專利名稱：：一種醇脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶及其編碼基因，特別涉及一種醇脫氫酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
：醇脫氫酶(AlcoholDehydrogenase,ADH,EC1.1.1.1)，是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一，很多醇類(lèi)代謝都是通過(guò)醇脫氫酶催化完成的。該酶在生物催化、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用。在生物體內(nèi)，很多醇類(lèi)代謝都是通過(guò)醇脫氫酶催化完成的。在動(dòng)物、植物、微生物、真核生物以及原核細(xì)菌中都已發(fā)現(xiàn)醇脫氫酶，至少有25個(gè)EC編號(hào)的酶被稱為醇脫氫酶。醇脫氫酶來(lái)源廣泛，種類(lèi)繁多。目前已報(bào)道的可降解烷烴菌中的醇脫氫酶主要有以下三大類(lèi)I型，Zl^+依賴的長(zhǎng)鏈醇脫氫酶，每個(gè)亞基大約350個(gè)氨基酸殘基；II型，短鏈醇脫氫酶，每個(gè)亞基含有250個(gè)氨基酸殘基，如Bt-ADH;III型，F(xiàn)e2+依賴的醇脫氫酶，約38kDa大小(TomohisaKato等，JournalofBioscienceandBioengineering，2001.vol.91，No.l,100-102)。醇脫氫酶能夠作用的底物種類(lèi)繁多，包括乙醇在內(nèi)的脂肪醇、芳香醇以及肉桂醇等。在醇脫氫酶研究方面，涉及的菌種有嗜熱厭氧乙醇菌(77ze/-moawaera6ac^e血"o/z'ci^JW200)、嗜熱厭氧乙醇菌(77ze7.'moa"aeroZ)ac/eref/zawo/ZcwsATCC31550)、極端嗜熱菌(77mwotog"/2jp9ge"sp.Nov)、牛分支桿菌(雄co^"m'柳6ov/sBCG)、酪酸梭狀芽孢桿菌(C7o坩Wwm6w，/cwmVPI1718);但研究最為清楚是酵母菌。酵母醇脫氫酶為四聚體，單個(gè)亞基肽鏈含347個(gè)氨基酸殘基，亞基分子量35000。酵母醇脫氫酶對(duì)底物專一性強(qiáng)，對(duì)乙醇及其他直鏈伯醇活性較高，只對(duì)少數(shù)仲醇和側(cè)鏈烷醇具有活性氨基酸殘基序列的143283為輔酶結(jié)合區(qū)域，氨基酸殘基序列的1142和284336為催化活性區(qū)域。輔酶和酶結(jié)合時(shí)酶構(gòu)象發(fā)生變化，催化結(jié)構(gòu)域旋轉(zhuǎn)大約10。后轉(zhuǎn)向輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，后者旋轉(zhuǎn)大約1.5。。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成裂縫，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和裂縫組成一個(gè)腔袋，底物和輔酶就結(jié)合在中間形成的一個(gè)深腔袋中，腔袋一側(cè)的側(cè)鏈?zhǔn)鞘杷模硪粋?cè)側(cè)鏈?zhǔn)怯H水的，包含催化活性的Zn^及其配位體(F.MarkDickinson等，Chemico國(guó)BiologicalInteractions130-132(2001)417-423;UedaM等，MethodsEnzymol.1990;188:171-5)。關(guān)于醇脫氫酶基因最新的專利和文獻(xiàn)報(bào)道。如毛裕民等人報(bào)道了一種乙醇脫氫酶及其基因(第01126435.7號(hào)專利，申請(qǐng)日期2001年8月9日)；RHildebrandt等人矛艮道了熒光假單胞菌(i^ewofomowos/7womsceraDSM50106)的醇脫氫酶(ApplMicrobiolBiotechnol，59:483-487，2002);PeterJ.Holt等報(bào)道了嗜熱厭氧乙醇菌(7T2^moawaeraZjacferd/^wo//ciJW200)的醇脫氫酶(FEMSMicrobiologyLetters,190:57-62，2000);Jean-MarcWilkin等人報(bào)道了牛分支桿菌(嶺coZacfeWwm6oWsBCG)中的醇脫氫酶(Eur.J.Biochem，262:299-307，1999)。目前對(duì)微生物進(jìn)行烷烴降解的功能和機(jī)制研究主要集中于假單胞菌屬(尸化M(io膨"as)、不動(dòng)桿菌屬、布勞氏菌屬(尸raiwere〃a)、紅球菌屬(i/wtfococcm)等七個(gè)種屬的十幾種菌株(P.Hildebrandt等，ApplMicrobiolBiotechnol,2002,59:483-487;PeterJ.Holt等，MicrobiologyLetters,2000,190:57-62;CelineRaynaud等，PNAS2003，April29:5010-5015;Jean-MarcWilkinl等，Eur.J.Biochem,1999，262:299-307;RyokoIwamoto等，ArchivesofBiochemistryandBiophysics,2002，398:203-212)，其垸烴降解途徑中的各步反應(yīng)的基因大多分散在基因組的不同位置，或在質(zhì)粒中成簇排列(如/^i^omo"as戸"&OCT質(zhì)粒)。雖然對(duì)烷醇脫氫酶的研究報(bào)道較多，其作用的底物仍局限于中短鏈垸醇，尤其是乙醇和丁醇，以16C以上的垸醇為底物的醇脫氫酶還未見(jiàn)報(bào)道(AkioTani等，Appl.Environ.Microbiol,Dec.2000，p,5231-5235;Ishige,T.等，Appl.Environ.Microbiol.2000,66:3481-348;MESinger,JBacteriol.1985December;164(3):1017-1024;TKotani等，JBacteriol,Dec.2003，p:7120-7128;ChingT.Hou等，AppliedAndEnvironmentalMicrobiology,My1983，p.98-105;KesenMa等，JournalOfBacteriology,Feb.1999，p.1163-1170)。