專利名稱：：葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以吡咯并-會(huì)啉醌作為輔酶的葡萄糖脫氫酶(PQQGDH)的制備及其在葡萄糖檢測(cè)方面的用途。
背景技術(shù)：
：血糖是糖尿病的一個(gè)重要指標(biāo)。在利用微生物的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)葡萄糖濃度來(lái)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程。傳統(tǒng)的葡萄糖檢測(cè)方法是基于利用葡萄糖氧化酶(GOD)或6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)的酶促方法。然而，基于GOD的檢測(cè)方法需要將一種過(guò)氧化氫酶或過(guò)氧化物酶添加到檢測(cè)系統(tǒng)中以便定量測(cè)定通過(guò)葡萄糖氧化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氬。G6PDHs已被用于葡萄糖的分光光度測(cè)定，在這種情況下，必須將輔酶NAD(P)加到反應(yīng)系統(tǒng)中。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)葡萄糖的親合力增強(qiáng)了的修飾水溶性PQQGDH。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種對(duì)葡萄糖具有高度選擇性的修飾水溶性PQQGDH以便提高檢測(cè)血糖濃度的靈敏度。本發(fā)明的>^開我們發(fā)現(xiàn)對(duì)葡萄糖具有高度親合力的PQQGDHs有利于作為以往葡萄糖酶促測(cè)定中使用的酶的新型酶替代物。PQQGDHs是以吡咯并-會(huì)啉醌作為輔酶的葡萄糖脫氫酶，其催化葡萄糖被氧化生成葡糖酸內(nèi)酯的反應(yīng)。已知PQQGDHs包括膜-結(jié)合酶和水溶性酶。膜-結(jié)合PQQGDHs是分子量大約為87kDa的單肽蛋白并且被發(fā)現(xiàn)普遍存在于革蘭氏陰性菌中。例如，參見AM.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.(1990)172，6308-6315.另一方面，已鑒定出乙酸鉀不動(dòng)桿菌的幾個(gè)菌株中含有水溶性PQQGDHs(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555),并且克隆了表達(dá)這些水溶性G6PDHs的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)基因(Mol.Gen.Genet.(1989)，217:430-436)。源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDHs是一種分子量大約為50kDa的同型二聚體。它與其它PQQ酶在蛋白質(zhì)的初級(jí)結(jié)構(gòu)上幾乎不具有同源性。近來(lái)，據(jù)報(bào)導(dǎo)該酶的X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明該酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)含有活性中心(J.Mol.Biol.，289,319-333(1999)，源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的脫輔基形式的可溶性醌蛋白葡萄糖脫氳酶的晶體結(jié)構(gòu)顯示了一個(gè)新型的內(nèi)保守序列重復(fù)；A.0ubrie等，EMBOJournal,18(19)5187-5194(1999)，可溶性醒蛋白葡萄糖脫氫酶的結(jié)構(gòu)和機(jī)理；A.0ubrie等，PNAS，96(21)，11787-11791(1999),與甲肼絡(luò)合的可溶性醌蛋白葡萄糖脫氫酶的活性-位點(diǎn)結(jié)構(gòu)；一種共價(jià)輔因子-抑制劑絡(luò)合物，A.Oubrie等)。這些論文表明水溶性-PQQGDH是一種由6個(gè)w-基元組成的p-螺旋蛋白。為了通過(guò)改善傳統(tǒng)水溶性PQQGDH以增強(qiáng)其對(duì)葡萄糖的親合力來(lái)研制一種能夠用于臨床檢測(cè)或食品分析的修飾的PQQGDH,我們進(jìn)行了認(rèn)真研究，結(jié)果成功地獲得了一種由于將一個(gè)氨基酸的變化引進(jìn)水溶性PQQGDH的特定區(qū)域而對(duì)葡萄糖具有高度親和力的酶。因此，本發(fā)明提供了一種以吡咯并-喹啉醌作為輔酶的修飾水溶性葡萄糖脫氫酶，其特征在于天然水溶性葡萄糖脫氫酶中的至少一個(gè)氨基酸殘基被另外一個(gè)氨基酸殘基所取代并且所述修飾的水溶性葡萄糖脫氫酶對(duì)葡萄糖的親合力比天然水溶性葡萄糖脫氬酶對(duì)葡萄糖的親合力高。本發(fā)明的修飾PQQGDH對(duì)葡萄糖的Km值低于天然PQQGDH的Km值，優(yōu)選地低于20mM，更優(yōu)選地低于10mM.盡管本發(fā)明的修飾葡萄糖脫氫酶對(duì)其它糖的親和力未得到改變或降低，但優(yōu)選地，對(duì)葡萄糖的親和力增強(qiáng)了，因而它對(duì)葡萄糖的選擇性比天然水溶性葡萄糖脫氫酶對(duì)葡萄糖的選擇性要高。尤其是，與對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性相反，對(duì)乳糖或麥芽糖的反應(yīng)性比野生型對(duì)乳糖或麥芽糖的反應(yīng)性低.假設(shè)對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性是100%，那么對(duì)乳糖或麥芽糖的反應(yīng)活性優(yōu)選地是60%或更低，更優(yōu)選地是50%或更低，進(jìn)一步更優(yōu)選地是40%或更低。在本發(fā)明的PQQ葡萄糖脫氫酶的實(shí)施方案中，與乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的殘基268-289或448-468對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代，即被一個(gè)不同于天然PQQ葡萄糖脫氫酵中的相關(guān)氨基酸殘基的氨基酸殘基所取代。本文氨基酸編號(hào)是從起始甲硫氨酸開始作為+1位置。本文使用的與氨基酸殘基或區(qū)域有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)于"指的是某些氨基酸殘基或區(qū)域在兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)相似的不同蛋白質(zhì)中具有同等功能。