搖床中振蕩培養(yǎng)90min ；e.振蕩培養(yǎng)結(jié)束后,將培養(yǎng)物取出，于離心機(jī)中4500rpm離心7min ;f.離心后，用移液槍將大部分上清吸去，剩余液體量50 ii L-IOOii L，再用移液槍將管底的菌體吹吸懸浮起來(lái)之后，轉(zhuǎn)移到含有100 mg/1 kanamycin抗生素的LB平板上，用推子推勻，37 °C培養(yǎng)十幾個(gè)小時(shí)。7.重組質(zhì)粒的酶切鑒定1)6中平板培養(yǎng)十幾個(gè)小時(shí)之后，平板表面會(huì)長(zhǎng)出許多菌落，挑取單克隆菌落于5ml經(jīng)高溫滅菌且添加了 100 mg/1 kanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，一共挑6個(gè),于37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；2)取3ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒的酶切鑒定。質(zhì)粒提取步驟按照博大泰克試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。質(zhì)粒酶切體系如下
EcoRI:IuL
Xhoi:IjiL 10嚇D BufferIliL
ddH2C):3,uL
recombinant plasmid:4jjL37°C水浴反應(yīng)一個(gè)小時(shí)后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳中含有兩段DNA片段，大小分別為I. 5kb和5. Okb左右，表明目的片段連接到了載體質(zhì)粒中，將質(zhì)粒送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。8.重組質(zhì)粒在E. coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)I)將帶有醛脫氫酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21轉(zhuǎn)化步驟與6中連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coli trans5 a步驟相同，只不過(guò)在體系中加入LB培養(yǎng)基后37°C振蕩培養(yǎng)時(shí)間為lh。菌液涂布在含有100mg/l kanamycin抗生素的平板上，于37 °C倒置培養(yǎng)12h。2) IPTG誘導(dǎo)醛脫氫酶的異源表達(dá)a.挑取平板上含有重組質(zhì)粒的單菌落接種于5ml的經(jīng)高溫滅菌、添加了 IOOmg/Ikanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；b.按1%接種量轉(zhuǎn)接添加了 100mg/l kanamycin抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37°C、200rpm 培養(yǎng) 5_6h，加入 0. ImM IPTG 后于 45°C誘導(dǎo) 2. 5h。9.醛脫氫酶ALDH的純化I)菌體收集a.將8中的液體培養(yǎng)液于5000rpm離心15min收集菌體,用ddH20沖洗兩次；b.按 IL 發(fā)酵液用 25ml 的 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl (pH8. 0)緩沖液的比例將
菌體重懸；2 )超聲波破碎獲得粗酶液將細(xì)胞重懸液放置于冰上，以40%的頻率，超聲4s后停6s的條件超聲，一個(gè)循環(huán)為10分鐘，超聲破碎約三個(gè)循環(huán)，直到重懸液完全清亮為止；破碎之后的菌液在4°C離心機(jī)中于18000rpm離心40min,離心結(jié)束之后棄去沉淀；3)粗酶液過(guò)親和層析柱a.選擇鎳離子金屬螯合親和層析柱；b.用 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl (pH8. 0)緩沖液將柱子平衡；c.將2)中得到的粗酶液加入到鎳柱中使目的蛋白與鎳介質(zhì)結(jié)合；粗酶液一共過(guò)3遍鎳柱；d.用50mM Tris-HCl, 300mM NaCl (pH8. 0)緩沖液沖洗柱子，將未與鎳介質(zhì)結(jié)合的雜質(zhì)洗去；e.用 IOOml 含有 40mM 咪唑的 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl (pH8. 0)緩沖液沖洗
柱子，將一些結(jié)合較弱的雜蛋白洗去；f.用含有300mM咪唑的50mM Tris-HCl，300mM NaCl緩沖液(pH8. 0)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；4)洗脫的酶液中鹽離子的稀釋及酶液的濃縮將收集的蛋白質(zhì)洗脫液加入到30kD濃縮管中，4°C條件下于離心機(jī)中4000rpm濃縮，同時(shí)利用50mM Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液稀釋蛋白質(zhì)溶液中的NaCl濃度，使其濃度低于 IOmM ；5)陰離子交換層析Resource Qa.用50mM Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液平衡陰離子交換柱，直到電導(dǎo)率、UV值不再變化為止； b.濃縮好的樣品轉(zhuǎn)移到I. 5ml EP管中，于4°C離心機(jī)中13300rpm離心lOmin，以
