專利名稱：核酸的檢測方法、樣品的光學(xué)觀察方法及熒光物質(zhì)的制作方法
核酸的檢測方法、樣品的光學(xué)觀察方法及熒光物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域
本技術(shù)涉及核酸的檢測方法、樣品的光學(xué)觀察方法及熒光物質(zhì)。更具體地，本技術(shù)涉及核酸的檢測方法和樣品的光學(xué)觀察方法，兩種方法都是基于從與銅接觸的核酸中發(fā)出的熒光，以及包括銅和核酸的熒光物質(zhì)。
背景技術(shù)：
近年來，在包括醫(yī)療領(lǐng)域、藥物研發(fā)領(lǐng)域、臨床檢查領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、工程領(lǐng)域、法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和刑事鑒定領(lǐng)域的多個領(lǐng)域中廣泛開展利用核酸的技術(shù)研究。最近，技術(shù)開發(fā)了芯片實驗室(lab-on-chip)，并且被實際應(yīng)用于設(shè)置在微芯片中的微觀尺度流路內(nèi)進行核酸的染色、檢測、擴增等。
作為檢測核酸的基本技術(shù)，有一種采用熒光顏料染色核酸的方法。已知許多熒光顏料，例如hoechst33342、DAP1、溴化乙錠、SYBR綠等。舉例來說，hoechst33342和DAPI在流式細(xì)胞儀或顯微鏡中用于細(xì)胞或組織中的核酸染色。溴化乙錠常常用于對電泳中的核酸分子染色。SYBR綠等也被用于在例如聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴增技術(shù)中，實時檢測核酸的擴增過程。
與本技術(shù)相關(guān)，通常已知的在熒光觀察時由細(xì)胞顯示的自發(fā)熒光將被描述。熒光之一是在銅存在的條件下，由紫外光照射的細(xì)胞所顯示的橙色的自發(fā)熒光。例如，據(jù)報道當(dāng)加入銅時，果蠅幼蟲中腸內(nèi)的特定部位的細(xì)胞發(fā)射橙色熒光(參照非專利文件I至8)。在果蠅幼蟲中腸內(nèi)，觀察到特別強烈橙色熒光的細(xì)胞被稱之為“銅細(xì)胞”等。據(jù)報道，當(dāng)所加入銅的濃度增加時，在銅細(xì)胞周圍的細(xì)胞(參照非專利文件4)以及幼蟲的整個體壁(參照非專利文件2)觀察到熒光。
描述了在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都可觀察到上述的橙色熒光，并且，尤其是在細(xì)胞質(zhì)的顆粒中被顯著檢測到(參照非專利文件2 4，7)。描述了熒光的波長范圍是590nm 630nm之間，峰值波長是610nm，且最大激發(fā)波長是340nm (參照非專利文件3)。
對于除果蠅外的有機體，具有相似性質(zhì)的自發(fā)熒光也被觀察到。例如，有報道在大鼠實驗中，通過紫外光激發(fā)(激發(fā)波長是310nm)，在給銅的個體肝臟中觀察到橙色熒光(具有605nm的峰值波長)(參照非專利文件9)。此外，有報道在隨著年齡增長在腎臟和肝臟中積累了銅的模型大鼠的腎臟中觀察到類似的熒光(參照非專利文件10)。同樣，有報道在酵母(參照非專利文件11)和 Wilson病患者的人體肝臟組織(參照非專利文件12)中觀察到具有相似特征的自發(fā)熒光。Wilson病是一種銅排泄不足并且在肝臟細(xì)胞中積累銅的遺傳疾病。
推測銅和金屬硫因(MT)的復(fù)合物(在下文中簡寫為“Cu-MT”)為上述的發(fā)射橙色熒光的熒光物質(zhì)(參照非專利文件14 23)。Cu-MT具有諸如非專利文件13中的305nm的激發(fā)波長和565nm的熒光波長，及非專利文件17中的310nm的激發(fā)波長和570nm的熒光波長的波長特性?？梢韵氲降氖?，Cu-MT包含一價銅離子(Cu (I))(參照非專利文件13、15、17,19 和 23)。
通過嘧啶或硫醇鹽與銅相互作用而發(fā)射熒光的含嘧啶或硫醇鹽的復(fù)合物作為含銅的熒光物質(zhì)而廣為人知(參照非專利文件24 29)。
另一方面，過去已研究了各種金屬離子與核酸的相互作用。例如，已知當(dāng)單價銅離子與核酸相互作用時，細(xì)胞核中包含的少量銅使核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但是在過氧化氫共存下，細(xì)胞核中包含的少量銅使DNA受損(參照非專利文件30)。還有報道，與銅的相互作用改變了DNA的吸收光譜(參照非專利文件30和31)。此外，據(jù)報道，吸收光譜的改變依賴于DNA的堿基序列(具體地，具有G-C對的高分子及含A-T對的高分子)(參照非專利文件30)。
引文列表
非專利文件
非專利文件 I ；Physiological genetic studies on copper metabolism in thegenus Drosophila.(1950)Genetics35，684-685
非專利文件2 !Organization and function of the inorganic constituents ofnucle1.(1952)Exp.Cell Res.，Suppl.2:161-179
非專利文件 3:Ultrastructure of the copper-accumulating region of theDrosophila larval midgut.(1971)Tissue Cell.3, 77-102
非專利文件4 !Specification of a single cell type by a Drosophilahomeotic gene.(1994)C ell.76，689-702
非專利文件5:Two different thresholds of wingless signalling withdistinct developmental consequences in the Drosophila midgut.(1995)EMBOJ.14，5016-5026
非專利文件6:Calcium-activated potassium channel gene expression in themidgut of Drosophila.(1997) Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.118, 411-420
非專利文件 7 !Evidence that a copper-metallothionein complex isresponsible for fluorescence in acid-secreting cells of the Drosophila stomach.(2001)Cell Tissue Res.304，383-389
非專利文件8:Peptidergic paracrine and endocrine cells in the midgut ofthe fruit fly maggot.(2009)Cell Tissue Res.336，309-323
非專利文件9:A luminescence probe for metallothionein in liver tissue:emission intensity measured directly from copper metallothionein induced in ratliver.(1989)FEBS Lett.257，283-286
