專利名稱：通用型甲型流感病毒(iav)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及病毒的生物檢測技術，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結(jié)合的通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測中使用的引物、探針及相關試劑盒。
背景技術：
流感病毒根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因組由8條負鏈RNA節(jié)段構(gòu)成，根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和9個NA亞型。
甲型流感病毒為常見流感病毒，易變異，最具攻擊力，可引起人的流感并有時引起肺炎和其他并發(fā)癥，主要是氣管和支氣管纖毛柱狀上皮細胞的壞死和脫落，有些病毒株能自然感染禽類和哺乳類動物，具有暴發(fā)突然、蔓延迅速、流行廣泛的特點。世界范圍的流感大流行共發(fā)生4次，其中1918-1919年世界流感大流行導致2000萬人死亡。中國近半個世紀以來流感流行共計發(fā)生18次，其中3次為大流行。目前，常用的甲型流感病毒實驗室檢查方法包括1)免疫學檢測方法，如快速流感抗原檢測、免疫熒光法(或裝配的IFA)，此法靈敏度較低，不易推廣應用；2)細胞生物學檢測方法，常用有雞胚接種法和細胞培養(yǎng)法，此法對病毒分離法較敏感，但需要2-3周時間，無法實現(xiàn)早期快速診斷；3)分子生物學檢測方法，目前有逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(Reverse Transcriptase-PCR,簡稱RT-PCR)和實時突光定量聚合酶鏈式反應(Real TimeFluorescent Quantified PCR，簡稱FQ-PCR)，RT-PCR采用“基因擴增+擴增子檢測”的操作模式，易引起擴增物的污染，常造成實驗結(jié)果的假陽性或假陰性現(xiàn)象，實時熒光定量PCR(FQ-PCR)雖在技術上解決了上述問題，其靈敏度和準確度較高，但操作復雜，檢測成本相對昂貴，阻礙了其在發(fā)展中國家的大規(guī)模推廣使用。實時突光核酸恒溫擴增檢測技術(SimultaneousAmplification and Testing,簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者檢測體系多了一個逆轉(zhuǎn)錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行(42°C )，無需熱循環(huán)。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA多聚酶進行核酸擴增，相對于其它核酸擴增技術，反應抑制物更少，能有效減少假陰性結(jié)果。然而，SAT技術在不同種類病毒的檢測中應用所面臨的問題各不相同，需要具體分析病毒的特性進行專門設計。目前尚無針對甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有的通用型甲型流感病毒(IAV)檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易引起擴增物的污染造成實驗結(jié)果的假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題，本發(fā)明提供了一種檢測周期短、高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩(wěn)定以及檢測成本低、易于推廣應用的通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。本發(fā)明所提供的通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物T7和nT7，和一條用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的IAV檢測探針。所述捕獲探針可與如序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)序列特異結(jié)合，在有IAV內(nèi)標(IAV IC RNA)時，其最好還可與該IAV內(nèi)標序列特異結(jié)合，所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV擴增引物由T7引物和nT7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示,5’端標記FAM突光基團,3’端標記DABCYL淬滅基團。進一步，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn) 錄酶和17 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和IAV檢測探針存在于一 IAV檢測液中。再進一步所述試劑盒還包含有IAV內(nèi)標和內(nèi)標檢測探針；所述IAV內(nèi)標為競爭性內(nèi)標，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并與IAV靶標核苷酸(IAV RNA)使用同一對引物(T7和nT7)，IAV內(nèi)標由序列表中序列7所示的IAV IC RNA ;所述內(nèi)標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內(nèi)標檢測探針存在于IAV檢測液中。更進一步，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標，其中裂解液含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針和磁珠；洗滌液含NaCl和SDS ;IAV 反應液含 dNTP 和 NTP ；IAV檢測液含17引物、n!7引物、IAV檢測探針和內(nèi)標檢測探針；SAT酶液含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶；IAV陽性對照；含甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；IAV內(nèi)標含IAV內(nèi)標RNA(IAV IC RNA,序列如序列表中序列7所示)。具體的，所述試劑盒中一個反應單位中上述各種試劑組成如下(I)裂解液HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5_50mM ;(2)核酸提取液HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕獲探針1-50 u M (優(yōu)選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS, EDTA I-IOmM ；(4) IAV 反應液Tris 10_50mM，MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(優(yōu)選為0. 5-5mM)，NTP l-20mM(優(yōu)選為 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5_40mM ；