除去蛋白質(zhì)溶液中可能存在的固體顆粒雜質(zhì)和氣泡；c.通過(guò)六通閥進(jìn)行上樣，然后用50mM Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)以lml/min的流速平衡柱子2個(gè)柱體積；d.待沖洗完層析柱，開(kāi)始梯度洗脫。洗脫條件為0-100%洗脫緩沖液(50mMTris-HCl, IM NaCl, pH8. 0)，流速為lml/min，同時(shí)根據(jù)A280的變化收集各洗脫峰；e.使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度，收集純度較高的部分濃縮；6)分子篩凝膠色譜柱 Superdex 20010/300 GLa.用 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl (pH8. 0)緩沖液平衡 Superdex 20010/300GL 分
子篩凝膠色譜柱至電導(dǎo)率保持不變；b.濃縮好的樣品轉(zhuǎn)移到I. 5ml EP管中，于4°C離心機(jī)中13300rpm離心lOmin，以
除去蛋白質(zhì)溶液中可能存在的固體顆粒雜質(zhì)和氣泡；c.通過(guò)六通閥進(jìn)行上樣，然后在50mM Tris-HCl, 300mM NaCl (pH8. 0)緩沖液條件下以流速0. 5ml/min洗脫。根據(jù)A280的變化收集各洗脫峰；d.使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度，收集純度較高的部分濃縮；濃縮過(guò)程中同時(shí)對(duì)NaCl進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊錆舛鹊陀贗OmM ；e.蛋白樣品稀釋好后，利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例2、嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶蛋白的結(jié)晶及數(shù)據(jù)收集、解析I.純化后的醛脫氫酶的結(jié)晶及結(jié)構(gòu)分析I)醛脫氫酶結(jié)晶a.將純化后的醒脫氫酶濃度稀釋到10mg/ml和20mg/ml ；b.利用Hampton Research公司的結(jié)晶試劑盒進(jìn)行晶體初篩，晶體板置于16°C ;經(jīng)過(guò)一段時(shí)間觀察，發(fā)現(xiàn)在Index 43號(hào)中有晶體生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)較好；以此條件為基礎(chǔ)條件，進(jìn)行醛脫氫酶結(jié)晶條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；c.在注射器中填入高真空硅脂，在24孔懸滴晶體板上，每個(gè)培養(yǎng)孔邊上畫(huà)一個(gè)2mm寬的娃脂圈；d.將結(jié)晶條件中的pH緩沖液條件和沉淀劑PEG3350的濃度分別拉一個(gè)濃度梯度進(jìn)行池液的配比；e.將經(jīng)過(guò)硅化的玻璃片放在干凈的濾紙上，利用微量移液槍吸取I U L蛋白質(zhì)溶液，再吸取I U L池液加到蛋白質(zhì)溶液上；f.用手指捏住蓋玻片邊緣，將其翻轉(zhuǎn)，使液滴懸垂在蓋玻片下，將蓋玻片置于晶體板相應(yīng)的孔上，保證蓋玻片邊緣將孔密閉；g.用手指將蓋玻片均勻而有力的壓合在孔上；
h.將晶體板的蓋子蓋上,置于16°C生長(zhǎng)。2)醛脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的收集及結(jié)構(gòu)解析通過(guò)懸滴擴(kuò)散法獲得醛脫氫酶的晶體，該晶體數(shù)據(jù)在100K的低溫條件下利用RAXIS-IV探測(cè)器收集數(shù)據(jù)。衍射數(shù)據(jù)利用HKL2000軟件包進(jìn)行處理，醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)以人體肝臟線粒體中的醛脫氫酶(PDBCOde:lCW3)作為搜索模型，應(yīng)用PHASER程序通過(guò)分子置換來(lái)獲得初始相位。醛脫氫酶的晶體屬于C2221空間群。晶體結(jié)構(gòu)的衍射數(shù)據(jù)參見(jiàn)表I。表I晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和修正
權(quán)利要求
1.一種嗜熱脫氮芽孢桿菌內(nèi)的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶，其特征在于該嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)如下分辨率為2 晶體的空間群為C2221，晶體為四聚體，在每個(gè)不對(duì)稱單元中含有兩個(gè)分子。在A鏈中能夠看見(jiàn)1-477個(gè)殘基，在B鏈中能夠看到6-477個(gè)殘基；每個(gè)亞單位含有24個(gè)3片層和13個(gè)a螺旋；該單體的結(jié)構(gòu)含有一個(gè)特征性的ALDH折疊，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個(gè)輔酶結(jié)合域，包括殘基1-119，141-247和439-462，構(gòu)成一個(gè)羅斯曼折疊，用于結(jié)合輔酶NAD+;—個(gè)催化域，包括殘基248-43 ;—個(gè)寡聚化域，包括殘基120-140 和 463-477，用于二聚化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶，其特征在于所述的醛脫氫酶的活性中心結(jié)構(gòu)特征為三個(gè)結(jié)構(gòu)域的交界面處構(gòu)成一個(gè)長(zhǎng)度為15A的漏斗形的通道，該通道有一個(gè)6x 12A的開(kāi)口通向催化口袋；該通道的核心部分排列著疏水殘基，這些疏水殘基允許底物進(jìn)入催化部位；起催化作用的殘基Cys281位于底物結(jié)合通道的最底部，這個(gè)殘基具有極性，這樣可以滿足去質(zhì)子化、親核攻擊并形成一個(gè)氧離子的催化需求；輔酶NAD+的結(jié)合位點(diǎn)處于一個(gè)由羅斯曼折疊形成的伸長(zhǎng)的口袋狀的輔酶結(jié)合域，該輔酶結(jié)合域處在催化域的對(duì)面。
