專利名稱：：細(xì)胞滲透的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及滲透有細(xì)胞壁的活細(xì)胞的方法以及將物質(zhì)導(dǎo)入這種細(xì)胞的方法?，F(xiàn)代分子生物和生化中的許多方法需要將不同物質(zhì)導(dǎo)入活細(xì)胞。外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞通常導(dǎo)致基因型的可遺傳變化，這定義為轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。近來證明此技術(shù)是分子生物中最重要的技術(shù)之一，具體涉及遺傳工程和蛋白質(zhì)工程。此技術(shù)允許外源DNA在細(xì)胞中表達(dá)。這在研究基因轉(zhuǎn)錄中具有科學(xué)興趣且有廣泛的商業(yè)應(yīng)用，包括在簡便細(xì)胞類型中表達(dá)商業(yè)上有用基因產(chǎn)物。最近對將蛋白質(zhì)和藥物導(dǎo)入活細(xì)胞而不損壞細(xì)胞有興趣。發(fā)展這種技術(shù)時，一個要克服的顯著問題是細(xì)胞膜普遍的不透性。細(xì)胞膜通常甚至對于小分子是不透的，除非它們有親脂特性。細(xì)胞膜不透性的問題在有細(xì)胞壁的細(xì)胞中增加。細(xì)胞一般通過提供另外進(jìn)入的屏障來進(jìn)一步限制物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。原核生物細(xì)胞包膜可定義為細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，如果外膜存在可加上外膜。革蘭氏陰性細(xì)菌的肽聚糖細(xì)胞壁包括蛋白質(zhì)和多糖，位于細(xì)菌內(nèi)和外膜間的周質(zhì)間隙中。另外的革蘭氏陰性細(xì)菌外膜進(jìn)一步降低細(xì)胞包膜的滲透性。革蘭氏陽性細(xì)菌僅有單層膜(與革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)膜類似)但一般細(xì)胞壁更厚。在真核生物細(xì)胞中，植物和真菌細(xì)胞的纖維素細(xì)胞壁包括半纖維素與果膠交織的纖維素微纖維。細(xì)胞壁提供的另外強度和滲透性減少指一些適于動物細(xì)胞(沒有細(xì)胞壁)的轉(zhuǎn)染方法不適于有細(xì)胞壁的細(xì)胞，如細(xì)菌、真菌和植物細(xì)胞。設(shè)計了一些方法用于滲透細(xì)胞并從而能導(dǎo)入外源DNA或其它物質(zhì)。早期方法包括使DNA結(jié)合顆粒如二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素或羥磷灰石以及加入能吸收含DNA顆粒的預(yù)處理細(xì)胞。用氯化鈣處理，有時結(jié)合低溫和隨后的熱激，常用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。磷酸鈣共沉淀提供將DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的一般方法。最近發(fā)展的方法使用負(fù)荷DNA的脂質(zhì)體，可與細(xì)胞融合。稱為電穿孔的進(jìn)一步技術(shù)包括使細(xì)胞接受熱激，熱激引起細(xì)胞中的孔形成。在Biotechniques，17卷No.61994，118-1125頁，Clarke等，揭示的方法用壓緊-調(diào)節(jié)的過程將染料、蛋白質(zhì)和質(zhì)粒DN導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用于有細(xì)胞壁的細(xì)胞時，上述方法的主要問題是外源物質(zhì)的吸收效率很低或甚至完全不能檢測。處理此問題的一種方法是去除細(xì)胞壁。去除細(xì)胞壁的原核和真核生物細(xì)胞一般稱為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體一般比有細(xì)胞壁的細(xì)胞更易進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，通過去除細(xì)胞壁可使革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)更易進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化(Chang和Cohen，Mol.Gen.Genetics168，111-115，1979)。生成植物細(xì)胞原生質(zhì)體可通過用纖維素酶和果膠酶處理懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織或完整組織。用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化酵母首先通過來自釀酒酵母(Saccharomycescervisiae)(Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75，1929-33，1978)的原生質(zhì)球完成。然而，用原生質(zhì)體的一個劣勢是將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞后要再生細(xì)胞壁。再生培養(yǎng)基可以是營養(yǎng)復(fù)雜的，具體用于革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草芽孢桿菌。酵母球芽細(xì)胞需要在固體瓊脂基質(zhì)中再生，使隨后的細(xì)胞恢復(fù)困難。整體上，再生細(xì)胞壁的過程緩慢且不方便。即使通過上述方法將原生質(zhì)體用于導(dǎo)入物質(zhì)到細(xì)胞時，轉(zhuǎn)染效率通常較低。此外，大部分細(xì)胞通過上面的處理來殺死。即使細(xì)胞壁的短期損傷使它更具滲透性，往往導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這是與電穿孔相關(guān)的具體問題。此外，Clarke等的方法中僅有限數(shù)量的細(xì)胞可以單次處理轉(zhuǎn)染。WO01/05994提供的轉(zhuǎn)染方法包括低概率細(xì)胞死亡。此文獻(xiàn)的方法主要針對用低壓通過在細(xì)胞膜中形成孔來導(dǎo)入物質(zhì)到細(xì)胞中，一般使用噴射技術(shù)。此文獻(xiàn)是特別關(guān)于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。具體的是，WO01/05994的方法優(yōu)選應(yīng)用于動物細(xì)胞或原生質(zhì)體，其中細(xì)胞壁在轉(zhuǎn)染前必須去除。由于細(xì)胞壁或細(xì)胞包膜相關(guān)的滲透性受損，WO01/05994所述方法不適于將物質(zhì)導(dǎo)入含細(xì)胞包膜或細(xì)胞壁的細(xì)胞。因此需要改進(jìn)的方法用于滲透有細(xì)胞壁的細(xì)胞。此外，需要改進(jìn)的方法將物質(zhì)導(dǎo)入有細(xì)胞壁的細(xì)胞。本發(fā)明目標(biāo)是克服上述缺點并提供滲透有細(xì)胞壁的細(xì)胞的有效方法，從而使物質(zhì)如核酸能進(jìn)入細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供方法用于滲透有細(xì)胞壁的活細(xì)胞，包括加壓與細(xì)胞表面接觸的流體或凝膠，隨后減壓流體或凝膠從而在細(xì)胞表面形成至少一個孔。不受理論約束，認(rèn)為流體或凝膠的壓力變化導(dǎo)致細(xì)胞膜彎曲，從而在細(xì)胞膜中形成一個瞬時的孔。如果氣泡由于減壓形成，可通過它們形成瞬時的孔并完成轉(zhuǎn)染。同樣不受理論約束，認(rèn)為細(xì)胞膜附近形成的氣泡與膜本身相互作用可在膜中形成瞬時的孔。因此，在本發(fā)明一些實施方案中，優(yōu)選的是減壓流體或凝膠產(chǎn)生能在細(xì)胞表面形成至少一個孔的氣泡。在另一方面，本發(fā)明提供方法用于將物質(zhì)導(dǎo)入有細(xì)胞壁的細(xì)胞，包括通過上述定義方法滲透活細(xì)胞的方法，其中至少一個孔促進(jìn)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明方法有利地使細(xì)胞的細(xì)胞膜中形成瞬時的孔，從而增加細(xì)胞對一些物質(zhì)的滲透性。細(xì)胞膜是圍繞細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)膜，在革蘭氏陰性細(xì)菌中指位于細(xì)胞壁下的內(nèi)膜。形成的孔不會顯著減少大部分細(xì)胞的存活力，因此細(xì)胞死亡概率一般比一些現(xiàn)有技術(shù)方法如電穿孔低許多。此方法能滲透有細(xì)胞壁的細(xì)胞，不需如以原生質(zhì)體為基礎(chǔ)的方法那樣完全去除細(xì)胞壁。此外，細(xì)胞壁不需如以原生質(zhì)體為基礎(chǔ)的方法那樣在過程后再生。根據(jù)本發(fā)明通過加壓/減壓過程獲得令人驚訝的滲透性。因此本發(fā)明提供滲透有細(xì)胞壁的細(xì)胞的快速和有效方法。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，認(rèn)為形成的氣泡有助于在有細(xì)胞壁的細(xì)胞膜形成至少一個洞或孔。不受理論約束，認(rèn)為這些實施方案中的氣泡尺寸和它們的組成(根據(jù)流體或凝膠和氣泡的組成)足夠使氣泡在細(xì)胞膜中形成。在本發(fā)明所有實施方案中，細(xì)胞膜中的孔可包括細(xì)胞表面具體點的膜厚度減少或可包括從部分細(xì)胞表面完全去除細(xì)胞膜。如果孔大小增加細(xì)胞滲透性，它不特別受限制。優(yōu)選的孔也應(yīng)足夠大從而有害地影響細(xì)胞功能。通過減少細(xì)胞膜對進(jìn)入的屏障，孔優(yōu)選促進(jìn)外源物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞。通常，滲透本發(fā)明細(xì)胞的方法使細(xì)胞滲透性增加到足夠程度，從而外源物質(zhì)如核酸可導(dǎo)入細(xì)胞而不需要進(jìn)一步的處理以增加細(xì)胞滲透性。另外，在一些實施方法中，本發(fā)明方法可結(jié)合一種現(xiàn)有技術(shù)方法，如電穿孔或氯化鈣處理以進(jìn)一步提高方法的效率。現(xiàn)在僅通過例子進(jìn)一步描述發(fā)明，參考附圖，其中圖1顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案的設(shè)備示意圖，其中1是入口，2是出口，3是壓力計，4是壓力艙，5是針形閥且6是壓力艙內(nèi)表面涂層，確定保持凝膠或流體的隔室；圖2顯示根據(jù)本發(fā)明另外實施方案的設(shè)備示意圖，其中1是入口，，2是出口，3是壓力計，4是壓力艙，5是針形閥且7是位于壓力艙內(nèi)表面附近的容器以形成保持凝膠或流體的隔室；圖3顯示pGVT5基因構(gòu)建物。圖4顯示pJIT58基因構(gòu)建物。圖5顯示pAL156基因構(gòu)建物。圖6顯示pAL145基因構(gòu)建物。圖7顯示估計的轉(zhuǎn)染釀酒酵母的細(xì)胞存活百分比。圖8顯示釀酒酵母細(xì)胞在5MPa(50Barr)氣穿孔(aeroporation)后的生長速度；圖9顯示酵母細(xì)胞中細(xì)胞轉(zhuǎn)染的百分比。圖10顯示紅色熒光蛋白(RFP)載體、pDsRed1-C1的限制性酶切圖譜和多克隆位點(MCS)；圖11顯示綠色熒光蛋白(GFP)載體、pEGFP-C1的限制性酶切圖譜和多克隆位點(MCS)。本發(fā)明更佳的實施方案包括在流體或凝膠介質(zhì)中形成氣泡。現(xiàn)在更詳細(xì)討論這些實施方案和其它方面。在本方法中，驚訝的發(fā)現(xiàn)通常比大部分細(xì)胞更抗孔形成的有細(xì)胞壁的細(xì)胞可通過加壓/減壓過程來滲透。如上面所指，認(rèn)為減壓過程引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中或細(xì)胞膜和細(xì)胞壁間的氣泡形成。另外，認(rèn)為氣泡也可在細(xì)胞內(nèi)部、細(xì)胞膜結(jié)合的周圍形成。這些位點的氣泡形成也許破壞細(xì)胞表面局部點的細(xì)胞膜。認(rèn)為細(xì)胞的細(xì)胞壁保護(hù)細(xì)胞膜抗由氣泡形成或細(xì)胞壁外部破裂引起的滲透。認(rèn)為其它將空氣導(dǎo)入流體或凝膠以嘗試滲透細(xì)胞的方法(如噴射)對滲透有細(xì)胞壁的細(xì)胞無效，因為它們不影響細(xì)胞膜和細(xì)胞壁間的區(qū)域，如通過壓力變化或細(xì)胞膜和細(xì)胞壁間的氣泡形成導(dǎo)致細(xì)胞膜足夠彎曲。認(rèn)為本發(fā)明減壓步驟形成的氣泡具有充分能量(或表面張力)，與細(xì)胞相互作用(如接觸細(xì)胞膜，具體是接觸或很接近細(xì)胞膜時破裂)時在細(xì)胞膜中形成孔。認(rèn)為氣泡有足夠小的半徑很重要，從而它們的表面能量足以在細(xì)胞膜上穿孔。盡管孔根據(jù)本發(fā)明方法在細(xì)胞表面形成，細(xì)胞存活或功能的任何減少通常低于現(xiàn)有技術(shù)方法。細(xì)胞中形成的孔是瞬時的，維持一段足夠長時間的開放以使大分子如DNA和/或RNA流入細(xì)胞，但在影響細(xì)胞存活前重密封。例如，用本發(fā)明方法，細(xì)胞死亡小于25％且通常小于5％。在電穿孔過程中，細(xì)胞死亡可高至90％。甚至在此過程直接效果下存活的細(xì)胞可能在之后的24小時死亡。通常電穿孔通過壞死導(dǎo)致50％的細(xì)胞直接死亡，接著在此過程后24小時通過細(xì)胞調(diào)亡引起大部分的剩余50％細(xì)胞死亡。使用本發(fā)明后，壞死和/或細(xì)胞調(diào)亡通常引起低細(xì)胞死亡概率。氣泡可通過減壓過程在流體或凝膠中生成。減壓一般包括降低流體或凝膠所受壓力從而溶解氣體的溶解度減少，可導(dǎo)致液體中氣泡形成。不受理論約束，認(rèn)為流體或凝膠中的細(xì)胞作為核用于形成氣泡，從而氣泡在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁間形成和破裂。因此發(fā)明的優(yōu)勢是可在細(xì)胞膜附近形成具適當(dāng)表面能量的氣泡，用于滲透細(xì)胞、增加轉(zhuǎn)染效率。另外如上所述，此方法由于所用壓力變化如膜彎曲或變形可干擾細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁。這種干擾可導(dǎo)致細(xì)胞膜中弱點形成，依次引起膜暫時破裂。此破裂可采用膜中暫時孔、裂口或破處的形式，可轉(zhuǎn)染選擇的分子(如核酸分子)以進(jìn)入細(xì)胞。在本