(5) IAV檢測液將IAV擴增引物和IAV檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-lOpmol/反應均可；其中17引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，nT7引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，IAV檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應’內(nèi)標檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應；(6) SAT 酶液=M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應)、T7RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(優(yōu)選為 500-1000U/ 反應)、2_10mM HEPES pH7. 5、IO-IOOmM N-acetyl_L-cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH 8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) IAV陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；(8) IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；(9) IAV內(nèi)標含IO5-IO8拷貝/mL IAV IC RNA (序列如序列表中序列7所示)體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。另一種更具體形式，所述試劑盒由A盒即標本處理單元和B盒即核酸擴增檢測單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照及IAV內(nèi)標。所述IAV陽性對照中的體外轉(zhuǎn)錄的IAV RNA以下述方法制備I)用化學合成法合成IAV M基因中無二級結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)將片段克隆至ijpGEM ~T載體中，構(gòu)建IAV陽性對照質(zhì)粒；3) IAV陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-IAV菌株，貯存于-70。。；4)從pGEM -T-IAV菌株中提取pGEM -T-IAV質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。所述IAV內(nèi)標中的體外轉(zhuǎn)錄的IAV IC RNA以下述方法制備I)用化學合成法合成一段除探針檢測區(qū)域序列不同，其他序列基本同IAV靶標序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構(gòu)建IAV內(nèi)標質(zhì)粒；3) IAV內(nèi)標質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM _T_IAV IC菌株，貯存于-70。。； 4)從pGEM -T-IAV IC菌株中提取pGEM -T-IAV IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標RNA。所述通用型甲型流感病毒(IAV)實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒中的專用試齊U，為以下表示的物質(zhì)之一(I)可與序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TC0,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
(2)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示； (3)用于與在17 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的IAV檢測探針，所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；(4)內(nèi)標和內(nèi)標檢測探針，內(nèi)標為IAV核苷酸序列(IAV RNA)的競爭性內(nèi)標，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對引物(T7和n!7引物)，內(nèi)標的核苷酸序列如序列表中序列7所示IAV IC RNA,內(nèi)標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。所述試劑盒的使用方法，用于通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下操作I)用裂解液裂解待測樣品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的裂解液；2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液和IAV IC RNA，使捕獲探針與靶標或內(nèi)標核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和 IAV IC RNA ；3)將步驟2)提取的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA加入由IAV反應液和IAV檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比為3 I ；4)根據(jù)熒光信號產(chǎn)生的時間和強度參照IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標檢測結(jié)果對待測樣品進行定性檢測。本發(fā)明提供了一種通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，使用該試劑盒進行檢測，與現(xiàn)有的IAV檢測相比，具有以下優(yōu)點(I)高特異性、高純度、低污染針對IAV靶核酸設計的優(yōu)選捕獲探針，可高效、特異性捕獲IAV的RNA。同時，由于采取封閉式的恒溫放大檢測系統(tǒng)，整個過程中無需打開反應體系，因而避免了擴增子的污染。(2)快速檢測將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，而且整個過程中沒有溫度的升降及循環(huán)，因而所需時間大大縮短，擴增檢測只需要50分鐘。(3)污染易控與實時熒光PCR相比，本發(fā)明的擴增產(chǎn)物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制較容易。(4)設備簡單，成本低與實時熒光定量PCR相比，本發(fā)明所用的儀器無需升降溫循環(huán)，因而設計和生產(chǎn)成本大幅降低。綜上所述，本發(fā)明試劑盒能夠檢測拭子中的IAV RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達lOOcopies/反應)、污染低(擴增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(50分鐘完成擴增檢測)的特點，將在通用型甲型流感早期感染的臨床診斷中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖I為臨床樣本咽拭子的靶標熒光檢測結(jié)果圖2為臨床樣本咽拭子的內(nèi)標熒光檢測結(jié)果圖3為臨床樣本鼻拭子的靶標熒光檢測結(jié)果圖4為臨床樣本鼻拭子的內(nèi)標熒光檢測結(jié)果圖5為采用已有甲型流感病毒通用型核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)對照檢測臨床樣本鼻拭子的結(jié)果
