專利名稱：葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾型葡萄糖脫氫酶，這種酶是以吡咯并喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone)(PQQ)作為輔酶的葡萄糖脫氫酶(GDH)的特定氨基酸殘基被其它的氨基酸置換的修飾型葡萄糖脫氫酶。本發(fā)明的修飾型酶在臨床檢查或食品分析等方面的葡萄糖測(cè)定上有用。
背景技術(shù)：
血液中葡萄糖的濃度，作為糖尿病的重要標(biāo)志在臨床診斷上是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。另外，在使用微生物的發(fā)酵生產(chǎn)中葡萄糖濃度的測(cè)定在程序監(jiān)控中是一個(gè)重要項(xiàng)目。歷來，葡萄糖是由葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的酶法進(jìn)行測(cè)定的。最近，作為一種新酶，以吡咯并喹啉醌作為輔酶的葡萄糖脫氫酶的應(yīng)用(PQQGDH)已引起人們的注意。PQQGDH對(duì)于葡萄糖來說，具有高的氧化活性，以及由于PQQGDH是輔酶結(jié)合型的酶，不需要氧作為電子受體。因此，可期望運(yùn)用于分析領(lǐng)域，包括作為葡萄糖傳感器的傳感元件。
PQQGDH是以吡咯并喹啉醌作為輔酶的葡萄糖脫氫酶，催化氧化葡萄糖成葡糖酸內(nèi)酯的反應(yīng)。
己經(jīng)知道，PQQGDH包括膜結(jié)合型酶和水溶性酶。膜結(jié)合型PQQGDH是分子量大約在87kDa的單肽蛋白，廣泛地在各種不同的革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)。另一方面，水溶性PQQGDH發(fā)現(xiàn)存在于乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的幾株菌株中(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，其結(jié)構(gòu)基因已被克隆，其氨基酸序列也已明了(Mol.Gen.Genet.(1989)，217430-436)。來自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH是由二個(gè)分子量大約為50kDa的亞基組成的同型二聚體，為顯示其活性，必須具有PQQ與Ca2+。它顯示出2200U/mg～7400U/mg的高的酶活性。也已知道，它是不與PQQ結(jié)合的脫輔基酶形式時(shí)的等電點(diǎn)是9.2，而全輔酶形式時(shí)是10.2的堿性蛋白質(zhì)(K.Matsushita，等(1995)Biosci.Biotech.Biochem.，59，1548-1555)。另外，水溶性PQQGDH的X線結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果也己被發(fā)表(A.Oubrie，等(1999)J.Mol.Bio.，289，319-333以及A.Oubrie，等(1999)The EMBO Journal，18(19)，5187-5194)，揭示了水溶性PQQGDH的三維結(jié)構(gòu)或PQQ和Ca2+推測(cè)的存在位置。
關(guān)于水溶性PQQGDH的純化，Duine等從乙酸鈣不動(dòng)桿菌中完全純化了水溶性PQQGDH，得到10％的產(chǎn)率、640U/mg的比活性(P.Dokter，等(1986)Biochem.J.，239，163-167)。他們將從乙酸鈣不動(dòng)桿菌細(xì)胞中制備的水溶性級(jí)分依次通過陽(yáng)離子交換層析、凝膠過濾層析、陽(yáng)離子交換層析、凝膠過濾層析，并在SDS-PAGE上確認(rèn)了有約為50kDa的單一帶。以后的研究中，得到了44％的產(chǎn)率、2214U/mg的比活性(K.Matsushita，等同上)。更進(jìn)一步地，他們將水溶性PQQGDH的結(jié)構(gòu)基因插入到大腸桿菌產(chǎn)生重組PQQGDH，通過2次陽(yáng)離子交換層析和疏水層析，得到了41％的產(chǎn)率、7400U/mg的比活性(A.J.J.Olsthoorn，和J.A.Duine(1996)Archives of Biochem.Biophys.，336，42-48)。