非專利文件 10:Direct visualization of copper-metal lothionein in LECrat kidneys -application of autofluorescence signal of copper—thiolate cluster.(1996)J.Histochem.Cytochem.44，865-873
非專利文件 11 !Incorporation of copper into the yeast Saccharomycescerevisiae.1dentification of Cu(I)—metallothionein in intact yeast cells.(1997)J.1norg.Biochem.66，231-240
非專利文件 12:Portmann B.1mage of the month.Copper-metal lothioneinautofluorescence.(2009)Hepatology.50，1312-1313
非專 利文 件 13 !Luminescence properties of Neurospora coppermetallothionein.(1981)FEBS Lett.127，201-203
非專利文件 14:Copper transfer between Neurospora copper metallothioneinand type3copper apoproteins.(1982)FEBS Lett.142, 219-222
非專 利文 件 15:Spectroscopic studies on Neurospora coppermetallothionein.(1983)Biochemistry.22，2043-2048
非專利文件 16:Metal substitution of Neurospora copper metallothionein.(1984)Biochemistry.23，3422-3427
非專利文件17: (Cu，Zn)-metallothioneins from fetal bovine liver.Chemical and spectroscopic properties.(1985)J.Biol.Chem.260，10032-10038
非專利文件 18 !Primary structure and spectroscopic studies of Neurosporacopper metallothionein.(1986)Environ.Health Perspect.65，21-27
非專利文件 19 !Characterization of the copper-thiolate cluster in yeastmetallothionein and two truncated mutants.(1988)J.Biol.Chem.263, 6688-6694
非專利文件20 !Luminescence emission from Neurospora coppermetallothionein.Time-resolved studies.(1989)Biochem J.260,189-193
非專利文件21 !Establishment of the metal-to-cysteine connectivities insilver-substituted yeast metallothionein(1991)J.Am.Chem.Soc.113，9354-9358
非專利文件 22:Copper-and silver-substituted yeast metallothioneins:Sequential proton NMR assignments reflecting conformational heterogeneity atthe C terminus.(1993)Biochemistry.32，6773-6787
非專利文件 23 !Luminescence decay from copper (I) complexes ofmetallothionein.(1998) Inorg.Chim.Acta.153，115-118
非專利文件24 !Solution Luminescence of Metal Complexes.(1970) Appl.Spectrosc.24，319-326
非專利文件25 !Fluorescence of Cu，Au and Ag mercaptides.(1971)Photochem.Photobiol.13，279-281
非專利文件 26 !Luminescence of the copper—carbon monoxide complex ofNeurospora tyrosinase.(1980)FEBS Lett.111，232-234
非專利文件27 !Luminescence of carbon monoxide hemocyanins.(1980) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.77，2387-2389
非專利文件 28:Photophysical properties of hexanuclear copper (I) andsilver (I) clusters.(1992) Inorg.Chem.，31，1941-1945
非專利文件29 !Photochemical and photophysical properties oftetranuclear and hexanuclear clusters of metals with dlOand s2electronicconfigurations.(1993)Acc.Chem.Res.26，220-226
非專利文件30 !Interaction of copper (I) with nucleic acids.(1990) Int.J.Radiat.Biol.58，215-234
非專利文件31:Copper (I)-Catalyzed Regioselective “Ligation” of Azidesand Terminal Alkynes.(2002) Ang.Chem.1nt.Ed.41，2596-2599發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題
當(dāng)采用前述現(xiàn)有的熒光試劑對核酸染色時，要求將液態(tài)試劑與樣品混合，從而操作變得復(fù)雜。尤其是，用于在微觀尺度流路內(nèi)進行核酸染色和檢測的芯片實驗室中，芯片的生產(chǎn)、儲存及使用變得非常復(fù)雜。
本技術(shù)的一個主要目的是提供一種簡便地檢測核酸的方法，無需復(fù)雜的操作，例如在微觀尺度流路內(nèi)混合液體和清洗。
解決問題的手段
為了解決上述問題，本技術(shù)提供一種檢測核酸的方法，包括步驟:使含核酸的樣品與銅接觸，并且檢測從樣品發(fā)射的熒光。根據(jù)這種檢測核酸的方法，僅僅通過使含核酸的樣品與銅接觸，就能簡便檢測出源于核酸與銅的復(fù)合物的熒光。此外，基于檢測到的熒光強度和/或熒光光譜，可提供關(guān)于樣品中所含核酸的濃度、分布或形狀的信息。
尤其是，源于核酸與銅的復(fù)合物的熒光強度和/或熒光光譜依賴于核酸的堿基序列和長度，以及在雙鏈核酸中錯配存在與否而改變。因此，這種檢測核酸的方法可基于在檢測步驟中檢測到的熒光強度和/或熒光光譜來分析核酸的堿基序列和核酸的雙鏈中的錯配。