具體實施例方式本發(fā)明通用型甲型流感病毒(IAV)檢測技術，將特異性靶標捕獲技術與實時熒光 核酸恒溫擴增(SAT)技術結(jié)合而形成。由于甲型流感病毒包括的亞型較多，如常見的HI、H3、H5、H7、H9，所以要覆蓋如此多的亞型，在檢測靶標的選擇上就必須考慮試劑盒對各亞型檢測的通用性，因此必須選擇在各個亞型之間保守性較強的基因作為檢測靶標。甲型流感病毒各亞型之間保守性強的基因為M基因，因此本發(fā)明的發(fā)明人通過研究分析確定了M基因上一段甲型流感各亞型之間保守性強，但對B、C型流感特異的序列作為檢測靶標，這樣既保證對甲型流感檢測的高度覆蓋，又保證了對B、C型流感檢測的特異性。本發(fā)明通過設計專用的捕獲探針，高效、特異性捕獲IAV的RNA ;核酸擴增使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA多聚酶來同時實現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標核酸RNA的一個DNA拷貝，17 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個RNA拷貝，帶有熒光標記的優(yōu)化檢測探針和擴增后產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號可由檢測儀器捕獲。本發(fā)明中的專用引物和探針包括(I)捕獲探針一條可與序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),在有IAV內(nèi)標(IAV IC RNA)時，其還可與該IAV內(nèi)標序列特異結(jié)合；所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示。(2) IAV擴增引物一對用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生IAV靶標核酸(IAVRNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物，所述IAV擴增引物由17引物和n!7弓丨物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3) IAV檢測探針一條用于與在17 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述IAV靶標核酸(IAVRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的IAV檢測探針，所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM熒光標記，3’端用DABCYL熒光標記。為便于進行結(jié)果分析，還包括⑷一條內(nèi)標檢測探針和IAV內(nèi)標，內(nèi)標檢測探針為在使用IAV內(nèi)標時與該內(nèi)標配合使用的內(nèi)標檢測探針，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；IAV內(nèi)標為IAV核苷酸序列(IAV RNA)的競爭性內(nèi)標，同時與所述捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對引物CT7和nT7引物)。IAV內(nèi)標的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名為IAVIC RNA(IC含義為內(nèi)標)。基于以上設計，本發(fā)明進一步提供一種通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。該試劑盒，至少包含所述捕獲探針(序列2)，一對所述T7引物(序列3)和n!7引物(序列4)，以及一條所述IAV檢測探針(序列5)。進一步，所述試劑盒還可包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述17弓丨物、n!7引物和IAV檢測探針存在于IAV檢測液中。再進一步，所述試劑盒還可包含競爭性IAV內(nèi)標(序列7)和內(nèi)標 檢測探針(序列6)，所述的內(nèi)標檢測探針存在于IAV檢測液中。更具體來講，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標，各組分說明如下(I)裂解液用于裂解和保存待測樣品中的甲型流感病毒(IAV)，為含有去垢劑和HEPES緩沖液的溶液，去垢劑主要為硫酸銨((NH4)2SO4，優(yōu)選為5-50mM)；(2)核酸提取液用于提取和純化IAV病毒RNA，為含捕獲探針1_50 uM(優(yōu)選為5-25 u M)和磁珠50-500mg/L(優(yōu)選為50_250mg/L)的水溶液；(3)洗滌液用于磁珠清洗，為含Iwt % SDS的水溶液。(4) IAV反應液SAT擴增所需組分，含dNTP 0. l_10mM(優(yōu)選為0. 5_5mM)和NTPl-20mM(優(yōu)選為I-IOmM)的水溶液； (5) IAV檢測液含SAT擴增所需引物和探針的水溶液，各引物或探針的濃度在5-lOpmol/反應均可，其中17引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，nT7引物濃度優(yōu)選為
7.5pmol/反應’ IAV檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應’內(nèi)標檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應；(6) SAT酶液SAT擴增所需多酶反應體系，主要含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(優(yōu)選為500-1500U/反應)、17 RNA聚合酶200-2000U/反應(優(yōu)選為500-1000U/反應)；(7) IAV陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；(8) IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；(9) IAV內(nèi)標含IO5-IO8拷貝/mL IAV內(nèi)標RNA (序列7)，是IAV核苷酸序列(IAVRNA)的競爭性內(nèi)標，為體外轉(zhuǎn)錄RNA(IAV IC RNA)稀釋物。以上所述試劑盒中各組成的進一步說明如下裂解液的主要有效成分是去垢劑，高濃度去垢劑的存在能夠使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分離法進行核酸提取，其主要成分為磁性顆粒和捕獲探針。捕獲探針一端與靶標互補，一端與磁性顆?；パa連接，在核酸提取過程中，細菌裂解釋放出的核酸與核酸提取液中的磁性顆粒特異結(jié)合，在不需要傳統(tǒng)的離心操作的情況下，通過洗滌液清洗磁性顆粒而獲得純凈的病毒靶標核酸(RNA)。病毒RNA的提取通過特異性吸附原理來實現(xiàn)。IAV檢測液中IAV檢測探針為分子信標，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價標記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發(fā)夾型或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標的環(huán)部分和靶標互補，兩頭由于互補而成為莖，分子信標探針與線性的TaqMan探針相比，因其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。