專利名稱：一種表達(dá)角蛋白酶的重組菌及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶領(lǐng)域，具體涉及ー種表達(dá)角蛋白酶的重組菌及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
角蛋白是ー種堅(jiān)硬的不溶性蛋白，分為α-角蛋白和β-角蛋白，α-角蛋白是毛發(fā)中主要蛋白質(zhì)，β_角蛋白主要存在于動物的羽毛、皮膚、爪和鱗片中。由于高度交聯(lián)的胱氨酸殘基形成的ニ硫鍵、分子間的疏水作用以及氫鍵作用，角蛋白難以被膜蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等降解，傳統(tǒng)高壓水解、酸堿蒸煮降解羽毛的方法耗能高，破壞熱敏性氨基酸并污染環(huán)境。角蛋白酶是降解角蛋白的ー類酶，由真菌、放線菌和細(xì)菌等多種微生物產(chǎn)生，主要 是金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，其用于酶降解角蛋白，不存能耗高、污染強(qiáng)的問題，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和研究前景。角蛋白酶不僅可以用于對角蛋白廢棄物如羽毛、豬毛、羊毛等的降解，而且在肥料、醫(yī)藥、食品、洗滌劑和制革等エ業(yè)中廣泛應(yīng)用，具有生產(chǎn)高級營養(yǎng)品、飼料添加剤、美容、軟化皮革、嫩化肉類等作用，并可降解引起人類新克雅氏癥和瘋牛病的Prion蛋白(PrPSc構(gòu)象)，從而消滅朊病毒，更使其成為世界性的研究熱點(diǎn)。角蛋白酶的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，但由于天然菌株中角蛋白酶產(chǎn)量較低、生產(chǎn)成本昂貴、難以エ業(yè)化生產(chǎn)，分離的角蛋白酶作用緩慢、有效性不夠好，因此角蛋白酶還沒有得到廣泛的實(shí)際應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建具有潛在應(yīng)用價(jià)值的高效角蛋白酶基因工程菌株，并改造現(xiàn)有角蛋白酶基因，提高重組酶表達(dá)量及其穩(wěn)定性，為角蛋白酶的エ業(yè)化生產(chǎn)、廢棄角蛋白的循環(huán)利用和飼料蛋白資源開發(fā)提供新的有效途徑。王麗華等，“枯草芽孢桿菌角蛋白酶基因kerC在畢赤酵母中的表達(dá)研究”，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011-06-01公開了ー種利用DNA重組技術(shù)將枯草芽孢桿菌B-3的角蛋白酶基因與pPICZ a A質(zhì)粒重組，并成功地在在巴斯德畢赤酵母X-33中表達(dá)，但是其產(chǎn)酶能力低，僅為32. 31U/ml，不能滿足エ業(yè)應(yīng)用的需求。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的角蛋白酶及其制備方法。角蛋白酶，keratinase,是ー類可專一地降解角蛋白的蛋白酶。本發(fā)明提供了ー種如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。還提供了ー種重組載體，它包含SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。其中，所述的重組載體是重組pPICZ a A質(zhì)粒。還提供了ー種重組菌，它包含前述的重組載體。其中，所述的重組菌為重組畢赤酵母。還提供了ー種角蛋白酶，它由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列編碼。優(yōu)選地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
其中，它的最適溫度范圍是50_60°C。其中，它的最適pH范圍為7-10。還提供了前述角蛋白酶的制備方法，包含如下步驟i、取前述重組菌，接種到BMGY培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，pH為6，至0D_=2 6 ；ii、收集菌體，將其培養(yǎng)在BMMY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30°C，pH為6，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑為甲醇，每24小時(shí)，加甲醇至I %濃度，誘導(dǎo)時(shí)間為96 144h ；iii、收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。還提供了前述角蛋白酶的另一種制備方法，包含如下步驟(I)取上述重組菌接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基上，pH為5. 5，溫度為30°C下培養(yǎng)，制備得到種子液；(2)取步驟(I)制備的種子液，以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵pH為4. 9，發(fā)酵溫度為30°C ；每IL發(fā)酵培養(yǎng)基含有如下成分50g葡萄糖、15g磷酸ニ氫鉀、16g硫酸鎂、IOg硫酸鉀、O. 8g氫氧化鉀、O. 8g硫酸鈣、O. 5g消泡劑、4g硫酸銨、Ig增效劑、生物素O. 473mL、微量元素溶液(PTMl) 2. 2mL ；(3)待碳源耗盡后，補(bǔ)加濃度為25%葡萄糖，流加濃度為25%甘油與甲醇的混合物，誘導(dǎo)表達(dá)，25%甘油與甲醇的體積比為8:1，甲醇的濃度維持為1%，直至酶活出現(xiàn)指數(shù)增長時(shí)終止發(fā)酵；(4)收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。本發(fā)明提供了一種新的表達(dá)角蛋白酶的畢赤酵母工程菌，該工程菌生產(chǎn)角蛋白酶的表達(dá)量高，且制備的角蛋白酶與天然角蛋白酶性質(zhì)相似，適合大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的市場應(yīng)用前景。


圖I地衣芽孢桿菌S90kerA基因擴(kuò)增結(jié)果，其中，MiDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000) ；1為kerA基因圖2地衣芽胞桿菌角蛋白酶基因T克隆測序結(jié)果及其氨基酸序列圖3地衣芽胞桿菌角蛋白酶基因與pPICZ a A連接克隆測序結(jié)果圖4畢赤酵母菌落PCR鑒定結(jié)果，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，1-4 :含pPICZ a A-kerA的菌落圖5重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物電泳分析結(jié)果圖6重組角蛋白酶基因菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶曲線圖7重組畢赤酵母角蛋白酶分泌量及菌體密度變化曲線圖8重組角蛋白酶最適反應(yīng)pH圖9重組角蛋白酶最適反應(yīng)溫度圖10重組角蛋白酶溫度穩(wěn)定性圖11重組角蛋白酶熱穩(wěn)定性