發(fā)明內(nèi)容中，需要控制減壓過程中形成的任何氣泡的任意尺寸從而氣泡能在細(xì)胞中形成暫時的孔(具體是與細(xì)胞表面接觸時)。用減壓和具體用氣泡在細(xì)胞表面形成孔定義為‘氣穿孔’。優(yōu)選的是，任何氣泡的尺寸可與細(xì)胞尺寸相比。例如，優(yōu)選氣泡半徑范圍從約三分之一的細(xì)胞半徑到五倍的細(xì)胞半徑。根據(jù)本方法，加壓步驟引起流體或凝膠中溶解的氣體量增加。產(chǎn)生氣泡的速度、氣泡大小和氣泡表面能量可通過改變減壓步驟中壓力減少的速度和程度來控制。方法通常包括加壓流體或凝膠并在起始壓力保持流體或凝膠一段時間，隨后降低壓力，優(yōu)選形成氣泡。壓力減少一般為0.5MPa(5Barr)或更高，通常在0.5-11MPa(5-110Barr)范圍內(nèi)。它優(yōu)選在1-11MPa(10-110Barr)范圍內(nèi)，更優(yōu)選2-11MPa(20-110Barr)，更加優(yōu)選5-11MPa(50-110Barr)。在一些實施方案中，壓力降低可以從2-8MPa(20-80Barr)，更優(yōu)選3-8MPa(30-80Barr)，更加優(yōu)選4-8MPa(40-80Barr)，最優(yōu)選6-8MPa(60-80Barr)。減壓步驟中壓力減少越大，孔形成效率越高且因此轉(zhuǎn)染效率越高。然而，減壓步驟中壓力下降也提高引起細(xì)胞死亡的細(xì)胞損傷頻率。壓力減少可根據(jù)細(xì)胞類型和所用氣體最優(yōu)化以確?？自诩?xì)胞中形成，從而可導(dǎo)入物質(zhì)且同時最小化細(xì)胞存活的減少。認(rèn)為形成的氣泡表面能量可在細(xì)胞膜的孔形成中發(fā)揮作用。認(rèn)為可通過上面優(yōu)選范圍之一的壓力下降完成本發(fā)明來滲透大部分有細(xì)胞壁的細(xì)胞類型。使用更優(yōu)選的壓力范圍一般趨向增加存活和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比例。如果需要，可選擇起始壓力以促進(jìn)流體或凝膠中的初始?xì)怏w溶解。起始壓力一般是0.6MPa(6Barr)或更高，通常在0.6-11.1MPa(6-111Barr)范圍內(nèi)。它優(yōu)選在1.1-11.1MPa(11-111Barr)范圍內(nèi)，更優(yōu)選2.1-11.1MPa(21-111Barr)，更加優(yōu)選5.1-11.1MPa(51-111Barr)。在一些實施方案中，壓力降低可以從2.1-8.1MPa(21-81Barr)，更優(yōu)選3.1-8.1MPa(31-81Barr)，更加優(yōu)選4.1-8.1MPa(41-81Barr)，最優(yōu)選6.1-8.1MPa(61-81Barr)。使用的起始壓力和壓力減少可根據(jù)待滲透的細(xì)胞類型適當(dāng)改變。在一個實施方案中，當(dāng)細(xì)胞是水稻細(xì)胞時，在減壓到大氣壓前使用2.1-3.1MPa(21-31Barr)的相對較低起始壓力。在另一個實施方案中，當(dāng)細(xì)胞是玉米細(xì)胞時，使用6.1-7.1MPa(61-71Barr)的更高起始壓力。如果沒有不利地影響轉(zhuǎn)染，保持在起始壓力的氣體時間長度無特別限制。通常，氣體保持在起始壓力1分鐘或更長，更優(yōu)選10分鐘或更長。一般壓力保持小于30分鐘。在一些實施方案中，壓力可保持5-20分鐘，更優(yōu)選10-20分鐘，更加優(yōu)選10-15分鐘。最優(yōu)選壓力保持約15分鐘。如果需要，可變化時間以改變流體或凝膠中初始溶解的氣體量。只要需要，可維持流體或凝膠中氣體的存在且可根據(jù)滲透細(xì)胞所用條件來確定，如所用氣體、溫度、壓力以及細(xì)胞類型和待導(dǎo)入細(xì)胞的物質(zhì)。將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的效率尤其對流體或凝膠受到增加壓力的時間長度敏感。壓力通常低于大氣壓(約0.1MPa，1Barr)。壓力優(yōu)選迅速降低，如通過突然減壓、通過使分離系統(tǒng)暴露于大氣。這可通過(例如)僅打開連接容器的閥或龍頭受影響，容器包括流體或凝膠。壓力降低優(yōu)選在小于30秒的間隔發(fā)生，更優(yōu)選小于10秒，最優(yōu)選小于1秒。產(chǎn)生任何來自減壓的氣泡可連續(xù)發(fā)生一段時間或在由間隔分開的兩個或更多脈沖中發(fā)生，在間隔中沒有生成顯著氣泡。因此壓力減少可在單個連續(xù)步驟中發(fā)生或壓力減少可在一系列步驟中發(fā)生，例如由間隔分開的0.1-1MPa(1-10Barr)，其中壓力恒定。加壓和減壓循環(huán)可重復(fù)一次或更多。在一個實施方案中，使用2或3個加壓/減壓循環(huán)，但優(yōu)選僅使用1個循環(huán)。在脈沖中產(chǎn)生氣泡的情況中，這種脈沖長度通常從1-10s。例如，脈沖長度可以從1-5s，由沒有氣體生成的類似長度段分開?？墒褂萌魏慰刂泼}沖持續(xù)時間的方法。通常脈沖持續(xù)時間可通過編程方法控制。例如這種方法包括可編程的定時器，用于控制方法以改變流體或凝膠上的壓力。如果氣體適于加壓和減壓流體或凝膠，用于本方法的氣體不必須限于任何具體的氣體。氣體優(yōu)選能形成與細(xì)胞相互作用的氣泡以在細(xì)胞膜中形成暫時的孔。適當(dāng)氣體可選自廣范圍的氣體，包括惰性氣體、非惰性氣體或一種或更多兩種類型氣體的混合物。氣體優(yōu)選是空氣，然而也可使用氧、氮、甲烷和惰性氣體如氦、氖和氬。此外，也可使用CO2，特別是需要維持具體水平的流體或凝膠pH。當(dāng)使用CO2時，一般在另一種氣體如空氣中使用5-7％的體積濃度。氣體不需是可溶的，但如果需要在流體或凝膠中形成氣泡，在方法進(jìn)行的條件下氣體應(yīng)該至少部分溶于流體或凝膠。本方法優(yōu)選在恒溫進(jìn)行，通常至37℃。優(yōu)選在室溫進(jìn)行，如從5-30℃，優(yōu)選從15-30℃。本方法的加壓和減壓步驟在流體或凝膠中完成。如果可為細(xì)胞耐受，流體或凝膠中存在的離子不受特別限制。當(dāng)細(xì)胞被滲透以促進(jìn)物質(zhì)如DNA進(jìn)入時，物質(zhì)在相同介質(zhì)中導(dǎo)入，流體或凝膠也必須適于轉(zhuǎn)染或其它導(dǎo)入過程。有適當(dāng)滲透壓的轉(zhuǎn)染介質(zhì)可用10倍濃度的Earle平衡鹽溶液(EBSS)制成(Earle，W.R.，1934，Arch.Exp.Zell.Forsch.，16卷，116頁)，EBSS含營養(yǎng)因子如堿基和所需稀釋。優(yōu)選的是待導(dǎo)入的物質(zhì)包含在流體或凝膠中。在此較佳實施方案中，將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的步驟幾乎與減壓步驟和(在一些實施方案中)流體或凝膠中形成氣泡同時。然而，假如物質(zhì)在細(xì)胞表面暫時的孔重密封前被導(dǎo)入，也可能當(dāng)細(xì)胞表面產(chǎn)生暫時的孔時，物質(zhì)可在減壓后與細(xì)胞接觸。所用流體或凝膠優(yōu)選是液體，更優(yōu)選水液體。液體可包括緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的滲透壓優(yōu)選大于100mOsM。滲透壓更優(yōu)選從300-600mOsM。使用此范圍內(nèi)滲透壓的液體趨向減少過程中的細(xì)胞裂解。在另外使用凝膠的實施方案中，凝膠優(yōu)選是含水凝膠。適當(dāng)凝膠包含細(xì)胞培養(yǎng)基如瓊脂凝膠。在此實施方案中，細(xì)胞通常在凝膠上培養(yǎng)。培養(yǎng)基中的物質(zhì)濃度沒有特別限制且可根據(jù)需導(dǎo)入細(xì)胞的物質(zhì)量來選擇。方便的濃度是0.2-10×10-8M，更優(yōu)選0.75-1.25×10-8M。流體或凝膠的深度沒有特別限制。流體或凝膠的深度通常為10cm或更小。流體或凝膠中的細(xì)胞濃度沒有特別限制。例如原核生物的濃度可以是1×109個細(xì)胞/ml。待導(dǎo)入的物質(zhì)可以是任何物質(zhì)。物質(zhì)優(yōu)選是不能正常穿越細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜的物質(zhì)。因此待導(dǎo)入的物質(zhì)優(yōu)選是親水性物質(zhì)，然而物質(zhì)也可以是疏水性的。任何生物分子或任何大分子可導(dǎo)入細(xì)胞。物質(zhì)一般具有100道爾頓或更大的分子量。在一個更佳實施方案中，物質(zhì)是核酸如DNA或RNA(如基因、質(zhì)粒、染色體、寡核苷酸或核苷酸序列)或其片斷或者表達(dá)載體。另外，物質(zhì)可以是生物活性分子如蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸、激素、多糖、染料或藥物劑如藥物。假如細(xì)胞有硬細(xì)胞壁且可存活，本發(fā)明方法根據(jù)細(xì)胞類型或樣品大小可應(yīng)用的細(xì)胞沒有特別限制。細(xì)胞優(yōu)選是活宿主細(xì)胞。這包括原核生物細(xì)胞和一些真核生物細(xì)胞，其中原核生物細(xì)胞壁是部分細(xì)胞包膜。因此適當(dāng)細(xì)胞包含的細(xì)胞來自植物、真菌(包括絲狀和非絲狀真菌如酵母)和細(xì)菌，包括形成孢子的細(xì)菌、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。方法不需要形成原生質(zhì)體，因此細(xì)胞壁優(yōu)選是未處理的細(xì)胞，其中細(xì)胞壁在滲透過程前沒有被去除、削弱、變薄或穿孔。使用本發(fā)明的方法可轉(zhuǎn)染細(xì)胞種群。這些細(xì)胞可以是例如細(xì)胞懸浮液形式或可以是固體表面或凝膠上的貼壁細(xì)胞。也可使用方法處理含細(xì)胞類型集合的細(xì)胞種群。單獨細(xì)胞類型的種群可用本方法滲透，或可處理完整組織、器官或生物體。在一個實施方案中細(xì)胞是花粉粒，而在另一個實施方案中滲透全植物。待處理的組織、器官或生物體可淹沒在流體中，或者另外流體可僅接觸組織、器官或生物體的部分表面。在一個實施方案中，流體噴射在器官表面如植物的葉。適當(dāng)組織類型包括可根據(jù)本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，細(xì)胞包括分裂組織、分解的葉細(xì)胞、葉盤、花粉、小孢子(＝未成熟花粉)、子葉、愈傷組織(calloustissue)、體細(xì)胞胚、胚物質(zhì)和所有懸浮培養(yǎng)組織(＝含細(xì)胞壁的分解細(xì)胞)。當(dāng)細(xì)胞是植物組織時，細(xì)胞可以來自被子植物(包括單子葉植物或雙子葉植物)或來自另一級的植物。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于玉米(Zeamays)、油菜(Brassicanapus，Brassicarapa屬)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、裸麥(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea屬)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘樹(Citrus屬)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa屬)、鱷梨(PerseaAmericana)、無花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄欖(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅果(Macadamiainterifolia)、杏仁(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹優(yōu)選的是，本發(fā)明的植物是農(nóng)作物，例如谷類或豆類、玉米、小麥、馬鈴薯、木薯(tapioca)、水稻、高粱、稷、木薯(cassava)、大麥、豌豆和其它根、塊莖或種子作物。重要的種子作物是含油種子油菜、糖用甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。本發(fā)明應(yīng)用的園藝植物可包括萵苣、菊苣、蕓苔植物以及石竹和天竺葵，蕓苔植物包括甘藍(lán)、花莖甘藍(lán)和花椰菜。本發(fā)明可應(yīng)用于煙草、葫蘆、胡蘿卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒、菊花、白楊、桉樹和松樹。產(chǎn)子植物提供農(nóng)藝上需要的感興趣的種子，包括含油種子植物、產(chǎn)生谷類種子的植物和豆類植物。農(nóng)藝上需要的種子包括谷物種子、如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、裸麥等。含油種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、含油種子油菜、玉米、紫花苜蓿、棕櫚和椰子等。豆類植物包括豆和豌豆。豆包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。本發(fā)明用于轉(zhuǎn)化任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。適當(dāng)?shù)母锾m氏陽性種類包括但不限于放射菌類如鏈霉菌(Streptomyces)屬、乳球菌(Lactococcus)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、枯草芽孢桿菌和雙歧桿菌(Bifidobacter)屬。適當(dāng)?shù)母锾m氏陰性種類包括大腸桿菌(Escherichiacoli)和幽門螺桿菌(Helicobaterpylori)。用于本發(fā)明的減壓方法沒有特別限制。典型的減壓方法包括保持流體或凝膠的可變化壓力的密封艙以及改變艙中壓力的方法。改變壓力的方法通常是連接密封艙的壓縮機(如壓縮氣體的汽缸)，用于增加艙中壓力和/或壓縮艙中氣體。假如密封艙能含液體且能經(jīng)受艙內(nèi)和外側(cè)間的壓力差異，它的大小和性質(zhì)沒有特別限制。假如改變壓力的方法能在艙內(nèi)和外側(cè)間產(chǎn)生壓力差異，它不受特別限制。減壓方法可由編程方法控制。通?？删幊痰亩〞r器用于控制減壓方法有效性。保存液體的容器在形狀或構(gòu)建的材料上沒有特別限制，可用玻璃或、塑料或其它方便的材料制成。保存液體的容器優(yōu)選是可密封的從而可改變壓力，容器與改變?nèi)萜髦袎毫Φ姆椒ㄏ嚓P(guān)。盡管用于完成本發(fā)明方法的方式?jīng)]有特別限制，優(yōu)選使用下述設(shè)備。本發(fā)明的設(shè)備用于將物質(zhì)導(dǎo)入有細(xì)胞壁的細(xì)胞，使用如上所述的方法，包括(a)導(dǎo)入氣體的入口；(b)入口進(jìn)入的壓力艙，艙具有顯著的幾何橫截面；(c)壓力艙內(nèi)的隔室，用于使細(xì)胞包含在流體或凝膠中；(d)任選的壓力計，用于監(jiān)控壓力艙中的壓力；(e)釋放壓力艙氣體的出口；其中，入口和出口包括在加壓時分隔壓力艙的閥。入口和出口優(yōu)選包括入口和出口管。假如導(dǎo)入的氣體能加壓通過入口的流體或凝膠且壓力可通過出口釋放，入口和出口的直徑?jīng)]有特別限制。優(yōu)選的入口和/或出口直徑為2-4mm。在本