例如，如果源于其它生物而非乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDHs中的任何區(qū)域與源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中由殘基268-289限定的區(qū)域具有高度的氨基酸序列相似性并且根據(jù)該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)合理地推定該區(qū)域在該蛋白質(zhì)中具有同樣的功能，那么認(rèn)為該區(qū)域"對(duì)應(yīng)于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中由殘基268-289限定的區(qū)域"。另外，認(rèn)為該區(qū)域中的第IO個(gè)氨基酸殘基"對(duì)應(yīng)于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的第277個(gè)殘基"。在本發(fā)明優(yōu)選的修飾PQQGDHs中，對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l所示氨基酸序列中的谷氨酸277、異亮氨酸278、天冬酰胺462、天冬酰胺452、賴氨酸455、天冬氨酸456、天冬氨酸457或天冬氨酸448的至少一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。在本發(fā)明更優(yōu)選的修飾PQQGDHs中，SEQIDNO:l所示氨基酸序列中的谷氨酸277被選自丙氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、幾氨酸和甘氨酸的一個(gè)氨基酸殘基所取代，或者異亮氨酸278被笨丙氨酸所取代.另一方面，本發(fā)明的修飾PQQGDHs包含以下序列Xaa8ThrAlaGlyXaalValGinXaa2Xaa3Xaa4GlySerValThrXaa5ThrLeuGluAsnProGly其中Xaal、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa8代表任何天然氨基酸殘基，條件是當(dāng)Xaal代表Asn，Xaa2代表Lys,Xaa3代表Asp,Xaa4代表Asp和Xaa5代表Asn時(shí)，Xaa8不代表Asp。另一方面，本發(fā)明的修飾PQQGDHs包含以下序列SerGluGinGlyProAsnSerAspAspXaa6Xaa7AsnLeulieValLysGlyGlyAsnTyrGlyTrp其中Xaa6和Xaa7代表任何天然氨基酸殘基，條件是當(dāng)Xaa6代表Glu時(shí)，Xaa7不代表Ile。本發(fā)明還提供了一種編碼上述任何修飾葡萄糖脫氫酶的基因，含有所述基因的載體和含有所述基因的轉(zhuǎn)化體，以及葡萄糖檢測(cè)試劑盒和含有本發(fā)明的修飾葡萄糖脫氫酶的葡萄糖傳感器。由于本發(fā)明的修飾的PQQGDHs的酶蛋白對(duì)葡萄糖具有很高的親合力和氧化活性，所以它們能被用于高靈敏度和高選擇性的葡萄糖檢測(cè)。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖l表示用于本發(fā)明的質(zhì)粒pGB2的結(jié)構(gòu)。圖2表示制備編碼本發(fā)明的修飾酶的突變基因的圖解。圖3表示利用本發(fā)明的修飾PQQGDH進(jìn)行的葡萄糖檢測(cè)。本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案修飾的PQQGDHs的結(jié)構(gòu)為了構(gòu)建一個(gè)攜帶氨基酸改變的水溶性PQQGDHs的文庫(kù)，我們通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)將隨機(jī)突變引進(jìn)編碼水溶性PQQGDH的基因的編碼區(qū)。這些基因被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并且篩選對(duì)葡萄糖的PQQGDHs活性以便得到幾個(gè)表達(dá)PQQGDHs的克隆,該P(yáng)QQGDHs對(duì)20mM的葡萄糖和對(duì)100mM的葡萄糖的活性相當(dāng)以及對(duì)低濃度葡萄糖的反應(yīng)性高于野生型酶。對(duì)這些克隆中的一個(gè)克隆的核苷酸序列分析的結(jié)果表明Glu277被換成Gly。當(dāng)這個(gè)氨基酸殘基被其它不同的氨基酸殘基所取代時(shí)，在每一種情況下都獲得了對(duì)葡萄糖的親合力高于野生型水溶性PQQGDH的最佳突變酶。然后，將位點(diǎn)特異性突變引入第277個(gè)殘基附近的其它殘基中并測(cè)定對(duì)葡萄糖的親合力。制備在殘基268-289所限定的區(qū)域中帶有Ile278Phe和Asn279His的修飾酶并檢測(cè)其活性，結(jié)果表明這些修飾酶對(duì)葡萄糖具有很高的親合力。進(jìn)一步篩選上述獲得的幾個(gè)克隆以便得到表達(dá)PQQGDHs的克隆，該P(yáng)QQGDHs對(duì)20mM葡萄糖的活性相當(dāng)于野生型PQQGDH的活性而對(duì)20mM乳糖的活性則低于野生型PQQGDH的活性。對(duì)這些克隆中的一個(gè)克隆的核苷酸序列分析的結(jié)果表明Asn452被換成Asp。當(dāng)這個(gè)氨基酸殘基被蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸或天冬氨酸所取代時(shí)，在每一種情況下都獲得了對(duì)葡萄糖的選擇性高于野生型水溶性PQQGDH的最佳突變酶。也以同樣的方式將突變引入第452個(gè)殘基附近的其它殘基中。構(gòu)建帶有Lys455Ile、Asp456Asn、Asp457Asn、Asn462Asp、Asp448Asn的突變酶。結(jié)果如表4所示，發(fā)現(xiàn)所有的突變酶對(duì)葡萄糖的選擇性都提高了。在本發(fā)明的優(yōu)選PQQ葡萄糖脫氫酶中，至少有一個(gè)位于與乙酸釣不動(dòng)軒菌的水溶性PQQGDH中的殘基448-468對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。在本發(fā)明優(yōu)選的修飾PQQGDHs中，至少有一個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1所示氨基酸序列中的天冬酰胺462、賴氨酸452、天冬氨酸456、天冬氨酸457或天冬氨酸448的氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。另一方面，本發(fā)明修飾的PQQGDHs包含序列Xaa8ThrAlaGlyXaalValGinXaa2Xaa3Xaa4GlySerValThrXaa5ThrLeuGluAsnProGly其中Xaal、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa8代表任何天然氨基酸殘基，條件是當(dāng)Xaal代表Asn，Xaa2代表Lys,Xaa3代表Asp,Xaa4代表Asp和Xaa5代表Asn時(shí),Xaa8不代表Asp。