另外，尿嘧啶中的源于核酸與銅的復(fù)合物的熒光比胞嘧啶中的高。因此，借助這種核酸檢測方法，通過硫酸氫鹽處理，使樣品中包含的非甲基化的胞嘧啶選擇性地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并且確定在檢測步驟中檢測到的熒光的強度和/或光譜的變化量，由此分析在核酸中胞嘧啶的甲基化或脫甲基化存在與否及其量，在堿基序列中甲基化胞嘧啶或脫甲基化胞嘧啶的位置等。
在該核酸的檢測方法中，銅可以是固體的。
在改核酸的檢測方法中，接觸步驟優(yōu)選在鹽的共存下，通過使含核酸的樣品與銅接觸而實施。而且，接觸步驟優(yōu)選通過用波長為300 y m 420 u m的光照射樣品以檢測從樣品中發(fā)射的熒光而實施。
本發(fā)明技術(shù)提供一種樣品的光學(xué)觀察方法，包括以下步驟:使含核酸的樣品與銅接觸，并且檢測從樣品發(fā)射的熒光。
在光學(xué)觀察方法中，樣品可以是細(xì)胞。在這種情況下，可提供關(guān)于細(xì)胞的細(xì)胞核的分布、位置、數(shù)量、大小、形狀等信息。
此外，本技術(shù)提 供包括含銅和核酸的復(fù)合物的熒光物質(zhì)。通過適當(dāng)改變復(fù)合物中的核酸的堿基序列和長度，可提供各種具有不同光譜或強度的熒光物質(zhì)。
根據(jù)本技術(shù)，“核酸”包括天然核酸(DNA和RNA)。“核酸”廣泛包括由人為改變天然核酸中核糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)或磷酸二酯鍵(phosphodiester linkage)的化學(xué)結(jié)構(gòu)而提供的人工合成的核酸。人工合成核酸的非限制性實施例包括肽核酸(RNA)、硫代磷酸酯型低聚核苷酸(S-oligos)、橋接核酸(BNA)、鎖核酸(LNA)等。
發(fā)明效果
本技術(shù)提供一種核酸的簡便檢測方法，無需諸如在微觀尺度流路內(nèi)混合液體和清洗的復(fù)雜操作。


[圖1]各個曲線圖代替附圖并示出在S.A.濃度為50mM的條件下通過使ssDNA與不同濃度的CuS04相接觸而獲得的熒光光譜和RFU值。(A)示出了熒光光譜，(B)示出了RFU峰值(實施例1)。
[圖2]各個曲線圖代替附圖并示出在S.A.濃度為50mM的條件下通過使ssDNA與不同濃度的CuS04相接觸而獲得的熒光光譜和RFU值。(A)示出了熒光光譜，(B)示出了RFU峰值(實施例1)。
[圖3]各個曲線圖代替附圖并示出在S.A.濃度為4mM的條件下通過使低聚DNA與濃度為0.4mM的CuS04相接觸而獲得的熒光光譜和RFU值(實施例1)。
[圖4]各個曲線圖代替附圖并示出在S.A.濃度為4mM的條件下通過使低聚DNA與濃度為0.4mM的CuS04相接觸而獲得的熒光光譜和RFU值(實施例1)。
[圖5]各個曲線圖代替附圖并示出在CuS04濃度為0.4mM和S.A.濃度為4mM的條件下在低聚DNA (oligo-DNA)T (20)、T (6)和T (3)獲得的熒光光譜和吸收光譜隨時間的變化(實施例1)。上面的各個圖示出了以RFU值(絕對值)為縱坐標(biāo)的熒光光譜，中間的各個圖示出了以RFU值(相對值)為縱坐標(biāo)的熒光光譜，并且下面的各個圖示出了吸收光-1'TfeP曰。
[圖6]各個曲線圖代替附圖并示出在CuS04濃度0.4mM和S.A.濃度為4mM的條件下在低聚DNA T (20),T (6)和T (3)獲得的熒光光譜和吸收光譜隨時間的變化(實施例1)。(A)示出了 RFU峰值隨時間的變化，(B)示出了波長為346nm時隨時間的變化。
[圖7]各個曲線圖代替附圖并示出在低聚DNAT (20),T (6)和T (3)獲得的二維熒光光譜。
[圖8]曲線圖代替附圖并示出在低聚DNAT (20),T (6)和T (3)獲得的激發(fā)光譜(虛線)和熒光光譜(實線)(實施例1)。
[圖9]各個曲線圖代替附圖并示出在包括腺嘌呤和胸腺嘧啶組成的三個堿基長度序列的低聚DNA獲得的熒光光譜。
[圖10]各個曲線圖代替附圖并示出在包括腺嘌呤和胸腺嘧啶組成的三個堿基長度序列的低聚DNA獲得的熒光光譜的最高RFU值(A)及最大FRU波長(B)(實施例1)。
[圖11]各個曲線圖代替附圖并示出從包括序列號為SEQID NO:19和20的低聚DNA中獲得的熒光光譜(實施例1)。
[圖12]曲線圖代替附圖并示出通過使含ssDNA的樣品與固體銅接觸而獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖13]曲線圖代替附圖并示出通過使含ssDNA的樣品與具有不同濃度的固態(tài)銅接觸而獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖14]各個曲線圖代替附圖并示出通過使含ssDNA的樣品與含不同類型或濃度的鹽的反應(yīng)溶液接觸而獲得的熒光光譜(實施例2 )。
[圖15]各個曲線圖代替附圖并示出通過使含不同濃度的ssDNA(A)或RNA (B)的樣品與固體銅接觸而獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖16]各個曲線圖代替附圖并示出通過使含具有不同序列的低聚DNA的樣品與固體銅接觸而獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖17]各個曲線圖代替附圖并示出通過使含具有不同序列的低聚DNA的樣品與固體銅接觸而獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖18]各個曲線圖代替附圖并示出通過使含具有不同序列的低聚DNA的樣品與固體銅接觸而獲得的激發(fā)-熒光光譜(實施例2)。
[圖19]曲線圖代替附圖并示出在具有8-堿基胞嘧啶和12-堿基胸腺嘧啶的組合序列的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖20]各個曲線圖代替附圖并示出在含錯配的雙鏈DNA獲得的熒光光譜(實施例2)。
[圖21]各個曲線圖代替附圖并示出通過改變反應(yīng)溶液的緩沖液類型和pH值而獲得的RFU值(實施例2)。
[圖22]各個照片代表附圖并示出使濺射在玻璃表面上的銅與ssDNA接觸而獲得的熒光圖像(實施例3)。
[圖23]各個照片代表附圖并示出使濺射在玻璃表面上的銅與RNA接觸而獲得的熒光圖像(實施例3)。
[圖24]曲線圖代替附圖并示出使濺射在玻璃表面上的銅或銀與包括DNA或RNA的樣品接觸而獲得的熒光強度(實施例3)。
[圖25]曲線圖代替附圖并示出使濺射在玻璃表面上的銅與ssDNA接觸而獲得的熒光強度隨時間的變化(實施例3 )。
[圖26]曲線圖代替附圖并示出使濺射在玻璃表面上的銅與ssDNA接觸后，當(dāng)溫度變化時，熒光強度的變化(實施例3 )。
[圖27]各個照片代表附圖并示出在濺射有銅的玻璃上的洋蔥薄皮的熒光觀察結(jié)果(實施例4)。
[圖28]各個照片代表附圖并示出在濺射有銅的玻璃上的人類白細(xì)胞樣品的熒光觀察結(jié)果(實施例4)。
[圖29]各個照片代表附圖并示出在濺射有銅的玻璃上的Jurkat細(xì)胞的熒光觀察結(jié)果(實施例4)。
[圖30]各個照片代表附圖并示出在濺射有銅的玻璃上的Jurkat細(xì)胞的熒光觀察結(jié)果(實施例4)。