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I本發(fā)明角蛋白酶的制備一、角蛋白酶重組菌的構(gòu)建(一)角蛋白酶基因片段的制備I、地衣芽胞桿菌基因組DNA提??；2、利用RT-PCR及定點(diǎn)突變技術(shù)擴(kuò)增出角蛋白酶除去信號肽的CDS序列，引物(下劃線為酶切位點(diǎn)，斜體部分為突變堿基)和反應(yīng)條件如下 引物I (F) :5’ GCTGGTACCGCTCAACCAGCTAAAAATGT-3’ (Kpn I)引物2 (R) :5’ -CGAGCGGCCGCTTGAGCAGCAGCTTCGACATTGAT-3’ (Not I)反應(yīng)條件為
9.1 °C4 min
94 0C40 s
59°C50 SI 35 cycles
72 UImin」
72 "C10 min3、DNA片段回收割取含目的基因的膠條，用小量柱式凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；4、在T4DNA連接酶作用下將回收的目的基因片段與T載體連接，得含目的基因(B. Iicheniformis角蛋白酶基因)的T克隆載體；5、瓊脂糖凝膠電泳并測序檢驗(yàn)擴(kuò)增得到的目的基因片段。由圖I可知，擴(kuò)展得到的目的基因片段跟天然角蛋白酶基因片段的大小無差別，由圖2可知，測序證明本發(fā)明擴(kuò)增的到的目的基因片段跟地衣芽孢角蛋白酶基因片段核苷酸序列的數(shù)量一祥，有3個(gè)堿基的類型有差異(下劃線標(biāo)記的三個(gè)堿基的類型有區(qū)別)，且這幾個(gè)堿基差異使該基因片段恰好含有與畢赤酵母偏愛的密碼子，有利于角蛋白酶的表達(dá)。結(jié)果證明，本發(fā)明準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增得到了含有畢赤酵母偏愛密碼子的編碼角蛋白酶的目的基因片段(KerA基因片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。(ニ)重組表達(dá)載體構(gòu)建I、質(zhì)粒雙酶切及片斷回收含目的基因KerA基因片段(B. Iicheniformis角蛋白酶基因)的T克隆載體與表達(dá)載體pPICZ a A均用限制性內(nèi)切酶KpnI和Not I雙酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收備用(膠回收純化試劑盒，購自天根生物公司)。雙酶切體系如下
權(quán)利要求
1.一種如SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列。
2.ー種重組載體，其特征在干包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述的重組載體是重組PPICZaA質(zhì)粒。
4.ー種重組菌，其特征在于它包含權(quán)利要求2或者3所述的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述的重組菌為重組畢赤酵母。
6.ー種角蛋白酶，其特征在干它由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的角蛋白酶，其特征在干它的氨基酸序列如SEQID N0:2所/Jn ο
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的角蛋白酶，其特征在干它的最適溫度范圍是50-60°C;最適pH范圍為7-10。
9.權(quán)利要求61任意一項(xiàng)所述角蛋白酶的制備方法，其特征在于包含如下步驟 i、取權(quán)利要求4或者5所述的重組菌，接種到BMGY培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，pH 為 6，至 OD6QQ=2 6 ； ii、收集菌體，將其培養(yǎng)在BMMY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30°C，pH為6，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)劑為甲醇，每24小時(shí)，加甲醇至I %濃度，誘導(dǎo)時(shí)間為96 144h ； iii、收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。
10.權(quán)利要求61任意一項(xiàng)所述角蛋白酶的制備方法，其特征在于包含如下步驟 (O取權(quán)利要求4或者5所述的重組菌接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基上，pH為5. 5，溫度為.30°C下培養(yǎng)，制備得到種子液； (2)取步驟(I)制備的種子液，以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵pH為.4.9，發(fā)酵溫度為30 0C ； 每IL發(fā)酵培養(yǎng)基含有如下成分50g葡萄糖、15g磷酸ニ氫鉀、16g硫酸鎂、IOg硫酸鉀、.O.8g氫氧化鉀、O. 8g硫酸鈣、O. 5g消泡劑、4g硫酸銨、Ig增效劑、生物素O. 473mL、微量元素溶液(PTMl) 2. 2mL ； (3)待碳源耗盡后，補(bǔ)加濃度為25%葡萄糖，流加濃度為25%甘油與甲醇的混合物，誘導(dǎo)表達(dá)，25%甘油與甲醇的體積比為8:1，甲醇的濃度維持為1%，直至酶活出現(xiàn)指數(shù)增長時(shí)終止發(fā)酵； (4)收集培養(yǎng)物上清，分離純化，即得到角蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，公開了包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌，以及SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼的角蛋白酶。本發(fā)明還公開了利用本發(fā)明重組菌制備角蛋白酶的方法，該方法產(chǎn)酶量高，制備的角蛋白酶與天然角蛋白酶的性質(zhì)類似，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/63GK102676561SQ201210140340
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者何軍, 余冰, 吳德, 胡洪, 陳代文 申請人:陳代文