由于SAT擴增易受多種因素影響而使擴增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯誤的結(jié)論，本發(fā)明的試劑盒中設置了 IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標。其中，IVA陽性對照和IAV內(nèi)標為體外轉(zhuǎn)錄的RNA，不具有生物學活性。通過檢測陽性對照，可證明試劑盒檢測方法及材料無誤，保證檢測的準確性，同時可以監(jiān)測每次檢測的重復性和穩(wěn)定性及試劑盒批次間的差異。此外，通過陽性對照品可制備臨界弱陽對照(以生理鹽水和裂解液按I : I混合成為稀釋液，稀釋陽性對照1000倍作為臨界弱陽對照)，可以提示處于臨界值狀態(tài)時的檢驗操作情況，通過臨界弱陽對照定期檢測SAT實驗室，可進行室內(nèi)質(zhì)量控制，以防止檢測過程出現(xiàn)漏檢(假陰性)的情況。IAV內(nèi)標作為IAV RNA的競爭性內(nèi)標，其最主要的作用就是控制假陰性結(jié)果的發(fā)生，通過檢測加入有內(nèi)標的樣本，可了解整個擴增反應體系是否受抑制，更好的提示假陰性。陰性對照可排除 假陽性，在正確使用試劑盒檢測方法和材料情況下，可保證檢測的特異性。利用以上試劑盒對通用型甲型流感病毒(IAV)進行實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下步驟I)用裂解液裂解待測樣品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的溶液；2)向步驟I)得到的溶液中加入核酸提取液和IAV IC RNA，使捕獲探針與靶標或內(nèi)標核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，保留在磁珠上的即為提取得到的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA ；3)將步驟2)提取的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA加入由IAV反應液和IAV檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比可為3:1;4)根據(jù)熒光信號產(chǎn)生的時間和強度參照IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標檢測結(jié)果對待測樣品進行定量或定性檢測。在上述檢測操作中，所述步驟I)中的待測樣品為咽拭子或鼻拭子。所述步驟4)中的IAV陽性對照為含IO5-IO8拷貝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；IAV陰性對照為不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；IAV內(nèi)標為含IO5-IO8拷貝/mL IAV內(nèi)標RNA(序列7)稀釋物。實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例中所用主要原料SAT酶液、陽性對照及內(nèi)標的體外轉(zhuǎn)錄RNA由美國RD Biosciences公司提供，7500型PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，MX3005熒光定量儀為Stratagene公司產(chǎn)品，NTPs、dNTPs等試劑和其他儀器均為常規(guī)可商購產(chǎn)品。實施例I、用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測通用型甲型流感病毒(IAV)的專用引物和探針的設計本發(fā)明選擇IAV病毒M基因中無二級結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根據(jù)引物探針設計原理，使用DNA ATAR、DNAman軟件和人工設計用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測通用型甲型流感病毒(IAV)的專用引物和探針序列，得到如下具體序列(I) 一條可與如序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO, Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列為 5，-AUCYUCCAGUCUCUGCGCGAaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’ (Y 為簡并喊基，代表C/T，序列表中序列2)；(2) 一對用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物，所述IAV擴增引物由17引物和nT7弓I物組成，T7引物序列為5，-aatttatacgactcactatagggagaCCTAAVATYCCCTTAGTCAGAGGTGACA-3’(V、Y 代表簡并堿基，V 代表 A/G/C，Y代表C/T，序列表中序列3)，nT7引物序列為5’ -AAGAAYACCGATCTTGAGGC-3’ (Y代表簡 并堿基，代表C/T，序列表中序列4)；(3) 一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的IAV檢測探針，所述IAV檢測探針的核苷酸序列為5’-cacGCAAGACAAGACCAAuCgcgug-3’ (序列表中序列5)，5’端用FAM熒光標記，3’端用DABCYL熒光
I■■己 O(4)為便于進行結(jié)果分析，還配合試劑盒中增加的競爭性IAV內(nèi)標(序列7)，設計了競爭性內(nèi)標檢測探針，IAV內(nèi)標與IAV靶標核苷酸(IAV RNA)擁有相同的引物結(jié)合區(qū)，兩引物之間的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測探針結(jié)合，但能與內(nèi)標探針結(jié)合，所述IAV內(nèi)標可通過IAV靶標模板定點突變構(gòu)建獲得，可與捕獲探針特異性結(jié)合，所述內(nèi)標檢測探針為與IAV檢測探針序列、突光標記不同,但堿基數(shù)一致的探針,所述的內(nèi)標檢測探針的核苷酸序列為5’ -ccagGUAAUUCGGCACGUGGccugg-3’ (序列表中序列6), 5’端標記HEX突光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。實施例2、制備通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒利用實施例I所提供的專用引物和探針，得到本發(fā)明通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。該試劑盒包含有捕獲探針(TCO，Target CaptureOligo)、T7引物、n!7引物、IAV檢測探針、內(nèi)標檢測探針、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶。所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和IAV檢測探針、內(nèi)標檢測探針存在于IAV檢測液中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具體來講，所述試劑盒分為2-30°C儲存的A盒(標本處理單元)和-15—35°C儲存的B盒(核酸擴增檢測單元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗滌液，B盒包括IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標，主要成分如下A盒(標本處理單元)組成為裂解液；含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針1-50 uM(優(yōu)選為5-25 u M)和磁珠50_500mg/L(優(yōu)選為50-250mg/L)；洗滌液主要含Iwt % SDS。