3.—種權(quán)利要求I所述的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)的確定方法，其特征在于經(jīng)如下步驟得到 a.利用酌■抽提法從嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrifcans)NG80-2菌體中提取其基因組DNA ;利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增該嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶基因，利用分子生物學(xué)方法將該基因克隆到大腸桿菌E. coli中； b.將含有該嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli的菌液，載體為pET-28a(+),接種到5ml經(jīng)過(guò)滅菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中過(guò)夜培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)后,轉(zhuǎn)到IL經(jīng)過(guò)滅菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)5-6個(gè)小時(shí)后，利用終濃度為0. ImM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)，45°C下誘導(dǎo)2. 5個(gè)小時(shí)后利用離心機(jī)收集菌體，收集到的菌體在pH8. 0的緩沖液50mM Tris-HCl, 300mM NaCl中重新溶解； c.利用超聲波破碎步驟b中得到的菌體的細(xì)胞壁并利用高速離心機(jī)進(jìn)行離心，離心后的上清液利用鎳離子金屬螯合親和層析柱進(jìn)行初步純化，洗脫下的蛋白質(zhì)濃縮后利用AKTA蛋白質(zhì)純化儀的陰離子交換柱Resource Q和分子篩凝膠色譜柱Superdex20010/300GL進(jìn)行純化，得到電泳純的蛋白酶； d.將電泳純蛋白酶樣品通過(guò)懸滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行結(jié)晶，得到適宜X射線衍射的醛脫氫酶的蛋白質(zhì)晶體； e.利用X射線衍射法對(duì)步驟d中得到的醛脫氫酶的蛋白質(zhì)晶體進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，在收集到醛脫氫酶的X射線衍射數(shù)據(jù)后，首先使用HKL2000對(duì)收集得到的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件；再使用CCP4程序包中的Phaser軟件，利用分子置換(MR，MolecularReplacement)方法得到如權(quán)利要求I所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌中的醛脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)； f.通過(guò)對(duì)步驟e中得到的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對(duì)其活性部位的保守殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，利用重疊延伸法得到保守位點(diǎn)突變的該醛脫氫酶基因，利用a中的步驟得到突變體菌株，并利用b、c中的步驟進(jìn)行突變體蛋白的純化，得到電泳純蛋白之后將c中得到的蛋白和本步 驟中得到的突變體蛋白同時(shí)進(jìn)行酶活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示突變體蛋白沒(méi)有酶活性，顯示出突變位點(diǎn)殘基對(duì)于酶功能的發(fā)揮具有重 要作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株嗜熱脫氮芽孢桿菌的正烷烴末端降解途徑中的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醛醛脫氫酶及其晶體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明利用分子克隆方法將目的基因克隆到大腸桿菌E.coli中進(jìn)行異源表達(dá)。通過(guò)蛋白質(zhì)純化方法獲得醛脫氫酶的純品。利用懸滴結(jié)晶法得到適宜衍射的醛脫氫酶的結(jié)晶。利用X射線衍射方法對(duì)醛脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。結(jié)果表明，該醛脫氫酶中含有一個(gè)特征性的ALDH折疊，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。對(duì)酶活性部位的保守殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過(guò)該酶的野生型及其突變體的酶活性實(shí)驗(yàn)證明保守殘基對(duì)酶活性的影響。這些結(jié)果能全方位反應(yīng)該酶的空間構(gòu)象，為進(jìn)一步研究醛脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、提高酶的降解活性提供理論上的指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102676464SQ20121015684
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者毛冠男, 王瑩瑩, 紀(jì)玉蕊, 郝振宇, 馬克·巴特蘭姆 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)