為了有效地生產(chǎn)PQQGDH，有利用大腸桿菌、酵母或腸細(xì)菌作為宿主的重組制備方法的報(bào)導(dǎo)。如此由重組而表達(dá)的水溶性PQQGDH情況下，該酶表達(dá)為水溶性蛋白，其等電點(diǎn)是非常高的、呈堿性，因此純化主要是使用陽(yáng)離子交換層析。但是，單用陽(yáng)離子交換層析要除去來自于宿主的其它的堿性蛋白質(zhì)是困難的。
另外，作為純化堿性蛋白質(zhì)的方法，為增加與陽(yáng)離子交換柱的親和性，將精氨酸尾作為親和尾部加到C末端上的方法是已知的(H.M.Sassenfeld，and S.J.Brewe(1984)Biotechnology，2，76-81)。如將這一方法運(yùn)用到屬于堿性蛋白質(zhì)的水溶性PQQGDH上，預(yù)期將增加水溶性PQQGDH的表面電荷，增加與陽(yáng)離子交換柱的親和性。但是，如在大腸桿菌中產(chǎn)生如此附加了精氨酸尾部的蛋白質(zhì)，經(jīng)大腸桿菌外膜蛋白酶作用，精氨酸殘基會(huì)在C末端被切斷，存在難以得到純酶樣品的問題。
因此，本發(fā)明目的是提供允許有效地回收重組PQQGDH的修飾型水溶性PQQGDH。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人改良了現(xiàn)有的水溶性PQQGDH，這是進(jìn)行了為開發(fā)可以容易純化的修飾型PQQGDH的深入研究的結(jié)果。通過用精氨酸置換存在于水溶性PQQGDH表面的特定殘基，成功地得到了可以由陽(yáng)離子交換層析容易地純化的突變型酶。
本發(fā)明提供了修飾型葡萄糖脫氫酶，它包括具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶，其中，存在于酶分子表面的選自谷氨酰胺、天冬酰胺和蘇氨酸的一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸殘基被精氨酸置換。
優(yōu)選地，具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶是來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性PQQGDH。
另外，本發(fā)明也提供了修飾型葡萄糖脫氫酶，包括來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶，其中，選自第209位谷氨酰胺殘基、第240位天冬酰胺殘基以及第389位蘇氨酸殘基的一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸殘基被精氨酸置換。更優(yōu)選第209位谷氨酰胺殘基、第240位天冬酰胺殘基以及第389位蘇氨酸殘基被精氨酸置換。
另外，本發(fā)明也提供了包含編碼上述修飾型葡萄糖脫氫酶的基因、包含該基因的載體和包含該基因的轉(zhuǎn)化體、以及包含本發(fā)明的修飾型葡萄糖脫氫酶的葡萄糖分析試劑盒以及葡萄糖傳感器。


圖1，表示制作編碼本發(fā)明修飾型酶的突變基因的方法。
圖2，表示用于本發(fā)明中的質(zhì)粒pGB2的結(jié)構(gòu)。
圖3，顯示本發(fā)明的修飾型酶的SDS-PAGE的照片。
圖4，表示本發(fā)明的修飾型酶的層析級(jí)分的酶活性。
圖5，表示使用本發(fā)明的修飾型PQQGDH的葡萄糖分析。
圖6，表示使用本發(fā)明的修飾型PQQGDH的酶?jìng)鞲衅餍?zhǔn)曲線。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明說明書中明確引用的全部專利文件以及參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全部通過引用并入本說明書中。另外，作為本發(fā)明優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2001-294846號(hào)的說明書中記載的內(nèi)容通過引用全部并入本說明書中。