B盒(核酸擴增檢測單元)組成為IAV 反應液含 dNTP 0. I-IOmM (優(yōu)選為 0. 5_5mM)，NTP l-20mM(優(yōu)選為 I-IOmM)；IAV檢測液含引物和探針，各引物和探針的濃度在5-lOpmol/反應均可，其中17引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，nT7引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，IAV檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應’內(nèi)標檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應；SAT 酶液含 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(優(yōu)選為500-1000U/反應);IAV陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲 型流感病毒的溶液，如生理鹽水；IAV內(nèi)標含IO5-IO8拷貝/mL IAV IC RNA稀釋物(序列表中序列7)。試劑盒中所包含的所有試劑均可按提示以常規(guī)方法制備取得或商業(yè)購買得到。具體來講，每一反應單位中，所述試劑盒各種試劑的具體組配如下(I)裂解液為裂解和保存人咽拭子和鼻拭子中的甲型流感病毒(IAV)，含有硫酸銨和HEPES緩沖液的溶液，具體包含HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；(2)核酸提取液為提取甲型流感病毒(IAV)RNA的含有oligo(dT)包被的磁珠和特異結(jié)合靶標核酸(IAV RNA)的一段RNA序列的溶液，具體包含HEPES 50-400mM, EDTA40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針 1-50 u M (優(yōu)選為 5-25 u M)，磁珠 50_500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液為含 SDS、NaCl 的溶液，具體包含 HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1%SDS I-IOmM, EDTA I-IOmM ；(4) IAV反應液為含dNTPs和NTPs擴增所需組份，具體包含Tris 10-50mM,MgCl210-40mM, dNTP 0. l-10mM(優(yōu)選為 0. 5_5mM)，NTP l_20mM(優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP401-10%,KCl 5-40mM ；(5) IAV檢測液將恒溫擴增時必需的IAV擴增引物和IAV檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探針濃度在5-10pmol/反應均可，其中17引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，nT7引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，IAV檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應，內(nèi)標檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應；(6) SAT酶液為恒溫擴增時必需的多酶組分體系，含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(優(yōu)選為500-1500U/反應)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(優(yōu)選為500-1000U/反應)、2_10mM HEPES pH7.5、IO-IOOmM N-acetyl-L-cysteine>0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose,40-200mM Tris-HCl pH 8. 0、40-200mM KCU0. 01-0. 5mM EDTA,0. 1-1 % (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) IAV陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；(8) IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；(9) IAV內(nèi)標含IO5-IO8拷貝/mL IAV內(nèi)標RNA (序列表中序列7)。
IAV陽性對照中的體外轉(zhuǎn)錄的IAV RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下(I)用化學合成法合成IAV M基因中無二級結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；(2)將片段克隆到pGEM _T載體中，構(gòu)建IAV陽性對照質(zhì)粒；(3) IAV陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-IAV菌株，貯存于-70。。；(4)從pGEM -T-IAV菌株中提取pGEM -T-IAV質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。IAV內(nèi)標中的體外轉(zhuǎn)錄的IAV IC RNA，可以通過多種方法制備所得。其中一種制 備方法如下(I)用化學合成法合成一段除探針檢測區(qū)域序列不同，其他序列基本同IAV靶標序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；(2)將片段克隆到pGEM ~T載體中，構(gòu)建IAV內(nèi)標質(zhì)粒；(3) IAV內(nèi)標質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-IAV IC菌株，貯存于-70。。；(4)從pGEM -T-IAV IC菌株中提取pGEM -T-IAV IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標RNA。實施例3、臨床樣本咽拭子的實時熒光核酸恒溫擴增檢測用本發(fā)明試劑盒(組成見實施例2)檢測臨床樣本咽拭子中的通用型甲型流感病毒(IAV)，具體方法包括以下步驟(I)樣本采集、運輸及保存由臨床醫(yī)師根據(jù)實際情況進行標本采集，檢測標本為咽拭子，采集方法為專用采樣棉簽擦拭咽后壁及兩側(cè)咽扁桃體部分，將拭子侵入3-5mL生理鹽水中，密封送檢。樣本采集后48小時內(nèi)4°C保存送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室(或者_70°C保存待測，一周內(nèi)送達)。(2)核酸提取2. I在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入200 裂解液(含HEPES 35mM,(NH4) 2S0420mM)，200 ill拭子洗液(用生理鹽水洗滌下的樣本溶液，不足以生理鹽水補足)，用裂解液裂解待測樣品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的裂解液。2. 2在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM,捕獲探針 10 u M，磁珠 250mg/L), 10 U I 內(nèi)標溶液(含 IO6 拷貝 /mLIAV內(nèi)標RNA)，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。2. 3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復2次。2. 4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復合物，備用(此步應清晰可見磁珠)。(3) SAT核酸擴增檢測