[圖31]各個曲線圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(20)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖32]各個曲線圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(10)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖33]各個曲線圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(6)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖34]各個曲線圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(5)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖35]各個曲線 圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(4)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖36]各個曲線圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(3)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施方式5)。
[圖37]各個曲線圖代替附圖并示出在具有不同濃度T(2)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖38]各個曲線圖代替附圖并示出在包含不同胸腺嘧啶堿基數(shù)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例5)。
[圖39]各個曲線圖代替附圖并示出包含不同胸腺嘧啶堿基數(shù)的低聚DNA的濃度與熒光強度的最高值之間的相互關(guān)系(實施例5)。
[圖40]各個曲線圖代替附圖并示出在具有包括T和C的堿基序列的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例6)。
[圖41]各個曲線圖代替附圖并示出在具有包括T和C的堿基序列的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例6)。
[圖42]曲線圖代替附圖并示出在具有T(10)的低聚DNA以及具有用淬滅劑改性的T (10)的低聚DNA的熒光光譜(實施例7)。
[圖43]各個曲線圖代替附圖并示出在具有T(10)和U (9)G的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例8)。
[圖44]曲線圖代替附圖并示出在具有T(10)、C (10)和C (4) MeC (6)的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例8)。
[圖45]曲線圖代替附圖并示出在具有T(10)、A (10)和I (9) G的低聚DNA獲得的熒光光譜(實施例8)。
具體實施方式
下文中，將參照附圖對根據(jù)本技術(shù)的實施例進行描述。以下描述的實施方式只是用于示例性說明，而且僅描述本技術(shù)的典型實施方式，而不應(yīng)解釋為限制本技術(shù)的范圍。實施方式將按下列順序描述。
<A>核酸的檢測方法
1、接觸步驟
(I)銅(Cu)
(2)樣品
(3)反應(yīng)溶液
(4)接觸條件
2、檢測步驟
(I)光線照射
(2)熒光檢測
(3)熒光光譜的檢測
(4)熒光空間分布的檢測
3、堿基序列分析
4、 應(yīng)用
(I)檢測微細(xì)基因序列的差異
(2 )分析DNA分子的甲基化
(3)細(xì)胞核的觀察和測量
(4)微細(xì)顆粒分析
(5)應(yīng)用至芯片實驗室
〈B〉熒光顏料
<A>核酸的檢測方法
發(fā)明者最新發(fā)現(xiàn)了核酸(DNA或RNA)與銅的復(fù)合物發(fā)射熒光，如以下實施例中詳細(xì)描述的。還發(fā)現(xiàn)熒光光譜和熒光強度取決于核酸的堿基序列和長度而改變，并且熒光光譜和熒光強度取決于在雙鏈核酸中錯配存在與否而改變。本技術(shù)由此新發(fā)現(xiàn)而獲得。如上所述，以往公認(rèn)的是DNA的吸收光譜通過與銅的相互作用而改變，并且吸收光譜的改變?nèi)Q于DNA的堿基序列。然而，過去不知道核酸與銅的復(fù)合物發(fā)射熒光。由復(fù)合物發(fā)射的熒光具有與上述的由Cu-MT發(fā)射的熒光相似的波長特征，但是是在采用純化的合成低聚核苷酸、不含金屬硫因(metallothionein)的反應(yīng)體系中觀察到的,這與由Cu-MT所發(fā)射的突光是完全不同的。在下文中，將對按照本技術(shù)的核酸檢測方法、其應(yīng)用及依照本技術(shù)的熒光物質(zhì)進行具體說明。
根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法包括以下步驟:使含核酸的樣品與銅接觸，并且檢測由樣品發(fā)射的熒光。在根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法中，根據(jù)目的，基于檢測步驟中檢測到的熒光強度和/或光譜，可分析核酸的堿基序列，并且可分析形成核酸的雙鏈中的錯配。
1、接觸步驟
在接觸步驟中，將含核酸的樣品與銅相接觸。
(I)銅(Cu)
在此步驟中使用的銅的形態(tài)最好是含銅的溶液或含銅的固體物質(zhì)。在要求操作簡便的情況下，優(yōu)選使用固體物質(zhì)。在檢測放置在微芯片中的微觀尺度流路內(nèi)的核酸時，固體物質(zhì)的使用可讓銅并入微芯片中，從而更好地形成簡化的芯片結(jié)構(gòu)。而且，與溶液相比，固體物質(zhì)具有對震動、沖擊、熱、光、時間等穩(wěn)定的形狀或性能。另一方面，當(dāng)需要縮短反應(yīng)時間時，溶液可能更適合。銅的形 態(tài)可依據(jù)目的而恰當(dāng)?shù)剡x擇。
當(dāng)使用銅溶液時，溶液優(yōu)選包含足量的銅(I )離子。通常，二價的銅陽離子是穩(wěn)定的，一價的銅陽離子不如二價銅陽離子穩(wěn)定?；谶@個原因，優(yōu)選將能使銅(II)離子還原為銅(I )離子的還原劑與以CuSO4溶液為例的含二價銅陽離子的溶液混合?？箟难徕c可用作還原劑。
為溶液中供應(yīng)足量銅(I )離子另一方法是用放射線照射含銅(II)離子的溶液，以產(chǎn)生銅(I )離子(參照非專利文件30)?；蛘?，期望在無氧條件下，將例如Cul、CuOTf C6H6和[Cu(NCCH3)4] [PF6]的鹽溶解于含乙腈和含氮堿(nitrogen base)的等價物(2，6-二甲基吡啶、三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶等)的溶液中來提供銅(I )離子溶液(參照非專利文件31)。
當(dāng)使用固態(tài)銅(固體銅)時，除純銅外，還可使用含銅合金。銅的形狀的非限制性實例包括粉末、細(xì)顆粒、棒、絲、板和箔。還可以在將引入樣品的微芯片的基板或容器的表面(內(nèi)表面)上形成含銅的薄膜。