在本發(fā)明的其它優(yōu)選的PQQ葡萄糖脫氳酶中，至少有一個(gè)位于與SEQIDNO:1所示氨基酸序列中的殘基268-289對(duì)應(yīng)的區(qū)域中的氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。在本發(fā)明特別優(yōu)選的修飾PQQGDHs中，SEQIDNO:1所示氨基酸序列中的谷氨酸277被選自丙氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和甘氨酸的氨基酸殘基所取代，或者異亮氨酸278被笨丙氨酸所取代。另一方面，本發(fā)明修飾的PQQGDHs包含序列SerGluGinGlyProAsnSerAspAspXaa6Xaa7AsnLeulieValLysGlyGlyAsnTyrGlyTrp其中Xaa6和Xaa7代表任何天然氨基酸殘基，條件是當(dāng)Xaa6代表Glu時(shí)，Xaa7不代表Ile。在本發(fā)明的修飾葡萄糖脫氫酶中，其它的氨基酸殘基可以部分缺失或被部分取代或者可以插入其它的氨基酸殘基而仍保持葡萄糖脫氫酶的活性。根據(jù)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還能通過(guò)取代源于其它細(xì)菌的水溶性PQQGDHs中的一個(gè)氨基酸殘基來(lái)獲得對(duì)葡萄糖的親合力增強(qiáng)的修飾葡萄糖脫氳酶。尤其是，源于乙酸鉤不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的對(duì)應(yīng)于谷氨酸277、異亮氨酸278、天冬酰胺462、賴氨酸452、天冬氨酸455、天冬氨酸456、天冬氨酸457和天冬氨酸448的氨基酸殘基可通過(guò)比較序列對(duì)比中的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)或比較由該酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出的二級(jí)結(jié)構(gòu)而被輕易地識(shí)別。根據(jù)本發(fā)明，能夠通過(guò)取代這類氨基酸殘基來(lái)獲得對(duì)底物親合力增強(qiáng)的修飾的葡萄糖脫氫酶。這些修飾的葡萄糖脫氫酶也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。制備修飾PQQGDHs的方法SEQIDN0:2定義了編碼源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的野生型水溶性PQQGDH的基因序列。編碼本發(fā)明的修飾PQQGDHs的基罔可通過(guò)用編碼一個(gè)待取代的氨基酸殘基的核苷酸序列取代編碼野生型水溶性PQQGDH的基因中的編碼一個(gè)特定氨基酸殘基的核苷酸序列來(lái)構(gòu)建。用于這種位點(diǎn)特異性核苷酸序列取代的各種技術(shù)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的，例如如Sambrook等,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"，第二版，1989,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約所描述的。如此獲得的突變基因被插入基因表達(dá)載體(例如，質(zhì)粒)中并被轉(zhuǎn)化到合適的宿主(例如，大腸桿菌)中。幾種表達(dá)外源蛋白的載體/宿主系統(tǒng)是已知的并且各種不同的宿主如細(xì)菌、酵母或培養(yǎng)細(xì)胞是適合的。通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)將隨機(jī)突變引進(jìn)靶區(qū)域來(lái)構(gòu)建一個(gè)在把區(qū)域中攜帶突變的修飾水溶性PQQGDH的基因文庫(kù)。將這些基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中來(lái)篩選其中的PQQGDH對(duì)葡萄糖具有親合力的各克隆。當(dāng)水溶性PQQGDHs在大腸桿菌中得到表達(dá)時(shí)，它們被分泌到壁膜間隙中，因此利用大腸桿菌細(xì)胞能夠方便地檢測(cè)水溶性PQQGDHs的酶活性。在有20mM的葡萄糖存在的條件下，將這個(gè)文庫(kù)與一種PMS-DCIP染料結(jié)合以便目測(cè)PQQGDH活性，由此逸擇出所示活性相當(dāng)于對(duì)100mM葡萄糖的活性的克隆并且通過(guò)分析核苷酸序列來(lái)確認(rèn)突變。為了獲得對(duì)葡萄糖的選擇性增強(qiáng)的修飾PQQGDHs,將這個(gè)文庫(kù)與一種PMS-DCIP染料結(jié)合以便目測(cè)PQQGDH活性，由此選擇出所示對(duì)20mM葡萄糖的活性相當(dāng)于野生型PQQGDH對(duì)20mM葡萄糖的活性而所示對(duì)20mM乳糖的活性低于野生型PQQGDH對(duì)20mM乳糖的活性的克隆并且通過(guò)分析核苷酸序列來(lái)確認(rèn)突變。培養(yǎng)并采用離心或其它方法從培養(yǎng)基中收集如此獲得的表達(dá)修飾PQQGDHs的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后采用弗氏壓碎器或滲壓震擾破碎該轉(zhuǎn)化細(xì)胞以便將壁膜酶釋放到培養(yǎng)基中.可對(duì)該酶進(jìn)行超離心以便得到含有水溶性PQQGDH的組分?；蛘?，可利用適當(dāng)?shù)乃拗?栽體系統(tǒng)將表達(dá)的PQQGDH分泌到培養(yǎng)基中。采用離子交換層析、親和層析、HPLC等方法純化得到的水溶性組分來(lái)制備一種本發(fā)明的修飾PQQGDH。測(cè)定酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的PQQGDHs與在催化葡萄糖氧化制備葡糖酸內(nèi)酯的反應(yīng)中作為輔酶的PQQ有關(guān)。所述酶活性的測(cè)定可以通過(guò)利用氧化還原染料的顏色產(chǎn)生反應(yīng)測(cè)定PQQGDH催化的葡萄糖氧化所還原的PQQ的量來(lái)進(jìn)行。合適的顏色產(chǎn)生試劑包括例如PMS(吩漆硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚靛酚)、高鐵氰化鉀和二茂鐵。對(duì)葡萄糖的親合力本發(fā)明的修飾PQQGDHs與野生型的PQQGDHs相比，對(duì)葡萄糖的親合力有了很大的提高。