在石油烴降解途徑中，長(zhǎng)鏈垸醇脫氫酶是十分重要的關(guān)鍵酶，對(duì)該酶的研究為深入研究嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2降解長(zhǎng)鏈烷烴代謝途徑的機(jī)制提供了更有力的證據(jù)，也為探索其它烷烴降解菌的代謝途徑提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，該酶的嗜熱性及降解長(zhǎng)鏈垸醇的能力具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，可以應(yīng)用于石油污染物和石油廢水的處理過(guò)程和提高微生物石油采收率。因此有待于對(duì)長(zhǎng)鏈醇脫氫酶進(jìn)一步研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基因，其能編碼一種可以降解長(zhǎng)鏈烷醇的醇脫氫酶。本發(fā)明的另一目的是提供一種醇脫氫酶，其可以降解長(zhǎng)鏈烷醇(16C以上)。本發(fā)明的另一目的是提供一種能表達(dá)醇脫氫酶的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的再一目的是提供一種能產(chǎn)生醇脫氫酶的重組菌。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明提出一種編碼醇脫氫酶的基因，其具有選自于a)、b)或c)的核苷酸序列a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；b)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDNO:l但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在嚴(yán)格雜交條件下與上述a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的醇脫氫酶的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述編碼醇脫氫酶的基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。本發(fā)明提出一種醇脫氫酶，其具有選自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；e)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；f)上述e)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有醇脫氫酶的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述醇脫氫酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明提出一種表達(dá)醇脫氫酶的重組質(zhì)粒，其至少包括上述編碼醇脫氫酶的基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明提出一種產(chǎn)生醇脫氫酶的重組菌，該菌內(nèi)導(dǎo)入了上述編碼醇脫氫酶的基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述重組菌為大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌BL21菌株。本發(fā)明還提供了一種醇脫氫酶的應(yīng)用，其特征在于該酶用于石油污染物和石油廢水的處理過(guò)程中。本發(fā)明還提供了一種醇脫氫酶的應(yīng)用，其特征在于該酶用于在石油開(kāi)采的過(guò)程中，以提高微生物石油采收率。應(yīng)當(dāng)指出的是，上述提到的術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"在本說(shuō)明書(shū)中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒(méi)有形成非特異的雜交。例如，該嚴(yán)格條件可以是，相互之間的同源性不小于70%的DNA之間可以雜交而低于上述數(shù)值的DNA之間不能雜交，優(yōu)選的是同源性不少于90%的DNA之間可以雜交。相對(duì)于Southern雜交中普通洗滌條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0，7%SDS)中，5(TC預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0,7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，50'C雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(2xSSC和0.in/。SDS)，5(TC洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5xSSC和0.1%SDS)，5(TC洗膜30min。