優(yōu)選的是固體銅具有一定形狀并被放置為使得在如稍后所述的檢測步驟中檢測到的光不被阻斷，不被反射等。例如，固體銅可放置在基板或容器內(nèi)或特定區(qū)域。固體銅可足夠薄以透過足量的檢測用光?？梢耘渲脼楣腆w銅與樣品接觸的位置與測量從樣品發(fā)射的熒光的位置分開，并且還提供能將樣品在兩個位置之間運送的樣品運送裝置。在此，測量從樣品發(fā)射的熒光的位置是指通過用光線照射樣品而測量樣品發(fā)射的熒光的位置。
與樣品接觸的銅的量沒有特別限定，只要在檢測步驟中能從樣品檢測到熒光即可。當(dāng)使用固體銅時，含銅的固體物質(zhì)的量依據(jù)樣品與固體物質(zhì)接觸的面積、該面積相對樣品體積的比例、保持樣品的容器的形狀、固體物質(zhì)中所含銅的濃度、除了銅之外的污染物的類型或量等而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如，當(dāng)使用實施例中使用的銅粉時，銅粉的量優(yōu)選每毫升樣品37.5mg或更多。同樣，例如，當(dāng)固體銅薄膜在基板或容器的表面(內(nèi)表面)上形成，并且樣品被保持在夾在兩玻璃板之間、深度大約為20微米的空間內(nèi)時(參見實施例)，至少在空間表面濺射厚度為20nm以上的銅。
(2)樣品
作為含核酸的樣品，可以使用能夠含有諸如DNA和RNA的核酸的任何樣品。例如，可以是核酸提取液、含核酸化合物的溶液、諸如PCR的核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物、電泳樣品等。此外，不只是核酸溶液 樣品，還有細(xì)胞本身、包括細(xì)胞的組織切片等都可以作為樣品使用。
(3)反應(yīng)溶液
樣品優(yōu)選與銅在含鹽的反應(yīng)溶液中接觸。只要不喪失本技術(shù)的優(yōu)點，鹽的類型沒有特別的限制，可自由選擇使用已知的鹽。例如，可自由選擇使用氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)等中的一種或多種鹽(參見實施例)。
鹽的濃度沒有特別的限制，只要不喪失本技術(shù)的優(yōu)點，可自由設(shè)定。優(yōu)選地，鹽的濃度設(shè)定為0.025M或更高(參見實施例)。
優(yōu)選地，反應(yīng)溶液不含使銅(II)離子穩(wěn)定的螯合劑(例如EDTA、Tris等)等成分。
(4)接觸條件
樣品與銅的接觸時間沒有特別的限制，可取決于所使用的樣品或銅的形態(tài)而自由地設(shè)定。例如，當(dāng)使用液體樣品和銅粉時，他們被攪拌充分，因而可減少接觸時間。當(dāng)使用具有含銅的固體物質(zhì)的薄膜的基板或容器時，通過改變基板或容器的結(jié)構(gòu)來提高樣品與銅的接觸面積，從而減少接觸時間。此外，當(dāng)樣品與銅接觸時，反應(yīng)溶液和含氧空氣的接觸面積和接觸時間優(yōu)選限定為盡可能小或短。
2、檢測步驟
在檢測步驟中，檢測從接觸步驟之后的樣品發(fā)射的熒光。
(I)光照射
在含核酸的樣品與銅接觸后，只要可檢測到從樣品發(fā)射的熒光，對于為了檢測來自樣品的熒光而照射到樣品的光(激發(fā)光)沒有特別的限制。
例如，汞燈、鹵素?zé)?、氙燈、激光、LED、日光等可作為激發(fā)光的光源使用。還可以在光源和樣品之間放置波長選擇裝置，用于選擇理想波長。在這種情況下，波長選擇裝置包括濾光器、棱鏡、光柵鏡等?；蛘?，只要從樣品發(fā)射的熒光可被檢測到，從相鄰分子的諸如FRET和BRET的能量轉(zhuǎn)移可用光照射取代。
為從樣品中有效產(chǎn)生突光，激發(fā)光包括優(yōu)選具有約為300 μ m 420 μ m波長的光，更優(yōu)選具有約為330μπι 380μπι波長的光。此外，在激發(fā)光中，優(yōu)選波長約為420 μ m的光的強度足夠低，并且更優(yōu)選波長約為500nm以上的光的強度足夠低，以使其不妨礙熒光的檢測。
優(yōu)選地，激發(fā)光的強度要足夠高以檢測從樣品發(fā)射的熒光。優(yōu)選檢測用光的強度根據(jù)以下因素適當(dāng)設(shè)置:照射光的波長范圍；要檢測的核酸的大小、堿基序列、高級結(jié)構(gòu)(higher order structure)、數(shù)量及濃度；要獲取的信號數(shù)量；要檢測的光的波長范圍；檢測器的靈敏度、類型及構(gòu)造等。為調(diào)節(jié)激發(fā)光的強度，可適當(dāng)調(diào)節(jié)例如光源類型、從光源發(fā)出的光的強度、棱鏡等聚光裝置的構(gòu)造、波長選擇裝置的類型和構(gòu)造、包括ND濾波器及光圈等光強度調(diào)節(jié)裝置的照射光用光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)造、照射用光的密度、照射范圍和照射時間。
光纖和鏡子等光傳播裝置可放置在激發(fā)光的光源和樣品之間。在光照射過程中使用的保持樣品的容器沒有特別的限制，但優(yōu)選具有能透過足量的照射光和要檢測的熒光的材料和結(jié)構(gòu)。
(2)熒光的檢測
從樣品中發(fā)射的熒光可由任何非限制性的裝置檢測，例如過去公知的手段。作為檢測手段，可使用例如光檢 測器、光電二極管、光電倍增器、CCD攝像機及CMOS攝像機等用于將光信號轉(zhuǎn)換為電信號的元件?；蛘?，作為檢測手段，可以采用拍攝為膠卷或用肉眼的觀察。可以通過對與樣品相鄰的熒光分子誘發(fā)FRET等的能量轉(zhuǎn)移，并接收從熒光分子發(fā)射的熒光來間接地檢測從樣品發(fā)射的熒光。
為了高效檢測從樣品發(fā)射的熒光，優(yōu)選將棱鏡等集光裝置放置在樣品和檢測手段之間。例如光纖和鏡子等光傳輸裝置可放置在樣品和檢測手段之間。
可以在與光照射處于同一側(cè)或不同側(cè)的樣品上檢測熒光。尤其是，當(dāng)在與光照射的同一側(cè)檢測熒光時，以不同方向放置鏡面等光反射裝置，從而提高從樣品發(fā)射的熒光的收集效率。即使當(dāng)在光照射的不同側(cè)檢測熒光時，也可以放置具有不阻礙光檢測的構(gòu)造的光反射裝置，或可放置例如以下光反射裝置:可透過具有照射波長的光且反射要檢測的光的、具有波長選擇性的雙色鏡。
當(dāng)檢測從樣品發(fā)射的熒光時，可能有要檢測的光之外的光，包括照射到樣品的光的散射光、來自樣品或保持樣品的容器的自發(fā)熒光、及來自外界的漏光。在這種情況下，優(yōu)選在樣品和光檢測手段之間放置光選擇裝置，以使要檢測的光之外的光不能到達檢測手段。
光選擇裝置的實例包括濾光器、棱鏡、光柵鏡等。而且，可預(yù)先處理引入樣品的基板和容器的外表面或內(nèi)表面中的熒光檢測時光透過的區(qū)域，從而只透過期望波長的光，而對光照射沒有任何影響。
基于如下文所述的實施例中的結(jié)果，優(yōu)選光選擇裝置能夠只檢測波長約為420nm以上的熒光，更優(yōu)選只檢測波長約為500nm以上的熒光。此外，為了將自發(fā)熒光的影響減到盡可能最小，如必要，只檢測波長約為600nm以上的光。在根據(jù)本技術(shù)的檢測核酸方法中，對于約360nm的紫外光激發(fā)波長，提供具有約600nm中心波長等的相對長的波長并且具有長的行程偏移(stroke shift)的熒光。因此，根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法具有散射光或其他物質(zhì)發(fā)射的自發(fā)熒光對目標(biāo)熒光的檢測影響較小的優(yōu)勢。