修飾型PQQGDH的設(shè)計(jì)為制備本發(fā)明的修飾型PQQGDH，根據(jù)野生型水溶性PQQGDH立體結(jié)構(gòu)信息，選擇通過氨基酸的置換而并不改變其酶活性以及穩(wěn)定性等其它特性，可以增加表面電荷的部位。其中所述選擇是按照以下幾個(gè)基準(zhǔn)進(jìn)行的該部位存在于水溶性PQQGDH蛋白質(zhì)表面，該部位是呈中性的殘基，該部位是具有極性的殘基，該部位的側(cè)鏈暴露在分子表面上并認(rèn)為是不與其它殘基進(jìn)行實(shí)質(zhì)性的相互作用的，該部位被認(rèn)為是存在于非酶活性部位或非底物結(jié)合部位的區(qū)域中。通過這樣被選擇的氨基酸殘基用堿性殘基、特別是精氨酸殘基進(jìn)行置換，并不涉及到對(duì)酶活性太大的影響，而能夠增加蛋白質(zhì)表面電荷。優(yōu)選待突變的氨基酸殘基選自谷氨酰胺、天冬酰胺和蘇氨酸。
這樣得到的本發(fā)明的修飾型PQQGDH，可以通過增大的表面電荷，使得與陽(yáng)離子交換層析儀強(qiáng)固地結(jié)合，因此，用陽(yáng)離子交換層析可以容易地從宿主的其它蛋白質(zhì)中分離純化。
另外，只要本發(fā)明的修飾型葡萄糖脫氫酶具有所希望的葡萄糖脫氫酶活性，一些其它的氨基酸殘基可以被缺失或置換，或也可以添加其它氨基酸殘基。
更進(jìn)一步地，本領(lǐng)域技術(shù)人員，也可以對(duì)于來自于其它細(xì)菌的水溶性PQQGDH，按照本發(fā)明的教導(dǎo)選擇存在于分子表面的中性極性殘基，通過該氨基酸殘基被精氨酸置換，能夠容易地得到增加了表面電荷的PQQGDH。
修飾型PQQGDH的制備方法編碼乙酸鈣不動(dòng)桿菌由來的野生型水溶性PQQGDH的基因的序列定義于序列號(hào)2。
編碼本發(fā)明的修飾型PQQGDH的基因可通過在編碼天然水溶性PQQGDH的基因中，用編碼精氨酸的堿基序列置換編碼待置換的氨基酸殘基的堿基序列而構(gòu)建。用于這種位點(diǎn)特異性堿基序列置換的各種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，如，Sambrook等，“Molecular Cloning；A Laboratory Manual”，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中所記載的。
將這樣得到的突變基因插入到基因表達(dá)用載體(如，質(zhì)粒)上，并將這轉(zhuǎn)化入合適的宿主(如，大腸桿菌)。表達(dá)外來性蛋白質(zhì)的許多載體宿主系統(tǒng)是在本技術(shù)領(lǐng)域公知的，作為宿主可以用細(xì)菌、酵母、培養(yǎng)細(xì)胞等等各種不同的材料。
對(duì)如上得到的表達(dá)修飾型PQQGDH的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中通過離心分離等回收后，用弗氏壓碎器粉碎，或經(jīng)滲透壓休克將周質(zhì)的酶釋放到介質(zhì)中。用超速離心分離，可以得到含有PQQGDH的水溶性級(jí)分?；蛘?，通過使用合適的宿主/載體系統(tǒng)，可以使表達(dá)的PQQGDH分泌到培養(yǎng)液中。
然后，得到的水溶性級(jí)分通過陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行純化。關(guān)于蛋白質(zhì)層析純化，可以按本技術(shù)領(lǐng)域一般公知的教科書中記載的方法進(jìn)行。可以用于蛋白質(zhì)純化的各種陽(yáng)離子交換層析柱也是本技術(shù)領(lǐng)域所公知的，在本發(fā)明中用哪一個(gè)都可以。例如，可以用CM-5PW、CM-Toyopearl 650M、SP-5PW(以上來自Tosoh Corp.)、S-sepharose、Mono-S、S-Resorce(以上來自Pharmacia Inc.)。用合適的緩沖液平衡柱，樣品裝入柱內(nèi)，洗掉未吸附的成分。緩沖液可以用如，磷酸緩沖液、MOPS緩沖液等。
然后，使用高鹽濃度的緩沖液，洗脫柱上吸附的成分。鹽濃度可以通過順序地使用鹽濃度不同的多種緩沖液，或通過提供線性梯度的鹽濃度，或通過其組合而變化。樣品的洗脫由吸光測(cè)定法等進(jìn)行監(jiān)控，以適當(dāng)?shù)捏w積分部收集洗脫物。針對(duì)各級(jí)分測(cè)定其酶活性，通過回收所希望的級(jí)分，可以得到純化了的本發(fā)明的修飾型酶。
更進(jìn)一步地，根據(jù)需要，在陽(yáng)離子交換層析的前后，也可以使用本領(lǐng)域公知的與蛋白質(zhì)純化有關(guān)的方法，例如過濾、透析、凝膠過濾層析、親和層析等。
蛋白質(zhì)的純度可以用本領(lǐng)域公知的方法，如SDS-PAGE或HPLC容易地進(jìn)行測(cè)定。