因此，修飾的PQQGDHs對(duì)葡萄糖的Km值大大低于野生型PQQGDH對(duì)葡萄糖的Km值。在修飾的PQQGDHs中間，Glu277Lys變異體對(duì)葡萄糖的Km值為8.8mM并具有相當(dāng)于野生型酶的最大活性，因此該變異體對(duì)低濃度葡萄糖的反應(yīng)性增強(qiáng)了。因此，用本發(fā)明的修飾酶制備的檢測(cè)試劑盒或酶?jìng)鞲衅饔捎趯?duì)葡萄糖檢測(cè)的靈敏度高而具有能檢測(cè)低濃度葡萄糖的明顯優(yōu)點(diǎn)。選擇性的評(píng)估方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的PQQGDHs對(duì)葡萄糖的選擇性可以通過(guò)上述以不同的糖如2-脫氧-D-葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3-鄰-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖和麥芽糖作為底物檢測(cè)酶活性和確定對(duì)葡萄糖活性的相對(duì)活性來(lái)進(jìn)行評(píng)估。葡萄糖檢測(cè)試劑盒本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明的修飾PQQGDH的葡萄糖檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的葡萄糖檢測(cè)試劑盒含有本發(fā)明修飾的PQQGDH的量足以用于至少一個(gè)循環(huán)的檢測(cè)。除了本發(fā)明的修飾PQQGDH外，該試劑盒還含有一種用于檢測(cè)的必需緩沖液、一種介體、用于制作校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和說(shuō)明書.本發(fā)明的修飾PQQGDHs能夠以諸如凍干試劑或含有適當(dāng)保存液的溶液的多種形式來(lái)提供。盡管本發(fā)明的修飾PQQGDHs也能以脫輔酶的形式來(lái)提供并在使用前被轉(zhuǎn)化為全酶，但是優(yōu)選地是它們以全酶的形式來(lái)提供。葡萄糖傳感器本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的修飾PQQGDH的葡萄糖傳感器。合適的電極包括碳、金、鉑等電極，通過(guò)利用交聯(lián)劑；包封在一種聚合物基質(zhì)中；用透析膜包裹；利用一種光交聯(lián)性聚合物，一種電傳導(dǎo)性聚合物或一種氧化還原聚合物；將酶固定在一種聚合物中或用包括二茂鐵或其衍生物在內(nèi)的電子介體將其吸附在電極上；或其任意的組合將本發(fā)明的酶固定在這些電極上。盡管本發(fā)明的修飾PQQGDHs可以以脫輔酶的形式被固定化并且PQQ可以以分離層的形式或在溶液中來(lái)提供，但是它們優(yōu)選地是以全酶的形式被固定在電極上。典型地，本發(fā)明的修飾PQQGDHs通過(guò)戊二醛被固定在炭精電極上，然后用一種含胺試劑處理以封閉戊二醛。葡萄糖的濃度按照以下方法進(jìn)行測(cè)定。將PQQ、CaCl2和一種介體加到含有緩沖液的恒溫器小池中并保持在恒定的溫度下。合適的介體包括，例如高鐵氰化鉀和吩嘸硫酸甲酯。其上固定了本發(fā)明的修飾PQQGDH的電極與計(jì)數(shù)電極(例如鉑電極)和參比電極(例如Ag/AgCl電極)一起被用作工作電極。為了達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的電流將一恒定電壓加到炭精電極上后，加入含有葡萄糖的樣品來(lái)測(cè)定電流的增加量?？捎刹捎脴?biāo)準(zhǔn)濃度的葡萄糖溶液制作的校正曲線來(lái)計(jì)算樣品中的葡萄糖濃度。本文引用的所有專利和文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全部被引入本文作為參考。本申請(qǐng)要求了基于申請(qǐng)?zhí)枮?999-124285和2000-9137的日本專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容全部被引入本文作為參考。下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡述了本發(fā)明，然而，并不只限于此。實(shí)施例1PQQGDH基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選:質(zhì)粒pGB2是通過(guò)將編碼源于乙酸鉤不動(dòng)桿菌的PQQGDH的結(jié)構(gòu)基因插入到載體pTrc99A(Pharmacia)的多克隆位點(diǎn)而獲得的(圖1)。該質(zhì)粒被用作通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)將隨機(jī)突變引入不同區(qū)域的模板。PCR在含有表1所列組分的溶液中于94"C下進(jìn)行3分鐘，94X:下進(jìn)行3分鐘循環(huán)30次，50t:下進(jìn)行2分鐘和下進(jìn)行2分鐘，最后72t:下進(jìn)行IO分鐘。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>產(chǎn)生的突變水溶性PQQGDH文庫(kù)被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并且將所形成的各菌落轉(zhuǎn)移到微量滴定板上。進(jìn)一步將所述菌落在第一塊含有10mM葡萄糖和PMS-DCIP的復(fù)制平板以及第二塊含有100mM葡萄糖和PMS-DCIP的復(fù)制平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，對(duì)兩塊平板進(jìn)行PQQGDH活性的目測(cè)評(píng)估。由此獲得了兩塊平板中的幾個(gè)具有相當(dāng)PQQGDH活性的克隆。從這些克隆中隨機(jī)逸擇一個(gè)克隆并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列分析，結(jié)果表明谷氨酸277被改變?yōu)楦拾彼?。?shí)施例2由實(shí)施例1獲得的各菌落被轉(zhuǎn)移到微量滴定板上。將所述菌落在第一塊含有20mM葡萄糖和PMS-DCIP的復(fù)制平板以及第二塊含有20mM乳糖和PMS-DCIP的復(fù)制平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，對(duì)兩塊平板進(jìn)行PQQGDH活性的目測(cè)評(píng)估。由此獲得了兩塊平板中的幾個(gè)對(duì)乳糖的活性明顯低于對(duì)葡萄糖的活性的克隆。