作為另一光選擇手段，利用熒光壽命隨分子不同而不同的性能，適當(dāng)設(shè)定在光照射之后檢測熒光的時間，盡可能排除要檢測的光之外的光，并且檢測必需的熒光。
(3)熒光光譜檢測
采用在光照射和熒光檢測中適用于光譜測量的裝置，測定從樣品發(fā)射的熒光光譜(激發(fā)光譜或發(fā)射光譜)。
利用如濾光器、棱鏡、光柵鏡等光選擇裝置，通過在空間上或時間上改變照射到樣品的光的波長以測量要檢測的熒光強度的空間或時間變化，可測量激發(fā)光譜。通過在空間上或時間上改變照射到樣品的光的波長，以及通過將光引入到檢測手段中，以測量要檢測的熒光強度的空間或時間變化，可測量發(fā)射(熒光)光譜。通過將二者結(jié)合，可被測量激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩者。
用于在空間上改變照射到樣品的光或從樣品發(fā)射的熒光的波長的波長選擇裝置的具體實例有棱鏡和光柵鏡等根據(jù)波長來改變光傳播方向的光學(xué)器件。
用于在時間上改變照射到樣品的光或從樣品發(fā)射的熒光的波長的波長選擇裝置的具體實例包括:更換不同類型的濾光器，以及通過能控制透過光的波長的濾光器改變透過光的波長?；蛘?，可放置棱鏡和光柵鏡等根據(jù)波長改變光傳播方向的光學(xué)器件，以及能只選擇透過光學(xué)器件的光中的沿特定方向傳播的光的方向選擇裝置。光學(xué)器件和/或光的方向選擇裝置的位置或構(gòu)造可以隨時間控制及改變。這些裝置可以是電控的，以隨時間改變例如使用計算機自動選擇的光的波長。光的方向選擇裝置可通過將如狹縫、透鏡、鏡子和光纖的光學(xué)器件適當(dāng)?shù)亟M合來配置。
利用波長選擇裝置，通過時間上改變光的波長的激發(fā)光譜和/或發(fā)射光譜的檢測方法，優(yōu)選包括:運用計算機控制由波長選擇裝置選擇的光的波長；利用光探測器等的能將光信號轉(zhuǎn)換為電信號的裝置作為光檢測手段，將測量結(jié)果讀入計算機；并且相互關(guān)聯(lián)地記錄照射光的波長和測量出的熒光強度。
在利用波長選擇裝置通過空間上改變光的波長而檢測激發(fā)光譜和/或發(fā)射光譜的方法中，作為光檢測手段，接收光的元件以一維陣列排列，或?qū)⒔邮展獾脑?如CCD和CMOS)布置在一個平面上。
(4)突光空間分布的檢測
為獲得關(guān)于樣品中所含的核酸的空間分布和形狀的信息，一次性地提供空間信息的一種方式可以是，對核酸擴散到一定程度的區(qū)域同時進行光的照射和熒光檢測?；蛘撸峁┛臻g信息的另一種方式可以是隨時間改變檢測的位點，并依次掃描核酸在一定程度上擴散的區(qū)域的內(nèi)部。
在前一種情況下，優(yōu)選用光照射整個檢測區(qū)域，并且更優(yōu)選照射整個區(qū)域的光的強度是均勻的。作光檢測手段，可以利用膠卷或肉眼觀察。而且，可使用包括二維布置的用于將光信號轉(zhuǎn)化為電信號的光接收元件的光檢測手段，例如CCD攝像機和CMOS攝像機。
后一種情況的一個實例是使用激光進行照射，利用電流鏡等隨時間改變激光的照射位置，檢測從激光的照射位置發(fā)射的熒光，并從將激光的照射位置與檢測出的熒光強度關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)中獲得熒光的空間分布。在這種情況下，優(yōu)選通過利用電流鏡控制光照射位置、由計算機記錄光照射位置、并在計算機內(nèi)構(gòu)建將檢測出的熒光強度與當(dāng)時的光照射位置關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)，從而自動分析熒光強度的空間分布。
獲得關(guān)于空間分布的信息的另一方式是采用線性地光照射的光源和包括一維放置的光接收元件(如線性傳感器)的光檢測手段來測量熒光的一維分布，并順序地移動其位置?；蛘?，通過使用諸如CCD攝像機和CMOS攝像機的能一次性地獲得熒光強度的空間分布的光接收元件并且順序地移動要觀察的空間區(qū)域，能獲得更寬區(qū)域的熒光強度的空間分布。在這些情況下，還期望適當(dāng)?shù)厥褂糜嬎銠C來控制檢測區(qū)域并記錄熒光檢測結(jié)果，并基于這些信息自動分析突光強度的空間分布。
3、堿基序列分析
接下來，將描述基于在檢測步驟中檢測的熒光的信息分析核酸的堿基序列以及形成核酸的雙鏈中的錯配的方法。
關(guān)于熒光的信息的具體例子包括熒光強度和/或光譜(激發(fā)光譜或發(fā)射光譜)、熒光壽命、熒光的空間分布和時間變化。這些信息可被轉(zhuǎn)化為數(shù)字，記錄在計算機上或在計算機上運算以供分析。
在檢測方法中獲得的熒光強度取決于反應(yīng)條件、光學(xué)系統(tǒng)和核酸的濃度、類型、大小、高級結(jié)構(gòu)和堿基序列(參見實施例)。尤其是，當(dāng)反應(yīng)條件、整個光學(xué)系統(tǒng)、核酸的類型、大小、高級結(jié)構(gòu)和堿基序列不變時，關(guān)于核酸的濃度的信息可通過熒光強度的測量結(jié)果提供。在這種情況下，分析方法包括以下步驟:提供關(guān)于要檢測的核酸的已知濃度和熒光強度之間的關(guān)系的信息、測量期望的兩個或更多濃度的核酸的熒光強度、建立校正曲線、將由檢測提供的熒光強度應(yīng)用到濃度與強度之間的關(guān)系中，并計算核酸的濃度。這一方法也可通過提前記錄核酸濃度與熒光強度之間的關(guān)系，并在計算機上從熒光強度計算出核酸濃度而自動執(zhí)行。
此外，特別地，只要濃度、反應(yīng)條件和高級結(jié)構(gòu)不變，在檢測步驟中獲得的光譜和熒光強度取決于核酸的堿基序列和高級結(jié)構(gòu)(參見實施例)?！案呒壗Y(jié)構(gòu)”在這里是指核酸的單鏈結(jié)構(gòu)或雙鏈結(jié)構(gòu)，并涉及由雜交引起的雙鏈形成或無雙鏈形成及其位點，以及在雙鏈中的錯配或無錯配及其位點。這些特性可用于由熒光光譜和強度的測試結(jié)果提供關(guān)于核酸的堿基序列和高級結(jié)構(gòu)的信息。更具體地，當(dāng)已知樣品中包含的核酸的序列和高級結(jié)構(gòu)為已知的有限數(shù)目的候選中的任意一個，可通過提前測量每一個候選的熒光光譜和強度，并與測量結(jié)果比較而估計出熒光檢測的樣品中包含的核酸的序列和高級結(jié)構(gòu)。比較兩個或更多的光譜的方法包括計算特征值，例如最大激發(fā)波長和熒光強度、在兩個或更多波長區(qū)域中的熒光強度的比率，并比較它們。此外，可計算出用于比較的兩個光譜之間的差異，以量化相似度?；蛘?，當(dāng)只通過關(guān)注其形狀來比較光譜時，可通過校正所測光譜的最大強度為相同值(uniform value)來進行比較。此外，熒光強度乘以變量并利用最小二乘法，在兩個光譜之間的差異為最小處的變量值以及在該點的兩個光譜之間的差異的大小可被量化。通過提前在計算機上記錄核酸的序列和高級結(jié)構(gòu)與光譜和熒光強度之間的關(guān)系，并從所測量的光譜和熒光強度的信息在計算機上估計核酸的序列和高級結(jié)構(gòu)，這些操作可自動進行。