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該知道，本發(fā)明的編碼醇脫氫酶的DNA序列，還包括編碼對(duì)SEQIDNO:1所示核苷酸序列所表達(dá)的酶分子的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失并仍具有該酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，對(duì)本發(fā)明的醇脫氫酶基因所表達(dá)的酶分子的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質(zhì)，也能達(dá)到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明還包括與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選具有至少90%的同源性，但同時(shí)具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。上面使用的術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"可以是小于100的數(shù)目，優(yōu)選為小于10的數(shù)目。和己知的醇脫氫酶相比，本發(fā)明提出的醇脫氫酶是一種新型的醇脫氫E每，通過(guò)對(duì)本發(fā)明提出的醇脫氫酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列比較分析，本發(fā)明的醇脫氫酶與其它已報(bào)道的酶的氨基酸序列相比，絕大多數(shù)相似性小于46%。相似性高于46%的醇脫氫酶均未做功能鑒定，主要來(lái)源于嗜熱芽孢桿菌(Sac/〃w^3usto//2z7us)HTA426(YP—147724.1);5ac〃/wsp.B1490(ZP一01725521.1);i^ewdomoway7womsceraPfO誦l(YP—350849.1)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的醇脫氫酶與其它己報(bào)道的醇脫氫酶的氨基酸序列相比后，相似性大于46%的已發(fā)現(xiàn)菌株中，基本上都是進(jìn)行序列比對(duì)的研究，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)菌株的醇脫氫酶基因的功能進(jìn)行鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)。通過(guò)酶的氨基酸序列相似性，該發(fā)明的醇脫氫酶屬于III型，F(xiàn)^+依賴的醇脫氫酶。此外，本發(fā)明的醇脫氫酶不同于已報(bào)道的醇脫氫酶，經(jīng)不同底物時(shí)酶活力檢測(cè)，證明該酶具有降解長(zhǎng)鏈烷醇的能力(大于16C)。雖然該酶的最適底物是乙醇，但是對(duì)于十二醇至三十醇之間的長(zhǎng)鏈醇具有一定的降解能力，最適反應(yīng)溫度為6(TC，具有很高的熱穩(wěn)定性。長(zhǎng)鏈垸烴的降解是由垸烴單加氧酶將烷烴羥化為長(zhǎng)鏈垸醇，再由垸醇脫氫酶進(jìn)一步脫氫為長(zhǎng)鏈烷醛，再由全脫氫酶繼續(xù)脫氫生成長(zhǎng)鏈烷酸，在長(zhǎng)鏈垸酸輔酶A連接酶作用下生成長(zhǎng)鏈烷酸輔酶A后進(jìn)入三羧酸循環(huán)最終完全氧化為二氧化碳和水。在石油烴降解途徑中，嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中的長(zhǎng)鏈烷醇脫氫酶是十分重要的關(guān)鍵酶，它能夠耐高溫并高效利用烷烴單加氧酶的催化產(chǎn)物長(zhǎng)鏈垸醇，使其進(jìn)一步脫氫，提高烷烴降解途徑中的催化效率；另一方面，它有著比長(zhǎng)鏈烷烴單加氧酶更廣泛的底物范圍，不僅能夠催化長(zhǎng)鏈烷醇，還對(duì)短鏈醇有很高的催化能力。因此，對(duì)長(zhǎng)鏈烷醇脫氫酶的研究不僅有利于深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2降解長(zhǎng)鏈烷烴途徑的機(jī)制，為探索其它烷烴降解菌的代謝途徑提供理論基礎(chǔ)，對(duì)該酶構(gòu)建高效表達(dá)工程菌株及大量純化更具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。基于本發(fā)明的長(zhǎng)鏈垸醇醇脫氫酶的上述特性和功能，該酶可以在石油污染物和石油廢水的處理中以及在提高微生物石油采收率中廣泛應(yīng)用。一方面，該酶在高溫下能降解長(zhǎng)鏈烷醇，從而強(qiáng)化長(zhǎng)鏈烷烴經(jīng)過(guò)前述降解途徑的反應(yīng)，提高輕質(zhì)烷烴與重質(zhì)垸烴的比例、改善原油流動(dòng)性等特性，有利于原油的開(kāi)采，提高石油采收率；另一方面，該酶在高溫下對(duì)長(zhǎng)鏈烷醇的降解特性，可以強(qiáng)化長(zhǎng)鏈烷烴的降解，對(duì)由油田開(kāi)采、輸油作業(yè)的跑漏、溢流所引起的環(huán)境石油污染物以及石油化工帶來(lái)的高溫石油廢水的處理也具有良好的應(yīng)用前景。圖l是本發(fā)明實(shí)施例中的醇脫氫酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建模式圖。圖2表示本發(fā)明醇脫氫酶SDS-PAGE電泳圖。圖3表示本發(fā)明醇脫氫酶對(duì)不同底物的比活力。圖4表示本發(fā)明醇脫氫酶在不同溫度下的比活力。圖5表示本發(fā)明醇脫氫酶在不同pH值下的比活力。圖6A和圖6B表示本發(fā)明醇脫氫酶活力氣相檢測(cè)圖。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。以下各實(shí)施例僅僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例一1.嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取研究證明，由嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geo6ac///^A^7wWemYr訴cflra)NG80-2基因組能夠分離出編碼醇脫氫酶的基因。