3. I向樣品處理管中加入40 ill反應檢測液(40iU IAV反應液+2. 5iil IAV檢測液)洗滌磁珠。IAV 反應液具體包含 Tris 30mM,MgCl2 IOmM, dNTP 4mM, NTP 7mM,PVP405%,KCl 25mM ; IAV檢測液中T7引物濃度為7. 5pmol，nT7引物濃度為7. 5pmol，IAV檢測探針濃度為5pmol,內(nèi)標檢測探針濃度為5pmol。3. 2取振蕩混勻的上述反應檢測液30 U I加至潔凈微量反應管，用7500型PCR儀(美國ABI公司產(chǎn)品)60°C保溫10分鐘，42 °C保溫5分鐘；向微量反應管中加入10 yl已預熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻。SAT酶液中含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1200U，T7RNA 聚合酶 800U/ 反應，IOmM HEPES pH7. 5，20mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.25mM zinc acetate (乙酸鋒)、30mMtrehalose (海藻糖)、IOOmM Tris-HCl pH
8.0,200mM KC1,0. ImM EDTA,0. 8% (v/v) Tri ton X-100 和 40% (v/v) glycerol (丙三三醇)；、
3. 3將微量反應管快速轉(zhuǎn)至恒溫熒光檢測儀器(ABI7500熒光定量儀，ABI公司產(chǎn)品，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長相近)，42°C反應50分鐘，設定每I分鐘檢測一次熒光，共檢測50次。(4)結(jié)果判定根據(jù)PCR擴增結(jié)果得到的曲線，設定閥值線，讀取dt值，判定結(jié)果。閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(shù)(與一般實時熒光PCR實驗結(jié)果的ct值類似)①陽性結(jié)果判定Fl通道dt ( 45的樣本為陽性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測,檢測結(jié)果Fl通道dt < 50的樣本為陽性。②陰性結(jié)果判定F1通道dt無數(shù)值或為50，同時F2通道dt ( 45，則為陰性。質(zhì)量控制每次檢測均設置陽性對照和陰性對照，且結(jié)果應同時滿足陽性對照Fl通道dt < 45 ;陰性對照Fl通道dt無數(shù)值或為50，同時F2通道dt < 45，否則此次檢測結(jié)果視為無效。(5)結(jié)果甲型流感病毒咽拭子臨床樣本編號為IAV咽拭子標本1-7，另設陰性對照(IAV陰性對照，為不含有甲型流感病毒的靶標核酸(IAV RNA) 40倍稀釋液)、陽性對照(IAV陽性對照，為含IO7拷貝/mL甲型流感病毒M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA 40倍稀釋液)各一個。結(jié)果如圖I (Fl熒光通道)和圖2 (F2熒光通道)所示，根據(jù)Fl通道和F2通道的dt值情況，判定樣本2，4，5，7為陽性，樣本1，3，6為陰性。本結(jié)果與金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果完全相同，表明本發(fā)明試劑盒用于檢測臨床樣本咽拭子中的通用型甲型流感病毒(IAV)準確性高，但擴增檢測時間僅需50分鐘，具有周期短、高靈敏度、高特異性、低污染和反應穩(wěn)定的特點。實施例4、臨床樣本鼻拭子的實時突光核酸恒溫擴增檢測本檢測模式為本發(fā)明的另一個應用試劑盒組成同實施例2，試劑的生產(chǎn)在GMP車間進行；鼻拭子臨床樣本由臨床醫(yī)師根據(jù)實際情況進行標本采集，采集方法為將帶有聚丙烯纖維頭的拭子分別插入鼻道內(nèi)鼻腭處，將拭子侵入3-5mL生理鹽水中，密封送檢。樣本采集后48小時內(nèi)4°C保存送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室，或者_70°C保存待測，一周內(nèi)送達。甲型流感病毒鼻拭子臨床樣本編號為IAV鼻拭子標本1-7，另設陰性對照、陽性對照各一個。檢測方法同實施例3，檢測中所用試劑量同實施例3。另同步進行對照檢測用北京華大吉比愛生物技術有限公司生產(chǎn)的甲型流感病毒通用型核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，F(xiàn)Q-PCR，國食藥監(jiān)械(準)字2011第3400098號)并參照試劑盒說明書對鼻拭子中的通用型甲型流感病毒(IAV)進行檢測，具體方法包括以下步驟I、樣本處理a)取200ul鼻拭子浸液和該試劑盒提供的陰性對照品和陽性對照品各25ul，分別加入I. 5mL無Rnase和Dnase的離心管中，加入300ul核酸提取液(為TriZol),振蕩混勻。然后再加入_20°C預冷200ul氯仿，振蕩混勻后，室溫放置2min，4°C 13000rpm離心5min。b)將步驟a)的上清轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL無Rnase和Dnase的離心管中，加入等體積 的_20°C預冷的異丙醇,室溫放置5min后，4°C 13000rpm離心5min,棄上清。c)向沉淀中加入lmL-20°C預冷的75 %乙醇溶液，振蕩混勻，4°C 13000rpm離心5min,棄上清,重復一次，自然晾干。d)向沉淀中加入50ul無Rnase和Dnase水,振蕩混勻,立即用于檢測或放入_70°C保存待測。2、擴增試劑準備從試劑盒中取出核酸反應液，待其溶解后，振蕩混勻。向熒光定量PCR八聯(lián)反應管中加入19. 7ul核酸反應液和0. 3ul逆轉(zhuǎn)錄酶，壓緊管蓋，迅速將其轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
3、加樣在所設定各熒光定量PCR八連反應管中分別加入步驟I中提取的RNA各IOul，壓緊管蓋，2000rpm離心IOsec。將熒光定量PCR八連管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)。4、PCR 擴增設置ABI7300 和 ABI7500 的程序50°C 30min I 個循環(huán)；95°C 15min I 個循環(huán)；94°C 15sec，58°C 45sec*40個循環(huán)(*為熒光信號采集步驟)。儀器檢測通道選擇發(fā)光熒光基團為FAM熒光素，淬滅熒光基團為TAMAR熒光素，參考熒光基團為ROX熒光素，具體檢測通道設置參照各儀器使用說明。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線的最高點為準。檢測結(jié)果分析I、如果擴增曲線呈S型曲線，或陰性對照的Ct值應為0或無數(shù)值、弱陽性對照品的Ct值應> 26并且< 38、強陽性對照品的Ct值< 26，則本次試驗有效，否則試驗無效。2、如果擴增曲線呈S型，且待測樣本Ct值彡38，為甲型流感病毒檢測陽性。3、如果擴增曲線不呈S型，且待測樣本Ct值為0或無數(shù)值，為甲型流感病毒檢測陰性。4、如果擴增曲線呈S型，且待測樣本Ct值> 38，需重新檢測。若重新檢測Ct值>38，則報告為檢測陽性；若重新檢測Ct值為0或無數(shù)值，為甲型流感病毒檢測陰性。5、結(jié)果判讀若甲型流感病毒通用型試劑檢測結(jié)果為陽性，而甲型HlNl流感病毒(2009)試劑檢測為陰性，則報告為甲型流感病毒RNA陽性。