發(fā)明內(nèi)容中，涉及壓力艙橫截面的術(shù)語“幾何”指橫截面有顯著統(tǒng)一的幾何形狀，即它是圓形(圓柱或球形壓力艙)、正方形或直線(立方形或矩形壓力艙)。優(yōu)選的是，壓力艙的幾何橫截面是柱狀的。在一個較佳實施方案中，使細(xì)胞包含在流體或凝膠中的隔室包括幾乎壓力艙全部內(nèi)表面。在此實施方案中，壓力艙內(nèi)表面通常包括生理可接受的涂布或?qū)?，如PTFE(Teflon)、不銹鋼或聚丙烯。在另外的實施方案中，使細(xì)胞包含在流體或凝膠中的隔室可包括位于壓力艙內(nèi)表面附近的容器。在這些實施方案中，優(yōu)選的是容器由壓力艙內(nèi)表面支持。一般容器內(nèi)表面包括生理可接受的涂布或?qū)?。在?br/>發(fā)明內(nèi)容中，這是指涂布或?qū)訉?xì)胞存活不是很有害。這種涂布或?qū)釉诒绢I(lǐng)域熟知。優(yōu)選的是隔室的較低部分可與上部分離以使流體或凝膠和細(xì)胞充滿隔室或容器。這也有利于清潔隔室和/或容器。隔室可通過螺桿機制或本領(lǐng)域已知的其它適當(dāng)機制來集合或分解。通常入口和/或出口中的閥包括針形閥，盡管閥的種類沒有特別限制，它足以如需要的分離壓力艙和控制其中的壓力。另一方面，本發(fā)明提供含細(xì)胞壁的滲透細(xì)胞，細(xì)胞可通過上述方法獲得，其中細(xì)胞表面包括至少一個能促進(jìn)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的孔。細(xì)胞表面的孔優(yōu)選包括細(xì)胞膜中的孔。通常使用本方法時，對細(xì)胞壁本身損害很小。因此細(xì)胞的細(xì)胞壁優(yōu)選是充分完整的。在一個較佳實施方案中，孔的位置使至少50％細(xì)胞表面的細(xì)胞膜是充分完整的。更優(yōu)選的是，至少70％細(xì)胞表面的細(xì)胞膜是充分完整的，最優(yōu)選的是，至少90％細(xì)胞表面的細(xì)胞膜是充分完整的。細(xì)胞的細(xì)胞膜同樣優(yōu)選包括能進(jìn)一步促進(jìn)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的孔。因為細(xì)胞壁不被本方法破壞，它不需再生。如果需要使用滲透細(xì)胞以導(dǎo)入物質(zhì)，優(yōu)選的是在與物質(zhì)生成幾乎同時或之后不久導(dǎo)入物質(zhì)。另外，可保存滲透細(xì)胞，通常在-20℃或更低直到所需溫度，隨后解凍細(xì)胞并用于之后的過程。本發(fā)明也提供減壓方法的使用以滲透細(xì)胞和/或?qū)⑽镔|(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞，其中細(xì)胞有細(xì)胞壁且減壓方法用于通過2-11MPa(20-110Barr)的步驟降低應(yīng)用于流體或凝膠的壓力，流體或凝膠包含細(xì)胞。在生命科學(xué)應(yīng)用中本發(fā)明尤其有用，包括將具體基因?qū)牖罴?xì)胞和/或聚集用于表達(dá)和分析基因產(chǎn)物對細(xì)胞機制的效果。這種應(yīng)用也包括生物活性蛋白的表達(dá)，這是通過將編碼這些DNA產(chǎn)物的核酸導(dǎo)入活細(xì)胞以研究它們對細(xì)胞代謝的效果；蛋白質(zhì)生成；和細(xì)胞形態(tài)。這些應(yīng)用也擴展到細(xì)胞中藥理上重要化合物的生成。與已知方法相比，本方法非常有效。轉(zhuǎn)染方法的效率取決于完成氣體生成的時間長度。在一些情況中，可獲得80％或更高、90％或更高或甚至約100％的效率?，F(xiàn)在僅通過例子關(guān)于下列具體實施方案進(jìn)一步描述發(fā)明。實施例實施例1-酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces.pombe))的氣穿孔法生長于酵母膏真菌培養(yǎng)基(Oxoid)中的5×105個細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)在1，200rpm洗滌兩次。隨后沉淀重懸浮于1M山梨醇。重懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到FACS管并加入0.5μgβ-半乳糖苷酶DNA載體(pCMV-SPORT-β-gal，Invitrogen)或2.5μgTMR葡聚糖(分子量70,000)(MolecularProbes)。管置于氣穿孔器(Baskerville有限公司)中且調(diào)節(jié)壓力在4-8MPa(40-80Barr)范圍。細(xì)胞留在設(shè)備中用于10分鐘的加壓/減壓循環(huán)，減壓到大氣壓。隨后細(xì)胞從氣穿孔器中取出并用(PBS)洗滌一次。細(xì)胞重懸浮于1ml液體培養(yǎng)基并在12小時后通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡(用聚-L-賴氨酸殘基)分析。在TMR葡聚糖情況中，立即進(jìn)行分析(為最小化光褪色)且不需重懸浮于培養(yǎng)基。錐蟲藍(lán)染色確定活細(xì)胞比例達(dá)于85％。轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算。這產(chǎn)生60-70％的轉(zhuǎn)染效率。實施例2-煙葉的氣穿孔法計算細(xì)胞培養(yǎng)物中的煙葉并補足所需濃度(0.2-0.5×105個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞在750g離心5分鐘，隨后沉淀重懸浮于洗滌培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水，PBS)并在相同條件下再次離心。重懸浮沉淀并再次離心。沉淀重懸浮于1ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Sigma，UK)并加入0.5μgDNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μgTMR葡聚糖。氣穿孔器與壓縮空氣汽缸相連，細(xì)胞懸浮液置于相同管中且放入氣穿孔器的艙中。關(guān)閉氣穿孔器的蓋且壓力上升至6-8MPa(60-80Barr)間。細(xì)胞置于壓力下10分鐘。處理細(xì)胞后，壓力釋放到大氣壓。此加壓循環(huán)重復(fù)3次。隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在適當(dāng)培養(yǎng)基(MS完全培養(yǎng)基)中平板培養(yǎng)并在25℃培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染后5天分析細(xì)胞的存活和DNA表達(dá)。錐蟲藍(lán)染色用于測量活細(xì)胞數(shù)且轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算?；罴?xì)胞百分比為70-80％。轉(zhuǎn)染效率為55-60％。實施例3-煙草根的氣穿孔法計算細(xì)胞培養(yǎng)物中的煙草根尖細(xì)胞并補足所需濃度(0.2-0.5×105個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞在750g離心5分鐘，隨后沉淀重懸浮于洗滌培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水，PBS)并在相同條件下離心。重懸浮沉淀并以相同方式再離心一次。沉淀重懸浮于1ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Sigma，UK)并加入0.5μgDNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μgTMR葡聚糖。氣穿孔器與壓縮空氣汽缸相連，細(xì)胞懸浮液置于相同管中且放入氣穿孔器的艙中。關(guān)閉氣穿孔器的蓋且壓力上升至6-8MPa(60-80Barr)間。細(xì)胞處理10分鐘。處理細(xì)胞后，壓力釋放到大氣壓。此加壓循環(huán)重復(fù)3次。隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在適當(dāng)培養(yǎng)基(MS完全培養(yǎng)基)中平板培養(yǎng)并在25℃培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染后5天分析細(xì)胞的存活和DNA表達(dá)。錐蟲藍(lán)染色用于測量活細(xì)胞數(shù)且轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算?；罴?xì)胞百分比為55-60％。轉(zhuǎn)染效率為45-50％。實施例4-玉米葉的氣穿孔法計算細(xì)胞培養(yǎng)物中的玉米葉細(xì)胞并補足所需濃度(0.2-0.5×105個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞在750g離心5分鐘，隨后沉淀重懸浮于洗滌培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水，PBS)并在相同條件下離心。重懸浮沉淀并以相同方式再離心一次。沉淀重懸浮于1ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Sigma，UK)并加入0.5μgDNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μgTMR葡聚糖。氣穿孔器與壓縮空氣汽缸相連，細(xì)胞懸浮液置于相同管中且放入氣穿孔器的艙中。關(guān)閉氣穿孔器的蓋且壓力上升至6-8MPa(60-80Barr)間。細(xì)胞置于壓力下10分鐘。處理細(xì)胞后，壓力釋放到大氣壓。此加壓循環(huán)重復(fù)3次。隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在適當(dāng)培養(yǎng)基(MS完全培養(yǎng)基)中平板培養(yǎng)并在25℃培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染后5天分析細(xì)胞的存活和DNA表達(dá)。錐蟲藍(lán)染色用于測量活細(xì)胞數(shù)且轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算?；罴?xì)胞百分比為60-70％。轉(zhuǎn)染效率為45-50％。實施例5-玉米根的氣穿孔法計算細(xì)胞培養(yǎng)物中的玉米根細(xì)胞并補足所需濃度(0.2-0.5×105個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞在750g離心5分鐘，隨后沉淀重懸浮于洗滌培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水，PBS)并在相同條件下離心。重懸浮沉淀并以相同方式再離心一次。沉淀重懸浮于1ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Sigma，UK)并加入0.5μgDNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μgTMR葡聚糖。氣穿孔器與壓縮空氣汽缸相連，細(xì)胞懸浮液置于相同管中且放入氣穿孔器的艙中。關(guān)閉氣穿孔器的蓋且壓力上升至6-8MPa(60-80Barr)間。細(xì)胞置于壓力下10分鐘。處理細(xì)胞后，壓力釋放到大氣壓。此加壓循環(huán)重復(fù)3次。隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在適當(dāng)培養(yǎng)基(MS完全培養(yǎng)基)中平板培養(yǎng)并在25℃培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染后5天分析細(xì)胞的存活和DNA表達(dá)。