從這些克隆中隨機(jī)選擇一個(gè)克隆并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列分析，結(jié)果表明天冬酰胺452被改變?yōu)樘於彼?。?shí)施例3修飾PQQGDH基因的構(gòu)建基于SEQIDNO:2所示的源于乙酸鉤不動(dòng)桿菌的PQQGDH的結(jié)構(gòu)基因，利用質(zhì)粒pGB2按照如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)定點(diǎn)誘變使編碼谷氨酸277或異亮氨酸278的核苷酸序列被編碼給定氨基酸殘基的核苷酸序列所取代。表2顯示了用于誘變的合成寡核苷酸靶引物的序列。在表2中，"E277A"指的是谷氨酸277被例如天冬氨酸所取代。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>將含有編碼源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的PQQGDH的部分基因的Kpnl-HindIII片段整合到載體質(zhì)粒pKF18k(TakaraShuzoCo.,Ltd.)中并被用作模板。將50fmol的這種模板、5pmol的MutanTM-ExpresssKm試劑盒(TakaraShuzoCo.，Ltd.)中附帶的選擇引物和50pmol的磷酸化乾引物與相當(dāng)于1/10總體積量(20pi)的試劑盒中附帶的退火緩沖液相混合，并將混合物在ioox:下加熱3分鐘以便使質(zhì)粒變性成單鏈。所述選擇引物用于回復(fù)pKF18k的卡那霉素抗性基因上的雙重琥珀突變。將所述混合物放置在水上保持5分鐘以便使引物退火。向該混合物中加入3jil的所述試劑盒中附帶的延伸緩沖液、1nl的T4DNA連接酶、1pi的T4DNA聚合酶和5jil的無(wú)菌水以便合成一條互補(bǔ)鏈。該合成的互補(bǔ)鏈被轉(zhuǎn)化到錯(cuò)配修復(fù)-缺陷菌抹大腸桿菌B細(xì)71-18mutS中并過(guò)夜振蕩培養(yǎng)來(lái)擴(kuò)增所述質(zhì)粒。然后，將質(zhì)?？截悘呐囵B(yǎng)物中提取出來(lái)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MV1184中，然后從菌落中提取出來(lái)。對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以便證實(shí)引入了預(yù)定的突變。將這些片段替換成質(zhì)粒pGB2A上的編碼野生型PQQGDH的基因片段來(lái)構(gòu)建編碼修飾PQQGDHs的基因。為了將組氨酸替換為天冬酰胺452，以同樣的方式合成一種序列為5，-CATCTTTTTGGACATGTCCGGCAGTAT-3，的寡核苷酸把引物。利用質(zhì)粒pGB2按照?qǐng)D2所示的方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變。還構(gòu)建了編碼攜帶突變Asp448Asn、Asn452Asp、Asn452His、Asn452Lys、Asn452Thr、Asn452Ile、Lys455Ile、Asp456Asn、Asp457Asn和Asn462Asp的修飾PQQGDHs的基因。實(shí)施例4修飾酶的制備將編碼野生型或各修飾PQQGDH的基因插入大腸桿菌表達(dá)載體pTrc99A(Pharmacia)的多克隆位點(diǎn)中，并將產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹DH5ct中。該轉(zhuǎn)化體在Sakaguchi搖瓶中的450mlL培養(yǎng)基(含有50jig/ml的氨千青霉素)中于37TC下進(jìn)行過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，然后接種到71的含有1mMCaCL和500jiMPQQ的L培養(yǎng)基中。開始培養(yǎng)后大約3小時(shí)，加入終濃度為0.3mM的異丙基硫代半乳糖普，然后繼續(xù)培養(yǎng)1.5小時(shí)。通過(guò)離心(5000xg,IO分鐘，4C)從培養(yǎng)基中收集培養(yǎng)細(xì)胞，并用0.85%的NaCl溶液洗滌兩次。采用弗氏壓碎器對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后離心(10000xg，15分鐘，4"C)去除未破碎的細(xì)胞。對(duì)上清液進(jìn)行超離心(160500xg(40000r.p.西.)，90分鐘，4t:)以便得到水溶性組分，該水溶性組分在以下實(shí)施例中被用作粗酶樣品。用10mM的pH7.0的磷酸鹽緩沖液對(duì)如此獲得的水溶性組分進(jìn)行過(guò)夜透析.將透析的樣品吸附到預(yù)先經(jīng)10inM的pH7.0的磷酸鹽緩沖液平衡的陽(yáng)離子色譜柱TSKgelCM-TOYOPEARL650M(TosohCorp.)上。用750ml10mM的pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌該柱，然后用含有0-0.2MNaCl的10mM的pH7.0的磷酸鹽緩沖液以5ml/分鐘的流速將酶洗脫下來(lái)。收集具有GDH活性的組分，然后用10mM的pH7.0的MOPS-NaOH緩沖液進(jìn)行過(guò)夜透析。由此獲得電泳均勻的修飾PQQGDH蛋白。該修飾PQQGDH蛋白在下面的實(shí)施例中被用作純酶樣品。實(shí)施例5酶活性的測(cè)定通過(guò)在10mM的MOPS-NaOH緩沖液(pH7.0)中使用PMS(吩溱硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚靛酚)和利用分光光度計(jì)來(lái)監(jiān)測(cè)DCIP在600nm處吸光度的變化并且將酶的反應(yīng)速率表示為吸光度的降低速率來(lái)測(cè)定酶的活性。在1分鐘之內(nèi)還原1jimolDCIP的酶活性為1U。DCIP在pH7.0時(shí)的摩爾消光系數(shù)為16.3mM"1.實(shí)施例6粗酶樣品對(duì)葡萄糖的親合力的評(píng)估將野生型和實(shí)施例4中所獲得的修飾PQQGDHs的各粗酶樣品在有1HMPQQ和1mMCaCl2存在的條件下經(jīng)過(guò)1小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間轉(zhuǎn)化為全酶。將一個(gè)187jil的等分試樣與3pl的活化劑(由48nl的6mMDCIP、8nl的600mMPMS和16pl的pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液制備而成)和不同濃度的10nL的D-葡萄糖溶液混合，然后在室溫下采用實(shí)施例5所示的方法測(cè)定酶的活性。通過(guò)底物濃度相對(duì)酶活性作曲線來(lái)測(cè)定Km。結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>迄今為止，所報(bào)道的野生型PQQGDH對(duì)葡萄糖的Km值大約為25mM。