因此，在本實(shí)施例中，采用從中國(guó)天津大港油田官69-8區(qū)塊油井地層水分離獲得的嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo.1228，保藏日期為2004年10月09日，已申請(qǐng)國(guó)內(nèi)發(fā)明專利并獲得授權(quán)，發(fā)明名稱嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應(yīng)用，專利號(hào)ZL200410072759.7)，取其過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml，離心收集菌體，菌體懸于250微升50mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入10微升0.4MEDTA(pH8.0)，混勻后37。C保溫20min，之后加入30微升20mg/ml溶菌酶，混勻后37"再保溫20min，再加入5微升20mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20微升10%SDS，5(TC保溫至溶液澄清，分別用等體積酚:氯仿:異戊醇抽提兩次，氯仿:異戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于IOO微升TE緩沖液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)，加入10mg/mlRNase2微升，65'C保溫30min，分別用酚:氯仿:異戊醇、氯仿:異戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50微升TE緩沖液。DNA溶液的紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果為A260/A280=1.95，A260=0.73。2.本發(fā)明醇脫氫酶基因的克隆和篩選取前面所述的總DNA溶液0.5微升(約10ng)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)PCR。設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下95°C,5min;95°C，30s;50°C，45s;72°C,2min;72°C,5min;4°C，2hr。引物序列如下上游引物為SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，下游引物為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。上述PCR產(chǎn)物用lol和Wol雙酶切，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收1.2kb酶切產(chǎn)物片斷。與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，涂于含50pg/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37。C培養(yǎng)12小時(shí)，挑取單克隆轉(zhuǎn)接到20mlLB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(50嗎/mlKan)，37。C培養(yǎng)12小時(shí)后，提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNO:1的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pLW1246(見(jiàn)圖1)，將重組質(zhì)粒pLW1246轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(該菌株可向天津開(kāi)發(fā)區(qū)厚普生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司訂購(gòu)，貨號(hào)為69387-3)中，得到含有該重組質(zhì)粒的重組菌株為H1485,此重組質(zhì)粒pLWi246可高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)醇脫氫酶活性和抗卡那霉素性能。采用Sanger法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示插入片段含有一個(gè)長(zhǎng)U85bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼一個(gè)由395個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。實(shí)施例二醇脫氫酶的純化和特性將上述重組菌H1485單克隆接入20ml含50pg/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm/min培養(yǎng)12小時(shí)，然后將培養(yǎng)物按1%(V/V)接種量接入200ml含50嗎/mlKan的LB培養(yǎng)基(共10個(gè)搖瓶)，37°C，220rpm/min培養(yǎng)OD600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.05mM,37°C，180rpm/min誘導(dǎo)3小時(shí)。離心收集菌體，懸于含50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingSepharose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶(見(jiàn)圖2)。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此醇脫氫酶的基本特性。用SDS-PAGE測(cè)得的重組酶的分子量為45000道爾頓，與理論上推算的分子量(41600道爾頓)相似；等電點(diǎn)沉淀法測(cè)得的重組酶的等電點(diǎn)pi為5.82。該醇脫氫酶對(duì)C12C30的長(zhǎng)鏈醇均有作用。