錐蟲藍(lán)染色用于測量活細(xì)胞數(shù)且轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算?；罴?xì)胞百分比為55-60％。轉(zhuǎn)染效率為45-50％。實施例6-水稻葉的氣穿孔法計算細(xì)胞培養(yǎng)物中的水稻葉細(xì)胞并補足所需濃度(0.2-0.5×105個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞在750g離心5分鐘，隨后沉淀重懸浮于洗滌培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水，PBS)并在相同條件下離心。重懸浮沉淀并以相同方式再離心一次。沉淀重懸浮于1ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Sigma，UK)并加入0.5μgDNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μgTMR葡聚糖。氣穿孔器與壓縮空氣汽缸相連，細(xì)胞懸浮液置于相同管中且放入氣穿孔器的艙中。關(guān)閉氣穿孔器的蓋且壓力上升至4-8MPa(40-80Barr)間。細(xì)胞置于壓力下10分鐘。處理細(xì)胞后，壓力釋放到大氣壓。此加壓循環(huán)重復(fù)3次。隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在適當(dāng)培養(yǎng)基(MS完全培養(yǎng)基)中平板培養(yǎng)并在25℃培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染后5天分析細(xì)胞的存活和DNA表達(dá)。錐蟲藍(lán)染色用于測量活細(xì)胞數(shù)且轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算?；罴?xì)胞百分比為65-70％。轉(zhuǎn)染效率為55-60％。實施例7-小麥葉的氣穿孔法計算細(xì)胞培養(yǎng)物中的小麥葉細(xì)胞并補足所需濃度(0.2-0.5×105個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞在750g離心5分鐘，隨后沉淀重懸浮于洗滌培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水，PBS)并在相同條件下離心。重懸浮沉淀并以相同方式再離心一次。沉淀重懸浮于1ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Sigma，UK)并加入0.5μgDNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μgTMR葡聚糖。氣穿孔器與壓縮空氣汽缸相連，細(xì)胞懸浮液置于相同管中且放入氣穿孔器的艙中。關(guān)閉氣穿孔器的蓋且壓力上升至6-8MPa(60-80Barr)間。細(xì)胞置于壓力下10分鐘。加壓細(xì)胞后，壓力釋放到大氣壓。此加壓循環(huán)重復(fù)3次。隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞用PBS洗滌一次，在適當(dāng)培養(yǎng)基(MS完全培養(yǎng)基)中平板培養(yǎng)并在25℃培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染后5天分析細(xì)胞的存活和DNA表達(dá)。錐蟲藍(lán)染色用于測量活細(xì)胞數(shù)且轉(zhuǎn)染效率通過發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來計算?；罴?xì)胞百分比為60-70％。轉(zhuǎn)染效率為20-25％。實施例2到7的結(jié)果概括于下表1表1-氣穿孔對細(xì)胞存活和不同植物組織轉(zhuǎn)染效率的效果*在煙草和玉米植物的情況中，使用高壓(6-8MPa，60-80Barr)。*在水稻植物的情況中，使用較低壓力(4-8MPa，40-80Barr)。與實施例2-7所述類似的方法可應(yīng)用于其它植物種類，如大豆和棉花。實施例8-使用高壓氣穿孔比較釀酒酵母和禾本科鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的轉(zhuǎn)染選擇用于此例子的細(xì)胞是酵母釀酒酵母和絲狀真菌禾本科鐮刀菌，禾本科鐮刀菌是用于產(chǎn)生稱為Quorn(Trinci，1994)食品的菌蛋白真菌。此具體絲狀真菌被證明難以用已知方法轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率被細(xì)胞壁限制，必須克服此阻礙以使不同大小和形狀的分子自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞壁的組成和厚度是在確定轉(zhuǎn)染效率中必須考慮的重要因素。酵母釀酒酵母細(xì)胞壁所在區(qū)域具有25％的干細(xì)胞重量。此胞外質(zhì)量對于支持結(jié)構(gòu)作用很小但對于細(xì)胞保護(hù)和控制營養(yǎng)是必需的，它主要包括多糖和具高比例碳水化合物的糖蛋白。所有這些成分在禾本科鐮刀菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)但沒有充分分析構(gòu)成細(xì)胞壁的各成分百分比。在大部分絲狀真菌中，稱為幾丁質(zhì)的n-乙酰葡糖胺聚合物是細(xì)胞壁的主要成分。同樣知道真菌的絲狀壁一般厚于酵母細(xì)胞壁(Wainwright，1992)。釀酒酵母的高壓氣穿孔表2-有和沒有pEGFP-C1時在4、5和6MPa(40、50和60Barr)氣穿孔的釀酒酵母細(xì)胞的細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)染百分比如表2所示，與4MPa(40Barr)和6MPa(60Barr)氣穿孔的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染在5MPa(50Barr)最有效，其中轉(zhuǎn)染了76％的細(xì)胞。此結(jié)果表明在5MPa(50Barr)的高壓氣穿孔可在細(xì)胞壁中有效形成孔，從而使pEGFP-C1能進(jìn)入細(xì)胞。最高的存活百分比在4MPa(40Barr)獲得，其中100％的細(xì)胞在氣穿孔下存活。最低的存活百分比是在6MPa(60Barr)，其中91％的細(xì)胞存活。這些高存活百分比表明此過程似乎不殺死細(xì)胞或抑制它們的生長周期。在5MPa和6MPa(50和60Barr)氣穿孔的細(xì)胞存活百分比高，在91-98％的范圍中。禾本科鐮刀菌的高壓氣穿孔轉(zhuǎn)染在6MPa(60Barr)最有效。當(dāng)菌絲體接受6MPa(60Barr)時觀察到較好的熒光。完成氣穿孔時，切去薄的1cm2菌絲體片斷并在6MPa(60Barr)氣穿孔。熒光在此片斷的全長中產(chǎn)生。用1和2個循環(huán)高壓氣穿孔禾本科鐮刀菌在相同壓力應(yīng)用超過一個循環(huán)使發(fā)生的轉(zhuǎn)染增加。這也在進(jìn)行的類似實驗中發(fā)現(xiàn)，其中在7MPa(70Barr)氣穿孔并處理2個循環(huán)的禾本科鐮刀菌與同樣2個循環(huán)的更低壓力相比，顯示更好的熒光。實施例9-植物和真菌懸浮細(xì)胞的氣穿孔過程用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的大分子用于轉(zhuǎn)化的大分子是主要的熒光探針，因為它們可用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀來檢測。此設(shè)計中使用的大分子是·TMR-葡聚糖(四甲基羅丹明葡聚糖(tetramethylrhodominedextran))(分子量70,000Da)·GFPDNA載體(綠色熒光蛋白DNA)(4.76kb)(pEGFP)·β-galDNA(8.2kb)TMR-葡聚糖TMR-葡聚糖是共價連接TMR的多糖，TMR是熒光標(biāo)記的反應(yīng)物。使用分子量10,000、40,000和70,000和直徑5.4nm的葡聚糖。TMR-葡聚糖廣泛用作分子標(biāo)記(Hougland，1996)。使用流式細(xì)胞儀時激發(fā)波長是546nm。分析細(xì)胞細(xì)胞用分光鏡、電泳、流式細(xì)胞儀、光學(xué)和熒光顯微鏡來分析。細(xì)胞生長的方法和條件酵母細(xì)胞的生長條件釀酒酵母和非洲粟酒裂殖酵母都生長于預(yù)先制備的麥芽汁瓊脂(Oxoid)瓊指平板上，在冷卻培養(yǎng)箱中25℃生長48小時。隨后用無菌牙簽挑出菌落并用于接種酵母麥芽汁液體培養(yǎng)基(YME-10g葡萄糖、5g蛋白胨、3g酵母膏和3g麥芽汁并用雙蒸水補至1升，然后高壓滅菌)。接種的培養(yǎng)物在冷卻定軌搖床中25℃生長到指數(shù)期，隨后轉(zhuǎn)染。絲狀真菌(禾本科鐮刀菌)的生長條件禾本科鐮刀菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Oxoid)上生長，這是通過在25℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)固體培養(yǎng)基上1cm生物體7天。7天后麥芽汁或察氏肉汁液體培養(yǎng)基(Czapexdoxliquidmedia)接種1cm鐮刀菌塊并在25℃生長5天。5天后鐮刀菌通過有Whatman1號濾紙的無菌過濾漏斗來過濾。菌絲體切成約2cm的塊，洗滌并轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染和洗滌溶液1M山梨醇用作轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基且1xPBS用作洗滌培養(yǎng)基。用高壓氣穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法·計數(shù)細(xì)胞(約0.5-1×106個細(xì)胞/ml)·在1ml無菌ddH2O中通過1300rpm離心5分鐘(2次)來洗滌細(xì)胞·用冰的1x磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌·細(xì)胞重懸浮于1M山梨醇并轉(zhuǎn)移到FACS管·加入0.5μl大分子到溶液中·管置于氣穿孔器中并關(guān)閉艙·關(guān)閉空氣出口并調(diào)節(jié)所需壓力·打開空氣入口并使加壓發(fā)生15分鐘·通過關(guān)閉入口和打開出口使艙減壓·打開艙并取出FACS管·在1300rpm旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，隨后重懸浮于培養(yǎng)基并使細(xì)胞生長到指數(shù)期(如果使用葡聚糖，分析應(yīng)該在氣穿孔后立即進(jìn)行?！ぶ苽浼?xì)胞用于分析制備細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染后分析通過熒光顯微鏡分析GST-轉(zhuǎn)染細(xì)胞·計數(shù)細(xì)胞·用1xPBS洗滌·重懸浮于2μl1xPBS·加入含細(xì)胞的溶液到聚-L-賴氨酸多孔載玻片?！な馆d玻片保持20分鐘·通過吸氣去除液體·加入2μl1xPBS到載玻片并保持5分鐘·去除PBS·加入一滴DABCO到載玻片并仔細(xì)地將蓋玻片置于載玻片上?！晒怙@微鏡分析通過流式細(xì)胞儀分析GFP-轉(zhuǎn)染細(xì)胞·用1xPBS在1300rpm洗滌細(xì)胞(兩次)·重懸浮于1M山梨醇并取出用于流式細(xì)胞儀分析分析細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的表達(dá)分析通過在診斷載玻片上孵育處理的細(xì)胞來完成，載玻片用β-Gal緩沖液處理24小時并隨后在相差下觀察。分析存活和轉(zhuǎn)染百分比存活百分比通過氣穿孔前和后的生長曲線和使用錐蟲藍(lán)來獲得。轉(zhuǎn)染百分比用流式細(xì)胞儀計算。轉(zhuǎn)染結(jié)果轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞用氣穿孔器轉(zhuǎn)染釀酒酵母和非洲粟酒裂殖酵母簡單且有效。空氣使用3-4MPa(30-40Barr)的壓力用于兩種酵母細(xì)胞類型的氣穿孔實驗。所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染1個持續(xù)15分鐘的循環(huán)。有效的轉(zhuǎn)染最佳在5MPa(50Barr)獲得，轉(zhuǎn)染百分比很高且存活百分比也高(表3和4)。轉(zhuǎn)染絲狀真菌絲狀真菌的轉(zhuǎn)染用3-7MPa(30-70Barr)(如6MPa，60Barr)的空氣進(jìn)行一個15分鐘的循環(huán)。表明使用大于一個循環(huán)，這些細(xì)胞也在較高壓力(7-8MPa，70-80Barr)轉(zhuǎn)染。比較氣穿孔和正方形波電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表3)表明氣穿孔對這些細(xì)胞更有效。表3-使用氣穿孔(A)和沒有氣穿孔(NA)時釀酒酵母的轉(zhuǎn)染效率和存活表4-使用氣穿孔(A)和沒有氣穿孔(NA)時非洲粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)染效率和存活表5-含pEGFP-C1載體的酵母細(xì)胞的電穿孔細(xì)胞存活和效率表6-當(dāng)酵母細(xì)胞停止結(jié)合大分子時在4MPa(40Barr)氣穿孔后的時間表7-當(dāng)酵母細(xì)胞停止結(jié)合大分子時在5MPa(50Barr)氣穿孔后的時間確定用高壓氣穿孔轉(zhuǎn)染酵母在5MPa(50Barr)最有效。轉(zhuǎn)染效率甚至在高壓保持很高(表3和4；圖9)而沒有隨著使用空氣顯著損失存活力。非洲粟酒裂殖酵母和釀酒酵母的存活百分比甚至在氣穿孔后48小時保持較高，表明此過程似乎不殺死細(xì)胞或抑制它們的生長周期(圖8)。