酶活性的測(cè)定方法以PQQ作為輔酶的本發(fā)明PQQGDH具有催化葡萄糖氧化形成葡糖酸內(nèi)酯反應(yīng)的作用。酶活性可以通過使用氧化還原染料的呈色反應(yīng)測(cè)定在PQQGDH將葡萄糖氧化的同時(shí)被還原的PQQ的量來測(cè)量。呈色試劑可以使用如PMS(吩嗪硫酸二甲酯(phenazine methosulfate))-DCIP(2，6-二氯苯基靛酚)、鐵氰化鉀、和二茂鐵等。
葡萄糖分析用試劑盒另外，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的修飾型PQQGDH的葡萄糖分析試劑盒。本發(fā)明葡萄糖分析試劑盒包含足以進(jìn)行至少一次分析的量的本發(fā)明修飾型PQQGDH。典型的試劑盒除了本發(fā)明外還包含修飾型PQQGDH外還包含分析必要的緩沖液、介質(zhì)、為制作校準(zhǔn)曲線的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、以及使用指南。根據(jù)本發(fā)明的修飾型PQQGDH可以以各種不同的形式提供，如冷凍干燥的試劑、或適合的保存液中的溶液。優(yōu)選本發(fā)明的修飾型PQQGDH是以全酶的形式提供，也可以是以脫輔酶形式提供，使用前可以將其全酶化。
葡萄糖傳感器另外，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的修飾型PQQGDH的葡萄糖傳感器(Sensor)。作為電極，可使用碳電極、金電極、鉑電極等，在該電極上固定本發(fā)明的酶。固化方法有，使用交聯(lián)試劑的方法、封入聚合物基質(zhì)的方法、由透析膜包被的方法、使用可光交聯(lián)的聚合物、導(dǎo)電性聚合物、或氧化還原聚合物等，或也可以與諸如二茂鐵或其衍生物等電子介體一起固定在聚合物上或吸附在電極上，或者，也可以使用這些方法的組合。優(yōu)選是本發(fā)明的修飾型PQQGDH以全酶的形式固定在電極上，但也可以脫輔酶形式固化，并且，可以提供PQQ在分開的層或在溶液中。典型地，使用戊二醛將本發(fā)明的修飾型PQQGDH固定化在碳電極上后，用具有氨基的試劑處理，對(duì)戊二醛的游離基團(tuán)進(jìn)行封閉。
葡萄糖濃度的測(cè)定可以按以下方法進(jìn)行。在恒溫小室中加入緩沖液，加入PQQ和CaCl2以及介質(zhì)(Mediator)，維持恒定的溫度。介質(zhì)可以用鐵氰化鉀、吩嗪硫酸二甲酯等。使用固定了本發(fā)明的修飾型PQQGDH的電極作為工作電極，與對(duì)電極(counter electrode)(如，鉑電極)和參比電極(如，Ag/AgCl電極)相組合。在碳電極上加上一定的電壓達(dá)到穩(wěn)定電流后，加入含有葡萄糖的試樣并測(cè)定電流的增加。按照由標(biāo)準(zhǔn)濃度的葡萄糖液制作的校準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出樣品中葡萄糖濃度。
實(shí)施例以下，參照實(shí)施例詳細(xì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明的范圍并不是被這些實(shí)施例所限制。
實(shí)施例1修飾型酶PQQGDH基因的構(gòu)建以表示為序列號(hào)2的來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的PQQGDH的結(jié)構(gòu)基因?yàn)樵牧?，進(jìn)行突變誘導(dǎo)。質(zhì)粒pGB2通過在載體pTrc99A(Pharmacia Inc.)的多克隆位點(diǎn)上插入編碼來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的PQQGDH的結(jié)構(gòu)基因而制備(圖1)。按照常規(guī)方法，通過位點(diǎn)專一突變，將編碼谷氨酰胺209、天冬酰胺240和蘇氨酸389的堿基序列分別由編碼精氨酸的堿基序列置換。位點(diǎn)專一誘變是使用質(zhì)粒pGB2，按照?qǐng)D2顯示的方法進(jìn)行。用于突變的合成寡核苷酸靶引物的序列如下表示。