(最好可以補(bǔ)充蛋白電泳圖)實(shí)施例三1.測(cè)定本發(fā)明醇脫氫酶不同底物時(shí)的比活力對(duì)上述實(shí)施例二中制得的醇脫氫酶進(jìn)行不同底物的測(cè)定，具體方法為配制200)iil反應(yīng)體系，輔酶NAD+的終濃度為lmM，分別加入lmM甲醇、乙醇、丁醇、己醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇、十六醇、十八醇、二十醇、二十四醇、二十八醇、三十醇中的底物，一定濃度的醇脫氫酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl補(bǔ)至20(Hd?；靹?，在6(TC水浴中反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應(yīng)。用l:l的三氯甲烷萃取，然后在340nm處測(cè)定光吸收。以每分鐘生成lpmolNADH所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位，測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖3，從該圖中可以看出，該醇脫氫酶的最適底物是乙醇。2.測(cè)定本發(fā)明醇脫氫酶在不同溫度下的比活力對(duì)上述實(shí)施例二中制得的醇脫氫酶進(jìn)行最適反應(yīng)溫度的測(cè)定，具體方法為配制200pl反應(yīng)體系，底物乙醇的終濃度為100mM，輔酶NAD+的終濃度為lmM，一定濃度的醇脫氫酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl補(bǔ)至200^d?；靹?，分別于45。C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75。C水浴中反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應(yīng)。用l:l的三氯甲烷萃取，然后在340nm處測(cè)定光吸收。測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖4。從該圖中可以看出，該醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度約為6(TC。3.測(cè)定本發(fā)明醇脫氫酶在不同pH下的比活力對(duì)上述實(shí)施例二中制得的醇脫氫酶進(jìn)行最適pH值的測(cè)定，具體方法為配制200W反應(yīng)體系，底物乙醇的終濃度為100mM，輔酶NAD+的終濃度為lmM，一定濃度的醇脫氫酶，分別用pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0的緩沖液(配方見(jiàn)表1)補(bǔ)至200pl。在6(TC水浴中反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應(yīng)。用1:1的三氯甲垸萃取，然后在340nm處測(cè)定光吸收。以每分鐘生成lpmolNADH所需酶量定義為l個(gè)酶活力單位，測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖5，從該圖中可以看出，該醇脫氫酶的最適pH值約為7.8。表l醇脫氫酶酶活測(cè)定中所用的緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.測(cè)定本發(fā)明醇脫氫酶受不同離子的影響對(duì)上述實(shí)施例二中制得的醇脫氫酶進(jìn)行不同離子影響的測(cè)定，具體方法為酉己制200^1反應(yīng)體系，底物乙醇的終濃度為100mM，輔酶NAD+的終濃度為lmM，分別加入FeCl2、FeS04、CuS04、MgCl2、CoCl2、ZnS04、MnCl2、A1CL3、CaCl2、NiCl2、NaCl、KC1、EDTA至ImM或SDS至0.05%，醇脫氫酶的終濃度為0.1mg/ml，用50mMpH8.0的Tris-HCl補(bǔ)至200|xl?；靹?，在6(TC水浴中反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應(yīng)。用1:1的三氯甲烷萃取，然后在340nm處測(cè)定光吸收。以每分鐘生成llimolNADH所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位，測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)表2。表2不同離子對(duì)該醇脫氫酶活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5.本發(fā)明醇脫氫酶活力的氣相檢測(cè)對(duì)上述實(shí)施例二中制得的醇脫氫酶進(jìn)行氣相測(cè)定，具體方法為配制lml反應(yīng)體系，底物十六醇的終濃度為0.5mM，表面活性劑與底物的w/w比為6%。輔酶NAD+的終濃度為lmM,—定濃度的醇脫氫酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl補(bǔ)至lml?；靹?，6(TC下反應(yīng)一定的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，冰浴5分鐘，終止反應(yīng)。加入含有十五烷作為內(nèi)標(biāo)的正己垸萃取，用agilent6820氣相色譜儀系統(tǒng)測(cè)定反應(yīng)底物的減少。反應(yīng)前后的氣相色譜圖測(cè)定結(jié)果分別參見(jiàn)圖6A和圖6B，從該圖中可以看出，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，底物不斷減少。雖然本發(fā)明己以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可做些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。