當(dāng)對在檢測步驟中獲得的熒光的空間分布和時間變化進行分析時，該該空間可被肉眼檢查、觀察該空間的特征、并定性分類?；蛘?，熒光圖像可被輸入到計算機中，并可通過圖像處理進行定量分析。作為圖像處理的實例之一，例如通過二進制編碼處理來提取發(fā)射熒光的區(qū)域，并可以計算出數(shù)值，如熒光強度在此區(qū)域的面積、輪廓線長度、圓形度、中心或重心位置、總和、平均值、均值、中值、分散性和標(biāo)準(zhǔn)偏差?；蛘?，圖案匹配(patternmatching)、學(xué)習(xí)算法等可應(yīng)用于具有特定形狀的區(qū)域的識別或應(yīng)用于形狀歸類。
4、應(yīng)用
通過將上述的接觸步驟和熒光步驟在必要時與堿基序列分析相結(jié)合，根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法可應(yīng)用于各種領(lǐng)域中。在下文中，將描述根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法的應(yīng)用。
(I)檢測微細(xì)的基因序列的差異
根據(jù)本技術(shù)，通過測量熒光光譜和/或強度，可以提供關(guān)于樣品中所含的核酸的堿基序列的信息。然而，當(dāng)樣品包含多種核酸時，檢測到的熒光光譜和/或強度被平均，有微細(xì)的基因序列之間的差異不能被識別的可能性。因此，在必要時，優(yōu)選如下文所述的將限定要檢測的核酸的范圍的多種方法進行組合。
微細(xì)基因序列之間的差異的實施例包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。已知分析核酸的堿基序列對于疾病診斷是非常有用的。眾所周知，通過分析SNPs可評估包括心臟病在內(nèi)的各種疾病的風(fēng)險。
限定待檢測核酸的范圍的一種方法的第一個實例包括從樣品中所含的核酸中僅取出含待分析序列的部分的方法。具體地，這種方法包括采用固定在基板或珠子上的探針DNA進行的雜交、電泳、采用核酸擴增技術(shù)用于放大待分析序列的PCR等。此外，限制酶反應(yīng)和連接反應(yīng)可與這些方法相結(jié)合。
第二個實例包括僅從樣品中所含的核酸的特定堿基中選擇性獲得信號的方法。具體地，利用了在本技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，即在不含互補鏈的胸腺嘧啶(T)序列中檢測到非常強的熒光。在此方法中，預(yù)先準(zhǔn)備了與在樣品所含的核酸中待檢測突變的位點被排除的序列雜交以形成雙鏈核酸的一個或多個探針核酸。探針核酸與要檢測基因序列中的突變的核酸雜交以提供樣品。在探針核酸中，當(dāng)產(chǎn)生突變時，例如序列中要分析的腺嘌呤(A)被其他堿基取代時，T將被置于與該位點對應(yīng)的探針的序列中。這樣，當(dāng)此位點的堿基被A以外的任何堿基取代，T的錯配 即產(chǎn)生，由此測量到強的熒光?；蛘撸?dāng)產(chǎn)生突變時，例如序列中要分析的T被其他堿基取代時，A之外的堿基將被置于與該位置對應(yīng)的探針的序列中。這樣，當(dāng)沒有突變時，從沒有形成雙鏈的T處測量到強的熒光。
探針核酸可由DNA、RNA、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)型低聚核酸、BNA (LNA)等構(gòu)成。
第三個實例包括在檢測步驟中限定要照射光或要檢測熒光的物理區(qū)域的方法。例如，近場光如瞬逝光被用于照射樣品，即光只照射在特別限定的特定區(qū)域。這種方法可與在特定位置保持或移動的核酸的手段(means，裝置)相結(jié)合。借助在特定位置保持或移動核酸的手段，核酸被固定在固體表面，通過如納米孔這樣的非常微細(xì)的流路，或在酶等蛋白質(zhì)中移動。
能量轉(zhuǎn)移，如FRET和BRET，可用作限定要照射光線或要檢測熒光的物理區(qū)域的其他方法。在光照射下，用于誘發(fā)FRET和BRET的分子被布置于毗鄰待檢測區(qū)域，自該分子的能量轉(zhuǎn)移被用于局部光照射。在熒光檢測中，用于通過從樣品中吸收熒光能量而誘發(fā)FRET的熒光分子被布置于毗鄰待檢測區(qū)域，檢測出從熒光分子中產(chǎn)生的熒光以用于局部熒光檢測。
(2) DNA分子的甲基化分析
已知在DNA分子中的胞嘧啶(C)在細(xì)胞內(nèi)的基因組中被甲基化。胞嘧啶(C)的甲基化存在與否可通過判定胞嘧啶(C)是否被尿嘧啶(U)取代而發(fā)現(xiàn)。換句話說，當(dāng)用硫酸氫鹽在適當(dāng)條件下處理核酸時，只有未甲基化的胞嘧啶(C)可被選擇性地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)。因此，當(dāng)檢測到尿嘧啶(U)時，可檢測出非甲基化胞嘧啶的存在。
在尿嘧啶和胸腺嘧啶中，來自核酸與銅的復(fù)合物的熒光很強，但在胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中檢測不到(參照實施例)。因此，通過硫酸氫鹽處理，將樣品中包含的非甲基化胞嘧啶選擇性地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并且確定樣品中檢測到的熒光強度和/或光譜的變化量，由此分析在核酸中胞嘧啶的甲基化或脫甲基化的存在與否以及其量。通過組合使用上述“微細(xì)基因序列的差異檢測”中說明的方法，在核酸的堿基序列中甲基化胞嘧啶或脫甲基化胞嘧啶的位置等可被詳盡地分析。
甲基化分析可 按以下步驟進行:首先，按照以往公知的技術(shù)，用硫酸氫鹽處理含核酸的樣品。然后，從硫酸氫鹽處理前的樣品和硫酸氫鹽處理后的樣品檢測熒光的強度和/或光譜。之后，比較從硫酸氫鹽處理前的樣品和硫酸氫鹽處理后的樣品中檢測出的熒光的強度和/或光譜。非甲基化胞嘧啶的量越多，由硫酸氫鹽處理而產(chǎn)生的尿嘧啶的量就越多。通過比較硫酸氫鹽處理前后的樣品的熒光，可提供關(guān)于在核酸中的胞嘧啶的甲基化或脫甲基化存在與否及其量的信息。
當(dāng)樣品中包含的核酸的堿基序列中包含大量的胸腺嘧啶時，胸腺嘧啶的熒光就變成噪聲，來自尿嘧啶的熒光的信號/噪聲比可能會減小。此外，通過硫酸氫鹽處理而轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的多個非甲基化胞嘧啶可能存在于核酸的堿基序列。在這種情況下，通過下列方法相結(jié)合，可有效分析在特定區(qū)域的核酸的堿基序列的甲基化。
首先，將在硫酸氫鹽處理后的樣品中包含的核酸在要分析甲基化的區(qū)域擴增或濃縮。具體地，使用PCR等核酸擴增發(fā)和利用核酸雜交反應(yīng)的核酸濃縮法。
其次，抑制從要分析甲基化的c區(qū)域之外的其他區(qū)域產(chǎn)生的熒光。來自核酸和銅的復(fù)合物的熒光在單鏈DNA內(nèi)的胸腺嘧啶中有很高的強度，而在雙鏈DNA內(nèi)的胸腺嘧啶中被顯著抑制(參照實施例)。因此，將具有分析以外區(qū)域的互補堿基序列的掩模(mask)用核酸鏈雜交，抑制來自分析以外的區(qū)域中的胸腺嘧啶的熒光，由此可以有效檢測來自待分析區(qū)域的熒光?；蛘撸鐒┛捎糜谝种茝姆治鲆酝獾膮^(qū)域產(chǎn)生的熒光。通過將猝滅劑放置于鄰近復(fù)合物的位置，來自核酸與銅的復(fù)合物的熒光可被抑制(參照實施例)。因此，通過將猝滅劑放置在分析以外的區(qū)域，能夠以高效率檢測來自待分析區(qū)域的熒光。