然而，用正方形波電穿孔轉(zhuǎn)染顯示系統(tǒng)似乎使細(xì)胞破裂，產(chǎn)生的百分比和存活較低(圖7；表5)這指示氣穿孔轉(zhuǎn)染酵母的效率比電穿孔高許多。為探測細(xì)胞壁中孔重密封所用時間而進(jìn)行的試驗顯示在兩種酵母中，孔在5MPa(50Barr)的重密封都遠(yuǎn)快于4MPa(40Barr)空氣。用氣穿孔進(jìn)行的實驗也顯示鐮刀菌正響應(yīng)于6-7MPa(60-70Barr)的氣穿孔。工作顯示氣穿孔盡管是一種相當(dāng)簡單的方法，它是非常有效和非常有利的轉(zhuǎn)染方法。參考文獻(xiàn)BellH.，KimberW.L.，LiM.，WittleI.R.，Neuroreport，9(5)，793-798頁，1998FentonM.，BoneN.，SinclairA.J.，JournalofImmunologicalMethods，212(1)，41-48頁，1998MascarenhasL.，StripeckeR.，CaseS.S.，XuD.K.，WeinbergK.I.，KohnD.B.，Blood，92(10)，3537-3545頁，1998實施例10-NT1和BMS細(xì)胞培養(yǎng)物的氣穿孔法培養(yǎng)/維持NT1和BMS細(xì)胞培養(yǎng)物的材料和方法BMS(BlackMexicanSweet)和玉米(ZeamaysL.)細(xì)胞懸浮液獲得自JohnInnesCentre(Norwich，UK)。BMS細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)如前面GreenC.E.(1997)《細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域農(nóng)作物改進(jìn)的前景》(Prospectsforcropimprovementinthefieldofcellculture)，Hort.Science12131-134所述。NT1煙草(NicotianatabacumL.)細(xì)胞懸浮液獲得自JohnInnesCentre(Norwich，UK)。NT1細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)如前面FrommM，CallisJ.TaylorLP，WalbotV(1987)MethodsEnzymol.153351-366所述。下列基因構(gòu)建物在艾塞克斯大學(xué)(UniversityofEssex)使用PJIT58(P.Mullineaux，JIC)用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化(見圖4)PAL145(D.Lonsdale，JIC)用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化(見圖6)PGVT5(V.Thole，JIC)用于NT1煙草CS轉(zhuǎn)化(見圖3)PAL156(D.Lonsdale，JIC)用于BMS和水稻ECS轉(zhuǎn)化(見圖5)所有上述基因構(gòu)建物已公布并可獲得自JohnInnesCentre(Norwich，UK)。基因構(gòu)建物細(xì)節(jié)提供在圖譜中·gusA來自大腸桿菌的葡糖苷酸酶基因·bar來自吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的Phosphinitricin乙酰轉(zhuǎn)移酶基因·nptII來自大腸桿菌的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因·內(nèi)含子4來自Zeamays噬菌體類型聚合酶基因的內(nèi)含子4·內(nèi)含子ST-LS1來自SolanumtuberosumST-LS1基因的內(nèi)含子2·35S-P來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子·Ubi-P來自Zeamays的泛素1啟動子+外顯子1+內(nèi)含子1·nos-P來自農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的胭脂堿合酶啟動子·35S-T來自花椰菜花葉病毒的聚腺苷酸化序列·S-T來自Glycinemax的聚腺苷酸化序列·nos-T來自農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶聚腺苷酸化序列10a氣穿孔前培養(yǎng)/維持和制備水稻胚胎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物胚胎水稻愈傷組織的生成成熟水稻種子(OryzasativaL.)品種Nipponbare用于愈傷組織生成，使用來自Sivamini等，1996，Wang等，，1997和Bec等，1998的改進(jìn)操作。去殼的種子用一半強度的商業(yè)漂白劑殺菌15分鐘并用無菌蒸餾水沖洗滌三次。胚胎在解剖顯微鏡下無菌取出并在25℃暗處平板培養(yǎng)于NBm培養(yǎng)基(常量元素N6、微量元素B5、Fe-EDTA、30gl-1蔗糖、30gl-12，4-D2mgl-1、300mgl-1干酪素水解物、500mgl-1L-谷氨酰胺、500mgl-1L-脯氨酸、2.5gl-1Phytagel，pH5.8，高壓滅菌后加入過濾-殺菌的維生素B5)3周。約1mm大小的松散胚胎半透明小球(U)與凝膠凝劑上原始胚胎分開。小球在新鮮NBm培養(yǎng)基上另外培養(yǎng)10天以產(chǎn)生胚結(jié)單位(ENU，Bec等，1998)。胚胎細(xì)胞懸浮液(ECS)的生成胚結(jié)單位(ENU)分散于250ml燒瓶中，燒瓶含40mlNBm液體培養(yǎng)基，在25℃暗處以100rpm搖。每周從各燒瓶中取出舊培養(yǎng)基且約500μlPCV細(xì)胞傳代培養(yǎng)到新燒瓶中，新燒瓶含40mlNBm液體培養(yǎng)基。用于氣穿孔的水稻ECS制備一周的水稻ECS通過1mm尼龍網(wǎng)過濾。等分濾液用于氣穿孔(在實驗30/7/02種，約50μlPCV水稻細(xì)胞在0.2、0.5或1mlNBm液體培養(yǎng)基中)。參考文獻(xiàn)Sivamani，E.，Shen，P.，Opalka，N.，Beachy，R.N.和Fauquet，C.M.(1996)《用生物列舉方法從印度產(chǎn)水稻種子中選擇大量胚胎愈傷組織用于生成可繁殖的植物》(Selectionoflargequantitiesofembryogeniccallifromriceseedsforproductionoffertileplantsusingthebiolisticmethod.15322-327Bec，S.，Chen.，F(xiàn)erriere，N.M.，Legave，T.，F(xiàn)auquet，C.和Guideroni，E.1998.《微發(fā)射-調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)移到日本產(chǎn)水稻的胚胎愈傷組織的比較組織學(xué)靶組織結(jié)構(gòu)組成對基因型轉(zhuǎn)化能力的影響》(ComparativeHistologyofmicroprojectille-mediatedgenetransfertoembryoniccalliinjaponicarice(OryzasativaL.)influenceofstructuralorganizationoftargettissueongenotypetransformationability.PlantScience138177-190.Wang，M.B.，Upadhyaya，N.B.，Brettel，R.I.S.和Waterhouse，P.M.1997.《內(nèi)含子-調(diào)節(jié)改進(jìn)可選擇標(biāo)記基因用于使用農(nóng)桿菌tumefaciens的植物轉(zhuǎn)化》(Intron-mediatedimprovementofaselectablemarkergeneforplanttransformationusingAgrobacteriumtumefaciens.JGenet&Breed51325-334.10b用氣穿孔轉(zhuǎn)染懸浮BMS和NT1植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染指一定范圍的技術(shù)，用于將具體雙鏈DNAs導(dǎo)入分裂的真核生物細(xì)胞，所用方法使它們能被核吸收和表達(dá)。發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物可用高壓氣穿孔轉(zhuǎn)染。此例子描述了用高壓氣穿孔研究BMS和NT1細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行的工作。轉(zhuǎn)染過程培養(yǎng)于合適培養(yǎng)基的BMS和NT1懸浮植物細(xì)胞用于實驗。用如前所述1個循環(huán)15分鐘的加壓/減壓到6-7MPa(60-70Barr)通過氣穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。報道分子不同的報道分子用于此實驗。這些包括β-葡糖苷酸酶(用于BMS細(xì)胞的pAL145、RT18和用于NT1細(xì)胞的PJIT58、PGVT5。所有使用的質(zhì)粒由JohnInnesCentre提供)。也使用綠色熒光蛋白載體(GFP)。最后用氣穿孔器使BMS和NT1懸浮植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染TMR-葡聚糖(分子量70,000)。細(xì)胞培養(yǎng)BMS細(xì)胞這些培養(yǎng)在BMS懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞每周傳代培養(yǎng)。10ml的培養(yǎng)物加50ml的新鮮培養(yǎng)基加入250ml燒瓶。細(xì)胞在25℃以150rpm搖。NT1細(xì)胞這些培養(yǎng)在NT1懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞每周以1∶50和1∶100的稀釋傳代培養(yǎng)。它們在25℃以125rpm搖，用箔遮光。水稻胚胎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物這些培養(yǎng)在NBm培養(yǎng)基中。細(xì)胞每周傳代培養(yǎng)。它們在25℃暗處以1000rpm搖。細(xì)胞分析光學(xué)顯微鏡-明視場顯微鏡明視場顯微鏡是光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域最廣泛使用的技術(shù)。通常，活的單個細(xì)胞或單層細(xì)胞在普通光學(xué)顯微鏡下幾乎看不見。當(dāng)通過染色補充時，明視場顯微鏡是一種有力的技術(shù)。光學(xué)顯微鏡-熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基礎(chǔ)是一些物質(zhì)吸收一定波長范圍的光且隨后以光的形式發(fā)射。對于我們的研究，使用OlympusIM12顯微鏡。對于我們的熒光蛋白質(zhì)，可使用標(biāo)準(zhǔn)的FITC濾光器。結(jié)果氣穿孔器(B)在7MPa(70Barr)使用15分鐘來使培養(yǎng)的BMS細(xì)胞轉(zhuǎn)化GFP載體。在測試細(xì)胞中觀察到顯著的熒光。未處理的對照沒有顯示熒光。用GFP載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的NT1細(xì)胞細(xì)胞分別在6MPa(60Barr)和7MPa(70Barr)處理15分鐘。在測試細(xì)胞中觀察到顯著的熒光。未處理的對照沒有顯示熒光。用TMR-葡聚糖(分子量70,000)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BMS細(xì)胞細(xì)胞在氣穿孔器中7MPa(70Barr)處理15分鐘。在測試細(xì)胞中觀察到顯著的熒光。未處理的對照沒有顯示熒光。用TMR-葡聚糖(分子量70,000)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的NT1細(xì)胞細(xì)胞在氣穿孔器中7MPa(70Barr)處理15分鐘(1個循環(huán))。在測試細(xì)胞中觀察到顯著的熒光。未處理的對照沒有顯示熒光。用PGVT5載體(GUS)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的NT1細(xì)胞作為每次的預(yù)實驗(即1個循環(huán)6-7MPa(60-70Barr)15分鐘)在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周后、進(jìn)一步在非選擇性培養(yǎng)基中2和3周后拍攝的照片顯示測試細(xì)胞中有顯著的染色。用TMR-葡聚糖和GFP轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的水稻胚胎培養(yǎng)物測試的水稻胚胎細(xì)胞顯示顯著的藍(lán)色。未處理的對照沒有顯示熒光。實施例11-氣穿孔轉(zhuǎn)化后傳代培養(yǎng)和選擇細(xì)胞的材料和方法氣穿孔處理后，水稻ECS置于皮氏培養(yǎng)皿上的Whatman濾器上并在25℃暗處培養(yǎng)2天，皮氏培養(yǎng)皿含NBm固體培養(yǎng)基。氣穿孔后2天，過濾物在25℃暗處轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基(NBm固體培養(yǎng)基加5mg/lphosphinotrycin(PPT，選擇pAL156)或100mg/lgeneticin(選擇pGVT5)2周。當(dāng)包括PPT時將L-谷氨酰胺從所有培養(yǎng)基中去除。轉(zhuǎn)化后2周，各愈傷組織(生長自單獨的ENU)分成2到5塊。愈傷組織塊在新鮮的以NBm為基礎(chǔ)的選擇性培養(yǎng)基上載培養(yǎng)3周。生長自單獨ENU的抗性愈傷組織在2+3周選擇后聚集在一起。