序列表〈110〉南開(kāi)大學(xué)<120〉一種醇脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用〈130〉7P13006-CN〈160〉4<170〉Pateivtlnversion3.3〈210〉1〈211〉<212〉DNA〈213〉編碼醇脫氫酶的核苷酸序列〈400〉1atgagtgtagcccgcattgtctttccgccgctcagccatgtcggctggggagcgcttgac60c恥ttagttcctgaagtg肌gcggttgggagca犯acatattttggtgattaccgacccg120atgcttgtgaagatcggcctagtcgatcaagtgacgtccccgctccgtcaagaagggtat1803gcg'tgcatgtgtatacggatgttgtgccagagccgccgcttgagacagggg肌犯ggca240gtggcgtttgcccgcgacggaaagtttgaccttgtcatcggtgttggtggtggcagcgcg300ctggatttggc卿actggcggctgttttggcggtgcatgatggctcggtcgctgactat360ttaaatttgacaggaacgcgaacacttgagaaaaaagggttgccgaaaattttgattccc420acgacatcgggcaccgggtcggaagtgaca肌catctctgtcttgtctttggaaacgacg480aa卿tgtcg化acgcacgattacttattggccgacgtcgcgatcgttgatccgcagctg540acxgtttccgUccaccgcgggtaacggccgcaacgggaattgatgcactcacccatgca600gUg鄉(xiāng)cgtatgtgtcggtcaatgcgagcccaacatcggatggattggccgttgccgct660attcggctgaUtcacgctcactgcgc犯agcggtggccaacggttcggacaaacaggcg720cgcattgatatggcgaacggcagttatttggccggcttggcatttttcaacgccggggta780gcc:ggtgtgcatgcgcixgcttatccgctcggtggtxagtttcatatcgctcatggtgaa840tcgaatgctgLgctgttgccgtatgtgatgggctacatccgtcaaagctgtacgaagaga900atggccgatatutcaacgcgcttggcggc犯ctc冊(cè)gttttttgtccgaagtgg犯gcg960tcttatcggtgcgtcgaggaactagaacggttcgtcgccgatgtcggcattccgaaaaca1020ttggggggatttggcatccccgaaagcgcgctagaaagcttgacgaaagatgctgtccaa1080cagaaacgtttgcttgcccgcagtccgttgccgctgttggaagccgacatccgtgcgatt1140tacgaagccgcgtttgccgggacgatcgtagagccgcacaaggcgtaa1188〈210〉2〈211〉395<212>PRT<213>醇脫氫S,的氨基酸序列〈400〉2ValLeuHislieMetSer1GlyAlaAspGin50Ty丄'Thr65ValAlaGlyGlyHisAspLeuGlu130ThrGly145LysAspAspProGlylieAlaSer210SerArgLeu35ValAspPheSerGly115LysSerValGinAsp195ProSerAlaAsp20ValThrValAlaAla100SerLysGluValLeu180AlaThrLeuArg5GinlieSerValArg85LeuValGlyValThr165ThrLeuSerArglieLeuThrProPro70AspAspAlaLeuThr150HisValThrAspLysValValAspLeu55GluGlyLeuAspPro135AsnAspSerHisGly215AlaPheProPro40ArgProLysAlaTyr120LyslieTyrValAla200LeuValProGlu25MetGinProPheLys105LeulieSerLeuPro185ValAlaAlaPro10ValLeuGluLeuAsp90LeuAsnLeuValLeu170ProGluValAsnLeuLysValGlyGlu75LeuAlaLeulieLeu155AlaArgAlaAlaGly16SerArgLysTyr60ThrValAlaThrPro140SerAspValTyrAla220SerHisLeulie45SerGlylieValGly125ThrLeuValThrVal205lieAspValGlyTrp15GlyAlaLys30GlyLeuValValHisValGluLysAla80GlyValGly95LeuAlaVal110ThrArgThrThrSerGlyGluThrThr160AlalieVal175AlaAlaThr190SerValAsnArgLeulieLysGinAla225230235240ArglieAspMetAlaAsnGlySerTyrLeuAlaGlyLeuAlaPhePhe245250255AsnAlaGlyValAlaGlyValHisAlaLeuAlaTyrProLeuGlyGly260265270GinPheHislieAlaHisGlyGluSerAsnAlaValLeuLeuProTyr275280285ValMetGlyTyrlieArgGinSerCysThrLysArgMetAlaAsplie290295300PheAsnAlaLeuGlyGlyAsnSerSerPheLeuSerGluValGluAla305310315320SerTyrArgCysValGluGluLeuGluArgPheValAlaAspValGly325330335lieProLysThrLeuGlyGlyPheGlylieProGluSerAlaLeuGlu340345350Sei"LeuThrLysAspAlaValGinGinLysArgLeuLeuAlaArgSer355360365ProLeuProLeuLeuGluAlaAsplieArgAlalieTyrGluAlaAla370375380PheAlaGlyThrlieValGluProHisLysAla385390395〈210〉3<211>28〈212〉DMA<213>基于醇脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)并人工合成的上游引物<400>3cacatccatgggtgtagcccgcattgtc28〈210〉4〈211〉31〈212〉DNA<2丄3>基于醇脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)并人工合成的下游引物<400〉4agctctcgagcg'ccttgtgcggctctacgat3權(quán)利要求1.