相反，本申請(qǐng)所構(gòu)建的攜帶有谷氨酸277和11e278Phe突變的所有酶對(duì)葡萄糖的Km值低于10mM。這些結(jié)果表明本發(fā)明的修飾PQQGDHs對(duì)葡萄糖具有很高的親合力。實(shí)施例7純化的酶樣品對(duì)葡萄糖的親合力的評(píng)估將野生型酶和實(shí)施例4中所獲得的修飾酶Glu277Lys的各純化的酶樣品在有1jiMPQQ和1mMCaCl2存在的條件下以與實(shí)施例6相同的方式經(jīng)過(guò)1小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間轉(zhuǎn)化為全酶。將一個(gè)187pl的等分試樣與3pl的活化劑(由48jil的6mMDCIP、8pl的600mMPMS和16^1的pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液制備而成)和不同濃度的10pL的D-葡萄糖溶液混合，然后在室溫下采用實(shí)施例5所示的方法測(cè)定酶的活性。通過(guò)底物濃度相對(duì)酶活性作曲線來(lái)測(cè)定Km和Vmax。Glu277Lys變異體對(duì)葡萄糖的Km值大約為8.8mM和Vmax值為3668U/mg。迄今為止，所報(bào)道的野生型PQQGDH對(duì)葡萄糖的Km值大約為25mM而取決于測(cè)定的條件Vmax值為2500-7000U/mg。這些結(jié)果表明修飾的PQQGDHsGlu277Lys對(duì)葡萄糖的親合力明顯增強(qiáng)并且活性高于野生型PQQGDH的活性。實(shí)施例8底物特異性的評(píng)估檢測(cè)不同修飾酶的粗制樣品的底物特異性。將野生型和不同的修飾PQQGDHs的各粗制樣品在有1jiMPQQ和1mMCaCl2存在的條件下經(jīng)過(guò)1小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間轉(zhuǎn)化為全酶。將一個(gè)187jil的等分試樣與3Kil的活化劑(含有6mM的DCIP、600mM的PMS和pH7.0的10mM的磷酸鹽緩沖液制備而成)和一種底物混合。被檢測(cè)的底物是400mM的葡萄糖、乳糖和終濃度為20mM的麥芽糖，每一樣品與每一10pl的底物在室溫下溫育30分鐘，然后以與實(shí)施例5相同的方式測(cè)定酶的活性以此確定以對(duì)葡萄糖活性的百分比表示的相對(duì)活性。如表4所示，本發(fā)明的所有修飾酶對(duì)葡萄糖的選擇性比野生型酶對(duì)葡萄糖的選擇性高。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例9葡萄糖的測(cè)定修飾PQQGDHs被用來(lái)測(cè)定葡萄糖。將每一種修飾酶Glu277Lys和Asn452Thr在有1jiMPQQ和1mMCaCl2存在的條件下經(jīng)過(guò)1小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間轉(zhuǎn)化為全酶，并在有不同濃度的葡萄糖以及5jjM的pqq和10mM的CaCl2存在的條件下、采用如實(shí)施例5所述的基于DCIP在600nm處的吸光度變化的方法來(lái)測(cè)定酶活性。如表3所示，修飾的PQQGDHAsn452Thr能被用于測(cè)定0.1-20mM范圍內(nèi)的葡萄糖。利用修飾的PQQGDHGlu277Lys也獲得了相似的結(jié)果。實(shí)施例10酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浜驮u(píng)估五個(gè)單位的每一種修飾酶Glu277Lys和Asn452Thr與20mg的碳糊一起被凍干.充分混合后，將該混合物只涂在碳糊電極的表面上，所述碳糊電極預(yù)先填充了大約40mg的碳糊并經(jīng)濾紙拋光。該電極在含有1%戊二醛的10mMM0PS緩沖液(pH7.0)中于室溫下處理30分鐘，接下來(lái)在含有20mM賴氨酸的10mMMOPS緩沖液(pH7.0)中于室溫下處理20分鐘以便封閉戊二醛。該電極在10mMMOPS緩沖液(pH7.0)中于室溫下平衡l小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，然后貯存在4t!下。如此制備的酶?jìng)鞲衅鞅挥脕?lái)測(cè)量葡萄糖濃度。其上固定有本發(fā)明的修飾PQQGDH的酶?jìng)鞲衅髂鼙挥糜跍y(cè)定0.1mM-5mM范圍內(nèi)的葡萄糖。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的修飾PQQGDHs對(duì)葡萄糖具有高親合力，因此它們有望提供這樣一種優(yōu)勢(shì)，即利用這種酶制成的檢測(cè)試劑盒或酶?jìng)鞲衅髂軌蛞悦黠@高于傳統(tǒng)的天然PQQGDHs的靈敏度測(cè)量較低濃度的葡萄糖。序列表<110〉Sode,Ko"<120〉葡萄糖脫氳酶〈130〉YCT493〈150>JP11-124285051〉1999-4-30050〉JP2000-9137<151〉2000-1-18<160〉15<210〉<2U>454<212〉PRT。U〉乙酸鉤葡萄桿菌<400〉1AspValProLeuThrProSerGinPheAlaLysAlaI/ysSerGluAsn151015PheAspLysLysVallieLeuSerAsnLeuAsnLysProHisAlaLeu2025.30LeuTfpGlyProAspAsnGinlieTrpLeuThrGluArgAlaThrGly354045LyslieLeuArgValAsnProGluSerGlySerValLysThrValPhe505560GinValProGlulieValAsnAs[5AlaAspGlyGinAsnGlyLeuLeu65707580GlyPheAlaPheHisProAspPheLysAsnAsnProTyrUeTyrlie859095SerGlyThrPheLysAsnProLysSerThrAspLysGinLeuFroAsn100105110GinThrlieUeArgArgTyrThrTyrAsnLysSerThrAspThrLeu115120125GluLysProYalAspLeuLeuAlaGlyLeuProSerSerLysAspHis130135140GinSerGlyArgLeuVallieGlyProAspGinLyslieTyrTyrThr145l50155160lieGlyAspGinGlyArgAsnGinI'euAiaTyrLeuPheLeuProAsnGinHisProLeu225LeulieAspSerfro305LeuThrSerAsnLys385PheAsnAspPheAlaGinHis180MelThrLys210GlyLeuValAspTyr195AspHisGinLysSer275LysAsnArgSerGly260Gly165ThrGlyProAsnGlu245GlyTyrlie290ValThrLysGluLysCysAlaThr370LeuLysValGlyThrThrGlyTyr355LeuAspSerLeuSer435TyrGlu340ValLeuProAsnTyr420ValLysProLysSerPro230GinAsnAlaAspLeuAlaLysLeuTyr325MetTyrYalThrAsn405ValThrAlaSer310ThrLysProTyr390ArgLeuAsnLysThrYalPhe215GinGlyTyrT，rGin295GluValTyrGlySer375SerTyrThrThrGinLeu200AsnGlyProGlyAla280AsnTrpGinThrTyrlieGly360LeuThrArgAspLeu柳Gin185ArgGlyLeuAsnTrp265AsnGlyThrAspCys345LysLysThrAspThr425Glu70GluLeuValAlaSer250ProTyrValGlyLeuAsnValPhe235AspAsnSerLysLys315TyrAsnLeuGlyAsp205HisAspValAlaVal300AsnThr330TrpProThrValLysArgTyrYal410AlaAsnAlaGlyAsp395lieGlyProAsnThrlieVal380AspAlaAsnGluAlaAla285AlaPheTyrThr365lieAlaSerValLys190GlylieSer220ThrProAsnGly-Ser445lieGly270AlaAlaValAsnAla350GlyPheValProGin430Leu175AspTyrSerlieTyrThrGlyLys240AsnLeu255TyrLysAsnLysGlyValProPro320AspPro335ProSerTrpGluArglieProMet400AspGly415LysAsplieLys450<210〉2〈211〉1612<212〉DNA<213〉A(chǔ)cinetobactercalcoacelicus<400〉2agctaclttlatgcaacagagcctUcagaaat"agattUaatagattcgUattcat60cataatacaaatcatatagagaactcgtacmcccttUttagaggUtamattctc120柳aaattttgacaatttataaggtggacacatgaataaacatttattggctaaaattgc180ttUttaagcgctgttcagctagttacactctcagcat"gctgatgttcctctaactcc240atctcaatttgctaaagcgaaalcagagaactUgacaagaaagUattctatctaatct300aaataagccgcatgcUtgtUtggggaccagataatcaaat"ggltaactgagcgagc360aacaggtaagattctaagagttaatccagagtcgggtagtgUaaaacagtttttcaggt420accagagattgtcaatgatgctgatgggcagaatggttUtt鄉(xiāng)UUgccttccatcc480tgattttaaaaaUatccttatatcUtatttcaggtacattUaaaatccgaaatctac540agataaagaattaccgaaccaaacgattattcgtcgttatacctataaUaatcaacaga600tacgctcgagaagccagtcgatttattagcaggattaccttcatcaaaagaccatcagtc660aggtcgtcttgtcattgggccagatcaaaagatttattatacgattggtgaccaagggcg720taaccagc"g(ttatttgttcttg《caaatc逸agcacaa780actgaatggtaaagactatcacacctatatgggtaaagtactacgclUaatcttgatgg840aagtattccaaaggaUatccaagt，ttaacggggtggttagccatatttatacacttgg900acatcgtaatccgcagggcttagcattcactccaaatggtaaattattgcagtctgaaca960aggcccaaactctgacgatga^ttaacctcattgtcaaaggtggcaattatgg"ggcc1020gaatgtagcaggttataaagatgatagtggctatgctUtgcaaattattcagcagcagc1080caataagtcaa"aaggatttagctcaaaatggagtaaaagtagccgcaggggtccctgt1140gacgaaagaatctgaat卿ctggtaaaaactttgtcccaccattaaaaacttUUtac1200cgttcaagatacctacaactataacgatccaacltgtggagagatgacctacatttgctg1260gccaacagttgcaccgtcatctgcctatgtctataagggcggtaaaaaagcaattactgg1320ttgggaaaatacattattggUccatctttaaaacgtggtgtcatUtccgtatUagtt■agatccaacttatagcactactUtgatgacgctgtaccgatgt"aagagcaacaaccg1440UatcgtgatgtgattgcaagkcagatgggaatgtcttatatgtatUactgatactgc1500cggaaatgtccaaaaagatgatggctcagtaacaa^ceittagaaaacccaggatctct1560cattaagttcacctataaggctaagtaaUcagtcgcatt咖aaaccgatc]1612<210〉3<211>22<212>PRT<213>乙酸不動(dòng)桿菌〈220〉<222〉10<223〉Xaa是除Glu之外的任何氨基酸殘基<220〉<222〉11<223〉Xaa是除De之外的任何絲酸殘基<■〉3SerGluGinGlyProAsnSerAspAspXaaXaaAsnLeulieValLys151015GlyGlyAsnTyrGlyTrp20<210〉4<211〉22<212〉DNA<213〉合成序列<220〉〈223〉用于點(diǎn)突變的引物〈400〉4gaggttaattgcatcgtcagag22<210>5<211〉30〈212〉DM<213〉合成序列<220〉〈223〉用于點(diǎn)突變的引物<400〉5caatgaggttaatgttatcgtcagagtttg30<210〉6<211>22<212〉DNA〈213〉合成序列〈220〉〈223〉用于點(diǎn)突變的引物<400>6gaggttaatatcatcgtcagag22<210〉7〈211〉22〈212〉腿〈213>合成序列〈220〉<223>用于點(diǎn)突變的引物〈400〉7gaggtUattUatcgtcagag22—〈210〉8<211>30<212〉DM〈213>合成序列<220><223>用于點(diǎn)突變的引物〈400〉8caatgaggttaatgtgatcgtcagagtttg30〈210>9<211〉22<