氣穿孔后5周，抗性愈傷組織在25℃暗處轉(zhuǎn)移到PRm前再生培養(yǎng)基(沒有2，4-D的NBm固體培養(yǎng)基，但有2mg/lBAP、1mg/lNAA、5mg/lABA加5mg/lPPT(選擇pAL156)或100mg/lgeneticin(選擇pGVT5)9天。氣穿孔后6周，顯示明顯差異生長的愈傷組織隨后在25℃亮處轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基RNm(沒有2，4-D的NBm固體培養(yǎng)基，但有3mg/lBAP、0.5mg/lNAA加5mg/lPPT(選擇pAL156)或100mg/lgeneticin(選擇pGVT5)2-3周。僅一種植物從各原始ENU再生以確保各植物代表單獨的轉(zhuǎn)化。氣穿孔后8到9周，植物在MSR6固體培養(yǎng)基(Vain等，1998)上25℃亮處發(fā)育2-3周，MSR6固體培養(yǎng)基含5mg/lPPT(選擇pRT19)或100mg/lgeneticin(選擇pGVT5)。氣穿孔后10到12周，轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)移到人工氣候室以生長到成熟和產(chǎn)生種子。在選擇過程中通過Jefferson方法(1987)和之后的組織化學(xué)GUS染色來監(jiān)控水稻愈傷組織和植物中的GusA基因活性。用PCR和DNA印跡分析進(jìn)行轉(zhuǎn)化植物的分子分析。參考文獻(xiàn)JeffersonRA，KavanaghTA，BevanMW(1987)《β-葡糖苷酸酶在高等植物中作為敏感和多功能融合標(biāo)記》(β-glucuronidaseassensitiveandversatilefusionmarkerinhigherplants).EMBOJ.63901-3907Vain，P.，Worland，B.，Clarke，M.C.，Richard，G.，Beavis，M.，Liu，H.，Kohli，A.，Leech，M.，Snape，J.W.，Christou，P.和Atkinson，H.1998.《在轉(zhuǎn)基因水稻植物中表達(dá)抗線蟲的工程蛋白酶抑制劑(Oryzacystatin-IΔd86)》(Expressionofanengineeredproteinaseinhibitor(Oryzacystatin-IΔd86)fornematoderesistanceintransgenicriceplants).Theor.andAppl.Genet96266-271.表8-NBm液體培養(yǎng)基常量元素N6貯存液(Chu等，1975)用于1lKNO328.3g(NH4)2SO44.63gCaCl22H2O1.66gMgSO47H2O1.85gKH2PO44g補至體積1l使用100ml/l培養(yǎng)基貯存4℃，未滅菌微量元素B5貯存液(Camborg等，1968)用于500mlH3BO3150mgMnSO4·4H2O660mgZnSO4·7H2O100mgKI37.5mgNa2MoO4·2H2O12.5mgCuSO4·5H2O1.25mg(5ml的0.25mg/ml貯存液)CoCl2·6H2O1.25mg(4.5ml的0.28mg/ml貯存液)補至體積500ml使用10ml/l培養(yǎng)基貯存4℃，未滅菌維生素B5貯存液(Camborg等，1968)用于500ml鹽酸硫胺素500mg鹽酸維生素B650mg煙酸50mg肌醇5g補至體積500ml使用10ml/l培養(yǎng)基貯存pH5.8，4℃，過濾滅菌，暗容器參考文獻(xiàn)CamborgOL，MillerRA，OjimaK(1968)《大豆根細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的必要條件》(Requirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells).ExpCellRes.50151-158ChuCC，WangCC，SunCSHusC，YinKC，ChuCY，BiFY(1975)《通過氮源比較實驗建立另一種培養(yǎng)水稻的有效培養(yǎng)基》(Establishmentofanefficientmediumforanothercultureofricethroughcomparativeexperimentsonthenitrogensources)Sci.Sin.(Pekin)18659-668.實施例12-用氣穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物可用高壓氣穿孔轉(zhuǎn)染。然而，許多細(xì)胞本身表達(dá)不整合到宿主基因組的載體，這稱為暫時表達(dá)。產(chǎn)生外源基因穩(wěn)定整合到宿主基因組的細(xì)胞需要從非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這通常通過共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中來完成，用于組成型表達(dá)賦予轉(zhuǎn)染細(xì)胞抗生素抗性的基因?？股乜剐曰騼?yōu)選在與感興趣外源基因相同的質(zhì)粒載體上進(jìn)行。一個普遍使用的選擇方法是利用新霉素基因，此基因賦予受體細(xì)胞對G418硫酸鹽的抗性。此報導(dǎo)描述了用高壓氣穿孔研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所進(jìn)行的工作。轉(zhuǎn)染過程植物細(xì)胞懸浮液通過在MS或B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少3天從碎煙草和玉米葉獲得，它們用于所有實驗。細(xì)胞如前所述用一個循環(huán)的加壓/減壓到7MPa(70Barr)通過氣穿孔轉(zhuǎn)染。報道分子四種不同類型的報道DNA載體用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究，這些包括β-葡糖苷酸酶(β-gal)、葡糖苷酸酶(GUS)、綠色熒光蛋白載體(GFP)和紅色熒光蛋白載體(RFP)。GFP是有用的，因為它可不殺死細(xì)胞來檢測。轉(zhuǎn)化GFP基因的細(xì)胞表現(xiàn)出亮熒光。GFP是具小分子量的高穩(wěn)定蛋白質(zhì)且表現(xiàn)出很少的光褪色。此報道系統(tǒng)顯示在多種生物系統(tǒng)中發(fā)揮作用，包括植物(Corbett，1995；Haseloff，1995；Kaether，1995；Wang，1994)。另一方面，RFP顯示沒有自身熒光。GFP和RFP的優(yōu)勢是表達(dá)報道分子的細(xì)胞可通過熒光顯微鏡鑒定，這使細(xì)胞能用流式細(xì)胞儀來分類。載體都有新霉素基因，使得在培養(yǎng)中選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞容易。由于這個原因，第一個實驗用2μg/ml濃度的GFP和RFPDNA載體完成。細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞立即在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但由于存在新霉素抗性基因而加入geneticin(G418)(Sigma)選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。開始前，通過抗生素選擇完成轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞死亡劑量-反應(yīng)曲線。重要的是使用正確濃度的選擇性培養(yǎng)基，此濃度正好足以在1-3天時間段殺死大部分未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在我們的實驗中，我們使用1000μg/ml的G418用于完全選擇。細(xì)胞在此選擇性培養(yǎng)基生長至少2-3周，按需要每3-4天改變培養(yǎng)基，隨后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非選擇性培養(yǎng)基中以進(jìn)一步生長。細(xì)胞分析熒光-活化的細(xì)胞分類此技術(shù)可用于在細(xì)胞光散射特性和它們表達(dá)的具體表面分子基礎(chǔ)上分離細(xì)胞。這些分子可用熒光染料標(biāo)記的具體配基(如抗體)來檢測。含細(xì)胞的微滴流穿過激光束。在小角和90°檢測到光散射以及激光激發(fā)的熒光染料熒光。有光散射且熒光參數(shù)在預(yù)定界限中的細(xì)胞發(fā)生靜電偏離用于收集。也可修改此技術(shù)用于使單個細(xì)胞偏離進(jìn)入多孔平板的孔中。熒光顯微鏡細(xì)胞用明視場顯微鏡或熒光顯微鏡檢測，使用OlympusIM12顯微鏡。對于兩種熒光蛋白質(zhì)，可使用標(biāo)準(zhǔn)的FITC濾光器。結(jié)果來自培養(yǎng)的煙葉細(xì)胞培養(yǎng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GFP照片培養(yǎng)的煙葉細(xì)胞用氣穿孔來穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP載體。在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后、在非選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)2周后拍攝照片。未處理的對照沒有顯示熒光而轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的染色。來自培養(yǎng)的玉米和煙葉細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RFP照片穩(wěn)定轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的玉米和煙葉細(xì)胞。細(xì)胞用氣穿孔轉(zhuǎn)染RFP載體。在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后拍攝照片。未處理的對照沒有顯示熒光而轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的染色。根據(jù)我們的實驗很明顯的是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用氣穿孔技術(shù)影響。轉(zhuǎn)染GFP載體的煙葉細(xì)胞培養(yǎng)物成功地生長約4周2周在選擇性培養(yǎng)基中且后2周在非選擇性培養(yǎng)基中。在GFP載體的情況中，玉米細(xì)胞中的RFP表達(dá)水平似乎比煙草低。參考文獻(xiàn)Corbett，A.H.，Koepp，D.M.，Sclenstedt，G.，Lee，M.S.，Hoper，A.K.，Silver，P.A.(1995).《核輸出需要的Ran/TC4GTPase活化蛋白質(zhì)Rnalp》(Rnalp，Ran/TC4GTPaseactivatingprotein，isrequiredfornuclearimport)J.Cell.Biol.130，1017-1026.Haseloff，J.，Amos，B.(1995)《植物的GFP》(GFPinplants).TIG11，328-329Kaether，C.，Gerdes，H.H.(1995)《用綠色熒光蛋白顯現(xiàn)分泌途徑的蛋白質(zhì)運輸》(Visualizationofproteintransportalongthesecretorypathwayusinggreenfluorescentprotein).FBBSLettt.369，267-271Wang，S.X.，Hazelrigg，T(1994)《來自果蠅卵子生成中exu蛋白質(zhì)空間分布的bcdmRNA定位指示》(ImplicationsforbcdmRNAlocalizationfromspatialdistributionofexuproteininDrosophilaoogenesis).Nature(London)369，400-403實施例13-植物細(xì)胞的氣穿孔氣穿孔方法用于植物細(xì)胞的不同制備，使用編碼β-葡糖苷酸酶(GUS)的DNA載體和編碼紅色熒光蛋白的pDsRed1-C1載體。培養(yǎng)3-5天的煙葉細(xì)胞可用GUS轉(zhuǎn)染。在5-7MPa(50-70Barr)壓力氣穿孔玉米表明更高壓力產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)染水平。用紅色熒光蛋白載體氣穿孔煙草和玉米葉分別表現(xiàn)出45-55％和30-35％的明顯轉(zhuǎn)染水平。也建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的煙草和玉米細(xì)胞培養(yǎng)物。前面的工作用氣穿孔轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，TMR-葡聚糖、GFP和β-半乳糖苷酶載體用作報道分子。植物實驗用編碼葡糖苷酸酶(GUS)的載體進(jìn)行，載體具體設(shè)計用于在植物中表達(dá)，一個設(shè)計用于雙子葉植物且另一個用于單子葉植物，兩者都可從JohnInnesCentre(Norwich)獲得。適于組織化學(xué)、分光光度和熒光分析的GUS試驗底物可商業(yè)獲得。植物煙草(N.tabacum)和玉米(Z.mays)植物在溫室中生長約6-7周。所用植物組織是煙草和玉米葉(約1.0cm長)。植物細(xì)胞樣品植物組織被消毒(Hall，1999)且隨后精細(xì)地剁碎成1-2mm立方體。剁碎片斷直接用于氣穿孔或在皮氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并在定軌搖床(140rpm)中24-26℃培養(yǎng)36-48小時，皮氏培養(yǎng)皿含10mlMS或B5培養(yǎng)基(Hall，1999)。單細(xì)胞懸浮液制備自培養(yǎng)片斷，這是通過用無菌篩(0.5-1.0mm篩孔)從細(xì)胞懸浮液中去除所有塊狀植物物質(zhì)。