若甲型流感病毒通用型試劑檢測結(jié)果為陽性，而甲型HlNl流感病毒(2009)試劑檢測為陽性，則報告為甲型HlNl流感病毒(2009)RNA陽性。若甲型流感病毒通用型試劑檢測結(jié)果為陰性，而甲型HlNl流感病毒(2009)試劑檢測為陽性，實驗異常須重新采集標本按試劑盒說明書要求進行檢測。檢測為陰性，并不代表該患者為非流感患者，具體診斷結(jié)果須結(jié)合其他臨床診斷結(jié)果判斷。使用本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果如圖3(F1熒光通道)和圖4(F2熒光通道)所示，熒光素通道Fl為FAM，F(xiàn)2為VIC，42°C反應50分鐘，設定每I分鐘檢測一次熒光，共檢測50次。根據(jù)Fl通道和F2通道的dt值情況，判定樣本7檢測為陰性，樣本1-6為陽性(樣本7圖3顯示為陰性，圖4顯示有信號，正說明內(nèi)標可檢測出，反應體系 沒有受環(huán)境影響，排除假陰性)，其結(jié)果與目前已上市試劑盒(華大吉比愛的通用甲流檢測試劑盒)檢測結(jié)果(見圖5，Ct值的含義是每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，在華大試劑盒中的Ct，指在94°C 15sec，58°C 45sec的過程中循環(huán)了 40次，采集了 40次熒光。這個過程中涉及升溫和降溫，I個循環(huán)約2 3分鐘，因此整個PCR擴增反應至少100分鐘)完全相同。FQ-PCR檢測準確度較高，但其操作復雜，檢測時間長，單PCR擴增就需100分鐘(從PCR擴增程序中可計算出30+15+40 X 2 ^ 125分鐘)，PCR擴增環(huán)節(jié)易造成環(huán)境DNA污染，而本試劑盒擴增產(chǎn)物為RNA，在環(huán)境中易降解，低污染。此外，樣本處理環(huán)節(jié)需冷凍高速離心設備，PCR擴增環(huán)節(jié)需高溫循環(huán)過程，整個檢測過程的檢測成本相對昂貴。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領域的熟練技術人員無須過多實驗即可對本發(fā)明所要求保護的通用型甲型流感病毒(IAV)實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒進行實施，并達到預期效果。本發(fā)明公開的實施例僅是對本發(fā)明進行詳細描述，但并不足構(gòu)成對本發(fā)明限制。本領域的熟練技術人員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學上或生物上結(jié)構(gòu)功能相關的制劑替代在此描述的制劑，或?qū)Ρ景l(fā)明相關內(nèi)容進行變動，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想，均落入本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)的捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物T7和nT7，和一條用于與在17 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述IAV靶標核酸(IAV RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的IAV檢測探針。
2.根據(jù)權利要求I所述試劑盒，其特征在于所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV擴增引物由T7引物和n!7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，n!7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有M-M LV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV檢測探針存在于一 IAV檢測液中。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有IAV內(nèi)標和內(nèi)標檢測探針；所述IAV內(nèi)標為IAV核苷酸序列(IAV RNA)的競爭性內(nèi)標，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對引物(T7和nT7引物)，由序列表中序列7所示的IAV IC RNA ;所述內(nèi)標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內(nèi)標檢測探針存在于IAV檢測液中。
5.根據(jù)權利要求I至4任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標，其中 裂解液含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ； 核酸提取液含捕獲探針和磁珠； 洗滌液含NaCl和SDS ； IAV反應液含dNTP和NTP ； IAV檢測液含17引物、n!7引物、IAV檢測探針和內(nèi)標檢測探針； SAT酶液含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶； IAV陽性對照；含甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物； IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水； IAV內(nèi)標IAV內(nèi)標RNA(IAV IC RNA,序列如序列表中序列7所示)。
6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中一個反應單位中各種試劑組成如下(1)裂解液HEPES25-250mM, (NH4)2SO4 5_50mM ； (2)核酸提取液HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 u M (優(yōu)選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA I-IOmM ；(4)IAV 反應液Tris 10-50mM,MgCl2 10-40mM, dNTP 0. l-10mM(優(yōu)選為 0. 5-5mM), NTPl-20mM(優(yōu)選為 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；(5)IAV檢測液將IAV擴增引物和IAV檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-lOpmol/反應均可；其中17引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，n!7引物濃度優(yōu)選為7. 