Q209R5’-gCCAACTCAACgTgAACTgAATg-3’(序列號(hào)3)D229R5’-CTTAAATCTTCgTggAAgTATTC-3’(序列號(hào)4)N240R5’-CCAAgTTTTCgCggggTggTTAg-3’(序列號(hào)5)在載體質(zhì)粒pKF18k(寶酒造(株))中插入包含編碼來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的PQQGDH的基因一部分的Kpn I-Hind III片斷，并將這作為模板。將50fmol模板和寶酒造(株)制備的MutanTM-Express Km試劑盒中附帶的選擇引物(selection primer)5pmol、磷酸化的靶引物50pmol與總體積(20μl)的1/10量的同試劑盒中的退火緩沖液一起混合，經(jīng)100℃3分鐘的熱處理，使質(zhì)粒變性，成為一條鏈。選擇引物是用于恢復(fù)pKF18k抗卡那霉素基因上的雙重琥珀突變的引物。將混合物在冰上放置5分鐘，使引物退火。再在其中加入3μl的同試劑盒中的延伸緩沖液、1μl的T4 DNA連接酶、1μl的T4DNA聚合酶以及5μl的滅菌水，合成互補(bǔ)鏈。
將這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷性菌株大腸桿菌BMH 71-18mutS中，搖床培養(yǎng)一晚擴(kuò)增該質(zhì)粒。
接著，將從中抽提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MV1184，并從其菌落中抽提質(zhì)粒。然后，對(duì)于這些質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以確認(rèn)導(dǎo)入了目的突變。將這一片段替換質(zhì)粒pGB2上編碼野生型PQQGDH的基因Kpn I-Hind III片斷，構(gòu)建成編碼具有Q209R、D229R以及N240R三個(gè)突變的修飾型PQQGDH(以下稱為修飾型PQQGDH)的基因。
實(shí)施例2制備修飾型酶將編碼野生型或修飾型PQQGDH的基因插入到大腸桿菌的表達(dá)載體pTrc99A(Pharmacia Inc.)的多克隆位點(diǎn)上，將構(gòu)建成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α株中。將該轉(zhuǎn)化體用坂口培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)在450ml L培養(yǎng)基(含有50μl/ml氨芐青霉素)中，37℃下?lián)u床培養(yǎng)一晚，接種在7L含有1mM CaCl2、500μMPQQ的L培養(yǎng)基中。培養(yǎng)開始后約3小時(shí)，添加異丙基硫代半乳糖苷，使其最終濃度達(dá)到0.3mM，然后再培養(yǎng)1.5小時(shí)。用離心分離菌體(5,000×g，10分鐘，4℃)并收集菌體，用0.85％NaCl溶液洗2次。將該菌體懸浮在10mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，用弗氏壓碎器破碎(110MPa)后，離心分離(15,000×g，15分鐘，4℃)2次，未破碎的菌體由沉淀物除去。將上清液進(jìn)行超離心分離(40,000r.p.m.，90分鐘，4℃)，得到作為水溶液級(jí)分的上清液。將該級(jí)分在A緩沖液(10mM MOPS-NaOH緩沖液(pH7.0))中4℃透析一晚，得到粗純化物。
實(shí)施例3通過陽(yáng)離子交換層析純化將實(shí)施例2中制備的粗純化物在加入柱前，先在0.2μm過濾器上過濾。使用CM-5PW柱(Tosoh Corp.)，使用10mM MOPS-NaOH(pH7.0)的A緩沖液和0.8M NaCl+10mM MOPS-NaOH(pH7.0)的B緩沖液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析。
首先，用A緩沖液平衡柱子，吸附樣品以后，用柱容量5倍量的A緩沖液進(jìn)行沖洗。然后，用B緩沖液進(jìn)行0M-0.64M NaCl(120分鐘)線性梯度的洗脫，洗脫出目的酶。流速為0.5ml/min，在280nm的吸光波長(zhǎng)下檢測(cè)洗脫出的蛋白質(zhì)。洗脫物每2分鐘收集一次。野生型水溶性PQQGDH在陽(yáng)離子交換層析儀層析約20分鐘，在鹽濃度為80mM附近時(shí)顯示出洗脫峰，修飾型水溶性PQQGDH大約在38分鐘，鹽濃度為190mM附近時(shí)顯示出洗脫峰。
將洗脫峰的級(jí)分在SDS-PAGE上分析的結(jié)果顯示于圖3。對(duì)修飾型水溶性PQQGDH來說，得到目的分子量為50kDa的單一帶。因此，甚至這樣一次層析幾乎可以完全地將其純化。與其相反，在野生型水溶性PQQGDH中可以看見一些雜質(zhì)帶。