212>DNA<213>合餅列<220><223>用于點(diǎn)突變的引物〈400〉9gaggttaatttgatcgtcagag22<210>10<211>30<212>DNA<213〉合成序列<220〉<223>用于點(diǎn)突變的引物<400〉10caatgaggttaattacatcgtcagagttlg30<210〉11<211>22〈212〉DM<213〉合成序列<220>〈223〉用于點(diǎn)突變的引物<400>11gaggttaattccatcgtcagag22<210>12〈211〉26<2I2〉DNA<213>合成序列<220〉〈223〉用于點(diǎn)突變的引物<400〉12caatgaggttgaattcatcgtcagag26<210〉13<211>30<212〉■<213>合成序列<220〉<223>用于點(diǎn)突變的引物<400>13gacaatgaggtgaatttcatcgtcagag"30<210>14<211>21<212〉PRT<213〉乙酸鉤不動(dòng)桿菌<220><222>1<223>Xaa是任何絲絲基<222〉5<223>Xaa是任何g酸殘基<222〉8〈223〉Xaa是任何M絲基<222〉9<223〉Xaa是任何氨基酸殘基<222〉10〈223>Xaa是任何狄絲基<222〉15〈223〉Xaa是任何g絲基〈400〉14XaaThrAlaGlyXaaYalGinXaaXaaXaaGlySerYalThrXaaThr151015LeuGluAsnProGly20<210>15<211〉17〈212〉DM<213>人工序列<220><223>用于點(diǎn)突變的引物<400>15catctUUggacatgtccggcagtat1權(quán)利要求1.一種具有吡咯并-喹啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的谷氨酸277被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。2.—種具有吡咯并-喹啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的天冬酰胺462被極性氨基酸殘基所取代。3.—種具有吡咯并-會(huì)啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸鈞不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的異亮氨酸278被苯丙氨酸所取代。4.一種具有吡咯并-會(huì)啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的天冬酰胺279被組氨酸所取代。5.—種具有吡咯并-喹啉醌作為輔酶的經(jīng)^"飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的天冬氨酸448被天冬酰胺所取代。6.—種具有吡咯并-全啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的纈氨酸453被苯丙氨酸所取代。7.—種具有吡咯并-會(huì)啉醌作為輔酶的經(jīng)l務(wù)飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸釣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的賴氨酸455被異亮氨酸所取代。8.—種具有吡咯并-唾啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸鉀不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的天冬氨酸456被天冬酰胺所取代。9.一種具有吡咯并-喹啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶，其中源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的天冬氨酸457被天冬酰胺所取代。10.—種具有吡咯并-會(huì)啉醌作為輔酶的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氬酶，其中與源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌的水溶性PQQGDH中的谷氨酰胺454被脯氨酸或賴氨酸所取代。11.一種PQQ葡萄糖脫氫酶，其包含以下序列Xaa8ThrAlaGlyXaalValGinXaa2Xaa3Xaa4GlySerValThrXaa5ThrLeuGluAsnProGly其中Xaal代表任何天然氨基酸殘基，Xaa2代表Lys或lie,Xaa3代表Asp或Asn，Xaa4代表Asp或Asn，Xaa5代表極性氨基酸殘基，Xaa8代表Asp或Asn，條件是當(dāng)Xaal代表Asn，Xaa2代表Lys，Xaa3代表Asp，Xaa4代表Asp和Xaa5代表Asn時(shí)，Xaa8不代表Asp。12.—種PQQ葡萄糖脫氫酶，其包含以下序列SerGluGinGlyProAsnSerAspAspXaa6Xaa7AsnLeulieValLysGlyGlyAsnTyrGlyTrp其中Xaa6代表任何天然氨基酸殘基，Xaa7代表lie或Phe，條件是當(dāng)Xaa6代表Glu時(shí)，Xaa7不代表Lle。13.編碼如權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶的基因。14.含有如權(quán)利要求13所述基因的載體。15.含有如權(quán)利要求13所述基因的轉(zhuǎn)化體，其為細(xì)菌、酵母或培養(yǎng)的細(xì)胞。16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化體，其中權(quán)利要求13所述的基因被整合到主染色體中。17.—種葡萄糖檢測(cè)試劑盒，其含有如權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶。18.—種葡萄糖傳感器，其含有如權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的經(jīng)修飾的葡萄糖脫氫酶。全文摘要提供了以吡咯并-喹啉醌作為輔酶的修飾水溶性葡萄糖脫氫酶(PQQGDHs)，其中特異區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。本發(fā)明的修飾水溶性PQQGDHs對(duì)葡萄糖的親和力增大了。文檔編號(hào)C12N1/19GK101173255SQ20071014879公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2000年5月1日優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日發(fā)明者早出廣司申請(qǐng)人:究極酵素國(guó)際股份有限公司