剩余的細(xì)胞懸浮液在750g離心5分鐘。離心后，沉淀重懸浮于合適培養(yǎng)基，接著25℃培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基是添加4.5μM2，4-D(Gamborg等，，1979)的MS培養(yǎng)基。細(xì)胞以2.5×103個細(xì)胞/ml的密度接種在10ml總體積中。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在25℃維持于培養(yǎng)箱中。載體TMR-葡聚糖(70kDa)用于指示一個孔在細(xì)胞膜中產(chǎn)生。此分子直徑約為5.4nm。對于用GUS轉(zhuǎn)化雙子葉植物，使用pJIT58載體(5.2kb)(圖4)，而對于用GUS轉(zhuǎn)化單子葉植物，使用pAL145載體(6.98kb)(圖6)。表達(dá)紅色熒光蛋白的PDsRed1-C1載體用于轉(zhuǎn)染單子葉植物和雙子葉植物(圖10)。植物細(xì)胞的氣穿孔操作過程FACS管內(nèi)1.0ml體積MS培養(yǎng)基中的4×104個細(xì)胞懸浮液置于氣穿孔器的壓力艙，隨后加壓到7MPa(70Barr)15分鐘，接著迅速減壓。整個過程在室溫(20-22℃)進(jìn)行。氣穿孔循環(huán)結(jié)束后，細(xì)胞從氣穿孔器中取出并轉(zhuǎn)移到微離心管。細(xì)胞在218xg5分鐘離心一次且沉淀重懸浮于1ml培養(yǎng)基。細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到24孔板并培養(yǎng)(25℃)48-72小時用于表達(dá)DNA。植物細(xì)胞的顯微鏡分析GUS染色(GallagherS.R.，1992)·5×104個轉(zhuǎn)染細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌一次·細(xì)胞轉(zhuǎn)移到聚-L-賴氨酸覆蓋的載玻片(載玻片用70％Z醇+6ml賴氨酸溶液洗滌1小時，隨后用dd.H2O沖洗滌9次)。使細(xì)胞附著15分鐘并去除過多的液體?！ぜ?xì)胞用固定劑(含2％甲醛和0.05％戊二醛的PBS)室溫固定5分鐘·PBS洗滌一次·加入X-Gluc(1mg/ml)到染色溶液且37℃過夜(16小時)孵育?！び肞BS仔細(xì)沖洗滌并對所有樣品用相同焦距在倒置顯微鏡下觀察β-葡糖苷酸酶(GUS)活性裂解底物4-MUG(4-甲基繖形基β-D葡糖苷酸)(4-methylumbelliferylβ-Dglucuronide)，導(dǎo)致熒光產(chǎn)物4-MU生成，4-MU可用紫外光顯現(xiàn)。所用操作過程由Gallagher描述(1989)。組織培養(yǎng)基中用MUG的非破壞試驗4-MUG似乎在短培養(yǎng)段(至2天)中沒有毒性，發(fā)展了組織培養(yǎng)基中無毒性染色過程(Gould和Smith，1989)。由于來自培養(yǎng)植物組織的β-葡糖苷酸酶裂解入培養(yǎng)基，物質(zhì)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基后可在用過的培養(yǎng)基中分析GUS表達(dá)。另外，懸浮培養(yǎng)物可直接染色而不破壞物質(zhì)。試驗操作過程·在含2mM4-MUG的液體或瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)物質(zhì)2天·30-37℃過夜培養(yǎng)。溫度取決于啟動子強度?！まD(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基·加入10-30μl0.3MNa2CO3到組織·紫外光下20分鐘后評估染色結(jié)果植物組織樣品中的轉(zhuǎn)染模式培養(yǎng)的煙草細(xì)胞懸浮液用氣穿孔器轉(zhuǎn)染GUS(pJIT58載體)且轉(zhuǎn)染細(xì)胞用(A)X-gluc底物或(B)MUG底物顯現(xiàn)。細(xì)胞在氣穿孔器中處理一個15分鐘的循環(huán)且所用壓力為7MPa(70Barr)。培養(yǎng)的玉米細(xì)胞懸浮液用氣穿孔器轉(zhuǎn)染GUS(pAL145載體)并用MUG底物顯現(xiàn)。細(xì)胞在氣穿孔器中處理一個15分鐘的循環(huán)且所用壓力為(A)5MPa(50Barr)、(B)6MPa(60Barr)和(C)7MPa(70Barr)。未處理對照沒有顯示熒光。根據(jù)結(jié)果明顯的是煙草細(xì)胞可用氣穿孔方法轉(zhuǎn)染GUS，使用熒光或非熒光底物。獲得的轉(zhuǎn)染水平估計為約2％。懸浮玉米細(xì)胞也用設(shè)計用于單子葉植物的載體轉(zhuǎn)染。在壓力范圍5-7MPa(50-70Barr)氣穿孔玉米表明更高壓力產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)染水平。用下面DsRed1載體的轉(zhuǎn)染實驗所得結(jié)果表明在懸浮煙草細(xì)胞的情況中，氣穿孔產(chǎn)生約50％的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，而獲得的培養(yǎng)玉米細(xì)胞轉(zhuǎn)染水平稍低，約為35％。培養(yǎng)的煙葉細(xì)胞和培養(yǎng)的玉米葉細(xì)胞在培養(yǎng)5天后用DsRed1轉(zhuǎn)染。氣穿孔器中所用壓力為7MPa(70Barr)且細(xì)胞處理一個15分鐘的循環(huán)；所用氣體是空氣。未處理對照沒有顯示熒光。優(yōu)選壓力是5-8MPa(50-80Barr)，用一個或更多15分鐘循環(huán)以最大化轉(zhuǎn)染和細(xì)胞產(chǎn)生。用GFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的煙草和玉米葉細(xì)胞培養(yǎng)物能在非選擇性培養(yǎng)基中生長至少一個4周時間段。參考文獻(xiàn)BevanM.(1984)NucleicAcidResearch128711GallagherS.R.，(1992)《GUS操作用GUS基因作為基因表達(dá)的報道分子》(GUSprotocolsUsingtheGUSgeneasaReporterofGeneExpression)，115-120GallagherS.R.，(1989)《分光光度和熒光定量溶液中的DNA和RNA》(SpectrophotometricandfluorimetricquantitationofDNAandRNAinsolution).CurrentProtocolsinMolecularBiology，A3.9-A3.15GamborgO.L.，ShylukJ.P.，F(xiàn)owkeL.C.，WetterL.R.，和EvansD.(1979).Z.Pflanzenphysiol.，95，255GormanC.(1985)《DNA克隆實踐方法》(DNAcloningApracticalApproach)卷II，D.M.Glover主編(IRLPress，Oxford，UK)，143-190頁Gould，J.H.，和Smith，R.H.(1989).《用于植物組織培養(yǎng)基中GUS的非破壞試驗》(Anon-destructiveassayforGUSinthemediaofplanttissuecultures)PlantMolecularBiologyRep.7209-216Hall，R.D.(1999).PlantCellCultureProtocols-MethodsinMolecularBiology，11，10-17JeffersonR.A.，KavanaghT.A.，和BevanM.W.，(1987)，《GUS融合β-葡糖苷酸酶作為敏感和多功能基因融合標(biāo)記》(GUSfusionsβ-glucuronidaseassensitiveandversatilegenefusionmarker).EMBOJ.63901-3908LaceyA.J.(1989)，《生物中的熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡實踐方法》(Fluorescencemicroscopy，LightmicroscopyinBiologyApracticalApproach)A.J.Lacey主編MartinT.，SchmidtR.，AltmannT.，WillmitzerL.，F(xiàn)rommerW.，《用于高等植物中β-葡糖苷酸酶活性的非破壞試驗》(Non-destructiveassaysystemsforβ-glucuronidaseactivityinhigherplants)PlantMol.Bio.inpressMatz，M.V.等，(1999)NatureBiotechnology17969-973PloemJ.S.，(1989)《生物中的熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡實踐方法》A.J.Lacey主編實施例14-大腸桿菌轉(zhuǎn)染大腸桿菌細(xì)胞(E.coli細(xì)胞)的生長條件大腸桿菌細(xì)胞首先在laurina肉湯(LB)中37℃冷卻定軌搖床過夜生長，隨后在LB瓊脂平板上劃線培養(yǎng)。使用無菌牙簽從平板中挑出一個單菌落用于轉(zhuǎn)化，接種10mlLB培養(yǎng)基并37℃過夜生長。第二天早上，取出100μl細(xì)胞并加入另外的10ml培養(yǎng)基且培養(yǎng)2小時。用高壓氣穿孔轉(zhuǎn)染的方法細(xì)胞用如下的氣穿孔過程來轉(zhuǎn)化·1x磷酸緩沖鹽水(PBS)用作轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并作為洗滌培養(yǎng)基·計數(shù)細(xì)胞(約0.5-1×106個細(xì)胞/ml)·在1ml無菌雙蒸水中通過1300rpm離心5分鐘(2x)來洗滌細(xì)胞·用冰的1xPBS洗滌·細(xì)胞重懸浮于冰的1xPBS并轉(zhuǎn)移到FACS管·加入0.5μl大分子到溶液中·管置于氣穿孔器艙中并關(guān)閉艙·關(guān)閉空氣出口并調(diào)節(jié)所需壓力·打開空氣入口并使加壓發(fā)生15分鐘·通過關(guān)閉入口和打開出口使艙減壓·從艙中取出FACS管·在1300rpm旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，隨后重懸浮于培養(yǎng)基使細(xì)胞生長到指數(shù)期(如果使用葡聚糖，分析應(yīng)該在氣穿孔后立即進(jìn)行)?！ぶ苽浼?xì)胞用于分析通過氣穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌用一些可商業(yè)購得的載體進(jìn)行。TMR葡聚糖也用于這些實驗。氣穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA分離根據(jù)廠商說明用Quiagen的無內(nèi)毒素微型試劑盒分離DNA。結(jié)果轉(zhuǎn)化大腸桿菌用1xPBS成功進(jìn)行。轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中過夜生長并分離DNA。表9-用不同載體和1xPBS作為轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基來轉(zhuǎn)化大腸桿菌代碼x生長很差xx生長較差xxx生長好xxxx生長好到極好xxxxx生長極好TMR葡聚糖也用于研究1xPBS作為轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化表10-在37℃冷卻定軌搖床培養(yǎng)16小時后用1xPBS氣穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)胞的觀察根據(jù)上述結(jié)果顯然大腸桿菌轉(zhuǎn)化是成功的。所有指示顯示氣穿孔方法適于導(dǎo)致DNA分離的細(xì)菌轉(zhuǎn)化。參考文獻(xiàn)BellH.，KimberW.L.，LiM.，WittleI.R.，Neuroreport，9(5)，793-798頁，1998FentonM.，BoneN.，SinclairA.J.，JournalofImmunologicalMethods，212(1)，41-48頁，1998MascarenhasL.，StripeckeR.，CaseS.S.，XuD.K.，WeinbergK.I.，KohnD.B.，Blood92(10)，3537-3545，1998實施例15-枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)染材料下列材料用于此實施例·0.4％PBS中的錐蟲藍(lán)·無菌蒸餾水·無菌1xPBS·穿梭載體-JM110(pHB201)·LB培養(yǎng)基·氣穿孔器·枯草芽孢桿菌·紅霉素枯草芽孢桿菌的生長和氣穿孔·用無菌一次性環(huán)將枯草芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基。37℃過夜培養(yǎng)·挑出單菌落并接種10mlLB肉湯，在冷卻定軌搖床中以185rpm過夜生長·在早上用100μl過夜培養(yǎng)物接種新鮮的10mlLB肉湯。37℃培養(yǎng)2小時·枯草芽孢桿菌在冰上冷卻且并同時冷卻MCC管·取出1ml液體培養(yǎng)物并加入冷的MCC管，1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘·去除上清，隨后加入1ml冰的無菌水并在1000rpm旋轉(zhuǎn)(兩次)·去除上清并加入1ml冰的1xPBS，1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘，隨后去除上清并加入1ml冰1xPBS到細(xì)胞，然后加入0.5μlDNA，混合，接著加入冷的管·管放入氣穿孔器并加壓艙15分鐘·減壓并取出管·從管中取出細(xì)胞并放回冷的MCC管·如上所述洗滌細(xì)胞·在1xPBS中洗滌，1000rpm5分鐘并去除上清·加入1ml的溫(37℃)LB培養(yǎng)基·進(jìn)行連續(xù)稀釋(任選)·在選擇性培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，此情況中是紅霉素·37℃培養(yǎng)16小時表11-氣穿孔后在選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上枯草芽孢桿菌的觀察上面表11的結(jié)果證明枯草芽孢桿菌在所有壓力成功轉(zhuǎn)染且具體是在4和5MPa(40-50Barr)，因為轉(zhuǎn)染細(xì)胞能在含紅霉素的培養(yǎng)基上生長，與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞相反。