5pmol/反應，IAV檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應，內(nèi)標檢測探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應； (6)SAT酶液M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(優(yōu)選為500-1500U/反應)、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(優(yōu)選為 500-1000U/ 反應)、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L_cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH 8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ； (7)IAV陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；(8)IAV陰性對照不含有甲型流感病毒(IAV)靶標核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型 流感病毒的溶液； (9)IAV內(nèi)標含IO5-IO8拷貝/mL IAV IC RNA (序列如序列表中序列7所示)體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。
7.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于由A盒即標本處理單元和B盒即核酸擴增檢測單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述IAV反應液、IAV檢測液、SAT酶液、IAV陽性對照、IAV陰性對照及IAV內(nèi)標。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述IAV陽性對照中的體外轉(zhuǎn)錄的IAV RNA以下述方法制備 1)用化學合成法合成IAVM基因中無二級結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)； 2)將片段克隆到pGEM ~T載體中，構(gòu)建IAV陽性對照質(zhì)粒； 3)IAV陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-IAV菌株，貯存于-70。。； 4)從pGEM -T-IAV菌株中提取pGEM -T-IAV質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA ； 存在IAV內(nèi)標時，體外轉(zhuǎn)錄的IAV IC RNA以下述方法制備 (1)用化學合成法合成一段除探針檢測區(qū)域序列不同，其他序列基本同IAV靶標序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)； (2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構(gòu)建IAV內(nèi)標質(zhì)粒； (3)IAV內(nèi)標質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-IAV IC菌株，貯存于-70。。； (4)從pGEM -T-IAVIC菌株中提取pGEM -T-IAV IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標RNA。
9.權利要求1-8任一所述通用型甲型流感病毒(IAV)實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質(zhì)之一 (I)可與序列表中序列I所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶標核酸(IAV RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示； (2)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生IAV靶標核酸(IAVRNA)的DNA拷貝的IAV擴增引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示； (3)用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述IAV靶標核酸(IAVRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的IAV檢測探針，所述IAV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團； (4)內(nèi)標和內(nèi)標檢測探針，內(nèi)標為IAV核苷酸序列(IAVRNA)的競爭性內(nèi)標，可與(I)所述捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對引物CT7和n!7引物)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；內(nèi)標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
10.一種權利要求1-8任一所述的試劑盒的使用方法，用于通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下操作 1)用裂解液裂解待測樣品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的裂解液； 2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液和IAV內(nèi)標，使捕獲探針與靶標或內(nèi)標核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和 IAV IC RNA ； 3)將步驟2)提取的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAVIC RNA加入由IAV反應液和IAV檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比為3 I ； 4)根據(jù)熒光信號產(chǎn)生的時間和強度參照IAV陽性對照、IAV陰性對照和IAV內(nèi)標檢測結(jié)果對待測樣品進行定性檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通用型甲型流感病毒(IAV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。包括捕獲探針、IAV擴增引物T7引物和nT7引物、IAV檢測探針、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶等試劑。本發(fā)明試劑盒能夠檢測拭子中的IAV RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達100copies/反應)、污染低(擴增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(常規(guī)50分鐘完成檢測)的特點，將在通用型甲型流感早期感染的臨床診斷中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK102703603SQ20121014033
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權日2012年5月7日
發(fā)明者于明輝, 馮金夢, 居金良, 方亮 申請人:上海仁度生物科技有限公司