一種編碼醇脫氫酶的基因，該基因具有選自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；b)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDNO:1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在嚴(yán)格雜交條件下與上述a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的醇脫氫酶的核苷酸序列。2.—種醇脫氫酶，該酶具有選自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；e)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；f)上述e)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有醇脫氫酶的活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的醇脫氫酶，其特征在于，所述醇脫氫酶具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少70%的同源性，同時(shí)具有該序列的蛋白質(zhì)有醇脫氫酶的活性。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的醇脫氫酶，其特征在于，所述醇脫氫酶具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少90%的同源性，同時(shí)具有該序列的蛋白質(zhì)有醇脫氫酶的活性。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的醇脫氫酶，其特征在于，該酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、替換或插入1至100個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有醇脫氫酶的活性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的醇脫氫酶，其特征在于，該酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、替換或插入1至10個(gè)氨基酸后所得的氯基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有醇脫氫酶的活性。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的醇脫氫酶，其特征在于，所述醇脫氫酶屬于III型，F(xiàn)^+依賴的醇脫氫酶。8.—種表達(dá)醇脫氫酶的重組質(zhì)粒，其特征在于該重組質(zhì)粒至少包括權(quán)利要求1所述的編碼醇脫氫酶的基因。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)醇脫氫酶的重組質(zhì)粒，其特征在于該重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。10.—種產(chǎn)生醇脫氫酶的重組菌，其特征在于，該重組菌內(nèi)導(dǎo)入了權(quán)利要求1所述的編碼醇脫氫酶的基因。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的產(chǎn)生醇脫氫酶的重組菌，其特征在于該重組菌為大腸桿菌。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生醇脫氫酶的重組菌，其特征在于上述大腸桿菌為大腸桿菌BL21菌株。13.權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的醇脫氫酶的應(yīng)用，其特征在于該酶用于處理石油污染物和石油廢水。14.權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的醇脫氫酶的應(yīng)用，其特征在于該酶用于在石油開(kāi)采過(guò)程中提高微生物石油采收率。全文摘要本發(fā)明涉及一種醇脫氫酶及其編碼基因。本發(fā)明的醇脫氫酶與其它已報(bào)道的酶的氨基酸序列相比，絕大多數(shù)相似性小于46％。經(jīng)不同底物的酶活力檢測(cè)，證明本發(fā)明的醇脫氫酶具有降解長(zhǎng)鏈烷醇的能力。該酶具有降解大于16碳的長(zhǎng)鏈烷醇的能力，可廣泛作用于C12～C30之間的長(zhǎng)鏈醇，最適底物是乙醇。文檔編號(hào)C12N9/04GK101381734SQ20071014807公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2007年9月5日優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日發(fā)明者露馮,劉雪倩,磊王申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)