實施例16-FITC-BSA轉(zhuǎn)染的N.tabacum植物細(xì)胞的氣穿孔氣穿孔轉(zhuǎn)染FITC-BSA(1μg/ml)的N.tabacum(獲得自葉肉組織(mesoplylltissue))植物細(xì)胞。細(xì)胞在氣穿孔器中處理45分鐘(3個循環(huán))。第一個樣品在空氣存在時轉(zhuǎn)染，而第二個在氧存在時轉(zhuǎn)染。樣品測試都為陽性。在單獨存在氧時進(jìn)行氣穿孔的情況中，所得表達(dá)高于存在空氣時進(jìn)行氣穿孔所得表達(dá)。未處理對照沒有顯示熒光。這證明在發(fā)明的一些實施方案中，用于氣穿孔方法的氣體溶解度越大，細(xì)胞轉(zhuǎn)化越成功。權(quán)利要求1.一種滲透有細(xì)胞壁的活細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括(a)加壓與細(xì)胞表面接觸的流體或凝膠；和(b)減壓流體或凝膠；以在細(xì)胞表面形成至少一個孔。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，減壓流體或凝膠產(chǎn)生的氣泡能在細(xì)胞表面形成至少一個孔。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(b)中的壓力減少是2MPa(20Barr)或更多。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(b)中的壓力減少是2-11MPa(20-110Barr)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(b)中的壓力減少是5-11MPa(50-110Barr)。6.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，流體或凝膠在步驟(b)中幾乎減壓到大氣壓(約1Barr)。7.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，細(xì)胞表面的孔包括細(xì)胞膜中的孔。8.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，壓力在步驟(b)中在小于10秒的間隔內(nèi)減少。9.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，流體或凝膠在步驟(a)中加壓10分鐘或更長。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，流體或凝膠在步驟(a)中加壓10-20分鐘。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，流體或凝膠在步驟(a)中加壓15分鐘。12.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，流體或凝膠包括含水液體。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，流體或凝膠包括緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。14.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，接觸流體或凝膠的氣體在流體或凝膠中的溶解度為1.0×10-4mol/latm或更高，流體或凝膠受到加壓。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，氣體的溶解度為6.0×10-4mol/latm或更高。16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于，氣體選自空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳、甲烷、氦氣、氖氣和氬氣。17.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法由單個加壓和減壓循環(huán)或多個加壓和減壓循環(huán)組成。18.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，細(xì)胞是植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，細(xì)胞來自農(nóng)作物。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，農(nóng)作物選自谷類或豆類、玉米、小麥、馬鈴薯、木薯、水稻、高粱、稷、木薯、大麥、豌豆和其它根、塊莖或種子作物。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，種子作物選自含油種子油菜、糖用甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，植物細(xì)胞來自園藝植物。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，園藝植物選自萵苣、菊苣、蕓苔植物、石竹、天竺葵、煙草、葫蘆、胡蘿卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒、菊花、白楊、桉樹和松樹，蕓苔植物包括甘藍(lán)、花莖甘藍(lán)和花椰菜。24.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，細(xì)胞來自選自含油種子植物、產(chǎn)生谷類種子的植物和豆類植物的產(chǎn)子植物。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，含油種子植物選自棉花、大豆、紅花、向日葵、含油種子油菜、玉米、紫花苜蓿、棕櫚和椰子。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生谷類種子的植物選自玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、裸麥和其它產(chǎn)生谷類種子的植物。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，豆類植物選自瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆和鷹嘴豆。28.如權(quán)利要求18-27中任一項所述的方法，其特征在于，細(xì)胞來自植物細(xì)胞，植物細(xì)胞選自玉米(Zeamays)、油菜(Brassicanapus，Brassicarapa屬)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、裸麥(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea屬)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘樹(Citrus屬)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa屬)、鱷梨(PerseaAmericana)、無花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄欖(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅果(Macadamiainterifolia)、杏仁(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。29.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，細(xì)胞選自大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、禾本科鐮刀菌(F.graminearum)、非洲粟酒裂殖酵母(S.prombe)、Z.mays和N.tabacum。31.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，細(xì)胞形成部分細(xì)胞聚簇。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，聚簇是胚胎聚簇。33.如權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法，其特征在于，細(xì)胞是小孢子。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，細(xì)胞是花粉小孢子。35.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，流體或凝膠的溫度直至37℃。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，溫度是15-30℃。37.一種將物質(zhì)導(dǎo)入有細(xì)胞壁的細(xì)胞的方法，其特征在于，方法包括如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中至少一個孔促進(jìn)物質(zhì)進(jìn)入。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，流體或凝膠包含所述物質(zhì)。39.如權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)選自生物分子或大分子。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)選自核酸，包括DNA、cDNA、RNA或mRNA。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，核酸包括基因、質(zhì)粒、染色體、寡核苷酸、核苷酸序列、核酶或其片斷或表達(dá)載體。42.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，物質(zhì)包括生物活性分子，包含蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸、激素、多糖、染料和藥物劑如藥物。43.如權(quán)利要求37-42中任一項所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)具有100道爾頓或更高的分子量。44.一種通過權(quán)利要求1-43中任一項所述方法獲得的有細(xì)胞壁的滲透細(xì)胞，其特征在于，細(xì)胞表面包括至少一個能促進(jìn)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的孔。45.如權(quán)利要求44所述的滲透細(xì)胞，其特征在于，孔包括細(xì)胞膜中的孔。46.如權(quán)利要求44或45所述的滲透細(xì)胞，其特征在于，細(xì)胞的細(xì)胞壁幾乎完整。47.減壓方法在滲透細(xì)胞和/或?qū)⑽镔|(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，細(xì)胞有細(xì)胞壁，減壓方法用于通過2MPa(20Barr)或更高的步驟降低應(yīng)用于流體或凝膠的壓力，流體或凝膠包含細(xì)胞。48.一種將物質(zhì)導(dǎo)入有細(xì)胞壁的細(xì)胞的設(shè)備，其特征在于，使用權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，設(shè)備包括(a)導(dǎo)入氣體的入口；(b)入口進(jìn)入的壓力艙，艙具有顯著的幾何橫截面；(c)壓力艙內(nèi)的隔室，用于使細(xì)胞包含在流體或凝膠中；(d)任選的壓力計，用于監(jiān)控壓力艙中的壓力；和(e)釋放壓力艙氣體的出口；其中，入口和出口包括在加壓時分隔壓力艙的閥。49.如權(quán)利要求48所述的設(shè)備，其特征在于，入口和出口包括入口和出口管。50.如權(quán)利要求49所述的設(shè)備，其特征在于，入口管和/或出口管直徑是2-4mm。51.如權(quán)利要求48-50中任一項所述的設(shè)備，其特征在于，壓力艙的幾何橫截面幾乎是柱狀的。52.如權(quán)利要求48-51中任一項所述的設(shè)備，其特征在于，使細(xì)胞包含在流體或凝膠中的隔室包括幾乎壓力艙全部內(nèi)表面。53.如權(quán)利要求52所述的設(shè)備，其特征在于，壓力艙內(nèi)表面包括生理可接受的涂層。54.如權(quán)利要求48-51中任一項所述的設(shè)備，其特征在于，使細(xì)胞包含在流體或凝膠中的隔室包括位于壓力艙內(nèi)表面附近的容器。55.如權(quán)利要求54所述的設(shè)備，其特征在于，容器由壓力艙內(nèi)表面支持。56.如權(quán)利要求54或55所述的設(shè)備，其特征在于，容器內(nèi)表面包括生理可接受的涂層。57.如權(quán)利要求48-56中任一項所述的設(shè)備，其特征在于，入口和/或出口中的閥包括針形閥。全文摘要提供了一種滲透有細(xì)胞壁的活細(xì)胞的方法，包括(a)加壓與細(xì)胞表面接觸的流體或凝膠；以及(b)減壓流體或凝膠；以在細(xì)胞表面形成至少一個孔。文檔編號C12N1/20GK1571845SQ02820801公開日2005年1月26日申請日期2002年8月21日優(yōu)先權(quán)日2001年8月21日發(fā)明者D·里克沃德申請人:英謬諾坡雷辛有限公司