實(shí)施例4酶活性測(cè)定酶活性測(cè)定在10mM MOPS-NaOH緩沖液(pH7.0)中使用吩嗪硫酸二甲酯-二氯苯基靛酚(PMS-DCIP)進(jìn)行，用分光光度計(jì)追蹤DCIP在600nm的吸光度變化，其吸光度的減小率定義為其酶的反應(yīng)速度。這里，1分鐘還原1μmol的DCIP的酶活性定義為1個(gè)酶活性單位。DCIP在pH7.0的摩爾吸光系數(shù)為16.3mM-1。
各層析級(jí)分的酶活性顯示在圖4中。橫坐標(biāo)是洗脫的時(shí)間，縱坐標(biāo)是GDH活性。
實(shí)施例5評(píng)價(jià)酶活性以及底物特異性分別將層析得到的活性級(jí)分以及未吸附的級(jí)分、粗級(jí)分置于級(jí)分100倍量的10mM MOPS-NaOH緩沖液(pH7.0)中，4℃下進(jìn)行一晚透析，在1μMPQQ、1mM CaCl2存在下1小時(shí)或1小時(shí)以上進(jìn)行全酶化。將這些級(jí)分分成187μl的等分試樣，向每個(gè)等分試樣中加入3μl的活化試劑(48μl的6mM DCIP，8μl的600mM PMS，16μl的10mM磷酸緩沖液pH7.0)以及10μl選自20mM葡萄糖、2-脫氧-D-葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3-o-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖或麥芽糖溶液的底物，按照實(shí)施例4所示的方法在室溫下測(cè)定等分試樣的酶活性。從底物濃度-酶活性圖求得Km以及Vmax。
對(duì)于葡萄糖來說，野生型水溶性PQQGDH具有大約7100U/mg的活性，修飾型水溶性PQQGDH大約具有7800U/mg的活性，兩者顯示了基本上同樣的活性。另外，對(duì)于葡萄糖以外的各種底物來說，野生型水溶性PQQGDH和修飾型水溶性PQQGDH顯示了基本上相同的Km值與Vmax值，表明引入突變沒有改變底物特異性。
實(shí)施例6葡萄糖分析使用修飾型水溶性PQQGDH進(jìn)行葡萄糖分析。將修飾型酶在1μM PQQ和1mM CaCl2存在下進(jìn)行1小時(shí)或以上的全酶化，測(cè)定各種濃度葡萄糖以及5μM PQQ、10mM CaCl2存在下的酶活性。按照實(shí)施例4所記載的酶活性測(cè)定法，以DCIP的600nm的吸光度的變化作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。如圖5所示，用修飾型水溶性PQQGDH可以在5mM-50mM范圍內(nèi)進(jìn)行葡萄糖定量。
實(shí)施例7酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浼霸u(píng)價(jià)在5U修飾型酶中加入約20mg的碳糊(carbon paste)，冷凍干燥。充分混合后，僅在預(yù)先充填有約40mg碳糊的碳糊電極表面施加該混合物，在濾紙上進(jìn)行磨光。室溫下，將此電極在含有1％戊二醛的10mM MOPS緩沖液(pH 7.0)中處理30分鐘后，在含有20mM賴氨酸的10mM MOPS緩沖液(pH 7.0)中室溫下處理20分鐘以封閉戊二醛。并在室溫下將該電極在10mM MOPS緩沖液(pH 7.0)中平衡1小時(shí)或1小時(shí)以上。4℃下保存該電極。
用制作成的酶?jìng)鞲衅鬟M(jìn)行葡萄糖濃度的測(cè)定。得到的校準(zhǔn)曲線如圖6所示。如圖所示，使用固定了本發(fā)明的修飾型PQQGDH的酶?jìng)鞲衅骺梢栽?mM-12mM范圍內(nèi)進(jìn)行葡萄糖的定量。
產(chǎn)業(yè)上利用本發(fā)明提供了一種允許有效地回收重組產(chǎn)生的PQQGDH的修飾型水溶性PQQGDH。本發(fā)明的修飾型酶可有利地用于臨床檢查和食品分析等的葡萄糖定量方面。
序列表<110>Sode，Koji<120>葡萄糖脫氫酶<130>psg9008WO<150>JP 2001-294846<151>2001-09-26<160>5<210>1<211>454<212>PRT<213>乙酸鈣不動(dòng)桿菌<400>1Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His
130 135 140Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365
Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445Phe Thr Tyr Lys Ala Lys450<210>2<211>1612<212>DNA<213>乙酸鈣不動(dòng)桿菌<400>2agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720
taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點(diǎn)突變用引物<400>3gccaactcaa cgtgaactga atg<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點(diǎn)突變用引物
<400>4cttaaatctt cgtggaagta ttc<210>5<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點(diǎn)突變用引物<400>5ccaagttttc gcggggtggt tag
權(quán)利要求
1.一種修飾型葡萄糖脫氫酶，其中，在具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶中，以精氨酸置換存在于該酶分子表面的選自谷氨酰胺、天冬酰胺和蘇氨酸的一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求1中記載的修飾型葡萄糖脫氫酶，其中，所述具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶是來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性PQQGDH。
3.一種修飾型葡萄糖脫氫酶，其中，在來自于乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶中，以精氨酸置換選自第209位谷氨酰胺殘基、第240位天冬酰胺殘基以及第389位蘇氨酸殘基的一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸殘基。
4.權(quán)利要求3中記載的修飾型葡萄糖脫氫酶，其中，第209位谷氨酰胺殘基、第240位天冬酰胺殘基以及第389位蘇氨酸殘基分別被精氨酸置換。
5.一種基因，其編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中記載的修飾型葡萄糖脫氫酶。
6.一種載體，其包含權(quán)利要求5中記載的基因。
7.一種轉(zhuǎn)化體，其包含權(quán)利要求5中記載的基因。
8.一種生物，其含有整合在其主染色體中的權(quán)利要求5中記載的基因。
9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中記載的修飾型葡萄糖脫氫酶的制備方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8中記載的生物。
10.一種葡萄糖分析用試劑盒，其包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中記載的修飾型葡萄糖脫氫酶。
11.一種葡萄糖傳感器，其中所述傳感器包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中記載的修飾型葡萄糖脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有吡咯并喹啉醌作為輔酶的修飾型水溶性葡萄糖脫氫酶，其中，存在于水溶性葡萄糖脫氫酶分子表面，存在于氨基酸殘基側(cè)鏈露出在分子表面上的區(qū)域中，不與其它殘基相互作用，和被認(rèn)為不是酶的活性部位或底物結(jié)合部位的區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸殘基被精氨酸置換。優(yōu)選的該至少一個(gè)氨基酸殘基選自谷氨酰胺、天冬酰胺和蘇氨酸。這種修飾型酶可以在重組制備后有效地被回收。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1571841SQ0282065
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月26日
發(fā)明者早出廣司 申請(qǐng)人:早出廣司