第三，只有待分析甲基化的區(qū)域被選擇性地激發(fā)，或只有來自此區(qū)域的熒光被選擇性地檢測。具體地，可激發(fā)核酸與銅的復(fù)合物以產(chǎn)生熒光的施主探針被布置于與待分析區(qū)域相鄰，并且通過FRET、BRET等的能量轉(zhuǎn)移被用于僅選擇性激發(fā)待分析區(qū)域。這樣，只有來自待分析區(qū)域的熒光可被檢測。或者，通過來自核酸與銅的復(fù)合物的熒光的能量轉(zhuǎn)移而激發(fā)、并且發(fā)射具有不同波長的熒光的受體探針可被布置于與待分析區(qū)域相鄰，而通過檢測由受體探針發(fā)出的熒光，可檢測來自待分析區(qū)域的熒光。如上所述的方法可以以任何組合應(yīng)用。
(3)細(xì)胞核的觀察和測量
根據(jù)本技術(shù)，核酸的檢測方法可應(yīng)用于包含有核細(xì)胞的樣品，以檢測核酸的空間分布。分析其分布和形狀以提供關(guān)于在組織切片或細(xì)胞中的細(xì)胞核的分布、位置、數(shù)量、大小、形狀等信息。
可從這些信息計算出有核細(xì)胞的數(shù)量。樣品被引入的容器的內(nèi)部形狀被適當(dāng)設(shè)計，以在恒定面積中保持恒定體積的樣品，這可用于測量樣品中包含的有核細(xì)胞的濃度。此夕卜，當(dāng)同時測定細(xì)胞核的形狀與數(shù)量時，可識別或計數(shù)包括不同形狀的細(xì)胞核的多個類型的細(xì)胞。例如，已知白細(xì)胞有根據(jù)顆粒狀白細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而不同的核形狀。根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法可用于識別或計數(shù)白細(xì)胞的種類。
作為導(dǎo)致瘧疾的寄生蟲的已知瘧原蟲的類型，已知熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、瘴癘瘧原蟲、卵形瘧原蟲等。此外，作為階段，已知環(huán)狀體(ring form)、營養(yǎng)體、裂殖體、配子母細(xì)胞。為了能適當(dāng)?shù)卦O(shè)計感染患者的治療方案，適當(dāng)識別這些類型是非常重要的。盡管有檢測基因或抗原的簡便方法，但是為了識別瘧原蟲的類型，通常，原則上通過姬姆薩染色來觀察核的形狀。然而，在此方法中，存在的問題是當(dāng)染色不充分時，可能導(dǎo)致診斷失誤。與此相反，一旦根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法被應(yīng)用于瘧原蟲類型的識別，不再需要常規(guī)染色劑。因此，瘧疾等可通過簡單染色而不需清洗的更簡便、可靠的方法診斷。
(4)微細(xì)顆粒的分析
當(dāng)檢測包含或固定在微細(xì)顆粒(例如包含在液體樣品中的細(xì)胞或珠子)中的核酸時，顆?？梢允庆o止的，或在微流路中流動。例如，將液體樣品連同鞘流一起引入流動池(flow cell)中，并被鞘流夾在中間以形成層流。由流過流動池的顆粒產(chǎn)生的突光可被檢測。流動池可具有任意作為流式細(xì)胞儀技術(shù)而被廣泛研究、開發(fā)及實際應(yīng)用的構(gòu)造。
(5)芯片實驗室中的應(yīng)用
根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法可被結(jié)合到芯片實驗室，用于處理或檢測微流路芯片等容器中的樣品。在這種情況下，根據(jù)使用目的，為了更方便，預(yù)處理樣品步驟被引入并組合在容器內(nèi)。
用于核酸的檢測和序列分析的樣品預(yù)處理步驟包括例如提取、分離和擴增核酸。更具體的實例包括利用電泳、凝膠過濾柱或吸收柱的分離、通過PCR反應(yīng)的擴增等。這些手段可通過已知技術(shù)結(jié)合到微芯片中。
或者，作為用于觀測、檢測和分析包含在細(xì)胞中的核的樣品預(yù)處理步驟，可選擇或濃縮特定細(xì)胞。作為選擇或濃縮特定細(xì)胞的步驟，可利用取決于細(xì)胞種類的不同特性(例如大小、比重、韌性、對特定物質(zhì)如抗體的結(jié)合力等。作為實例，對要觀察的細(xì)胞或不要被觀察的細(xì)胞有特異性結(jié)合的抗體被固定在容`器的內(nèi)表面或珠子上。通過利用對抗體的結(jié)合或不結(jié)合，可選擇或濃縮細(xì)胞。此外，準(zhǔn)備固定有抗體的磁性物質(zhì)的微細(xì)顆粒。利用磁性，可以只選擇吸附有磁性物質(zhì)的細(xì)胞或沒有吸附磁性物質(zhì)的細(xì)胞。此外，使樣品處于適當(dāng)變化的滲透壓、酸或堿中，借此可只將紅細(xì)胞破壞并去除，以只選擇白細(xì)胞。作為另一實例，例如，當(dāng)觀察人類血液中的瘧原蟲時，以往已知的是在被瘧原蟲感染的紅細(xì)胞中形成被稱為“瘧原蟲色素”的磁性物質(zhì)。該紅細(xì)胞可借助磁性被分離或濃縮。將這種方法與根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法相結(jié)合，可以簡便、可靠地觀察瘧原蟲。
〈B〉熒光顏料
接下來，將具體描述根據(jù)本技術(shù)的熒光物質(zhì)。
為了利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、基因擴增反應(yīng)、基因測序反應(yīng)、定量測定包括蛋白質(zhì)的生物分子、測定包括蛋白質(zhì)的生物分子之間的結(jié)合能力觀察和分析細(xì)胞、組織、生物分子，應(yīng)用具有各種顏色的發(fā)射熒光的顏料，如熒光素和藻紅蛋白。熒光顏料被用作工具，以提供關(guān)于顏料所結(jié)合的生物分子的局域化的信息，以及提供關(guān)于通過抗體或核酸探針(例如，通過將顏料結(jié)合在抗體或核酸探針上)識別的感興趣的分子的位置和量的信息。當(dāng)準(zhǔn)備具有不同顏色的若干顏料時，可分析更多的感興趣的分子。
應(yīng)用根據(jù)上文所述技術(shù)的核酸檢測方法技術(shù)，可生成具有多種光譜的熒光物質(zhì)。換句話說，核酸與銅的復(fù)合物根據(jù)核酸的堿基序列和長度而發(fā)射具有不同光譜或強度的熒光。通過利用核酸與銅的復(fù)合物的特性，復(fù)合物可被用作發(fā)射多種光譜的熒光物質(zhì)，例如，可被用作標(biāo)記抗體的熒光顏料。
本技術(shù)可具有以下配置:
(I) 一種包括以下步驟的核酸檢測方法:
使含核酸的樣品與銅接觸，且
檢測從樣品發(fā)射的熒光。
(2)根據(jù)上述(I)的檢測方法，其中，
基于在檢測步驟中檢測到的熒光的強度和/或光譜來分析核酸的堿基序列。
(3)根據(jù)上述(I)的檢測方法，其中
基于在檢測步驟中檢測到的熒光的強度和/或光譜，分析形成核酸的雙鏈中的錯配。
(4)根據(jù)上述(I)的檢測方法，包括以下步驟:
用硫酸氫鹽處理樣品，其中
基于在檢測步驟中，從硫酸氫鹽處理前的樣品檢測到的熒光的強度和/或光譜與從硫酸氫鹽處理后的樣品檢測到的熒光的強度和/或光譜之間的差異(difference，差)，分析核酸中的胞嘧啶的甲基化。
(5)根據(jù)上述(I)至(4)中的任一檢測方法，其中銅是固體銅。
(6)根據(jù)上述(I)至(5)中的任一檢測方法，其中接觸步驟是在鹽的共存下，使樣品與銅接觸的步驟。
( 7 )根據(jù)上述(I)至(6 )中的任一檢測方法，其中
檢測步驟是檢測通過用波長為300 μ m至420 μ m的光照射樣品而從樣品中發(fā)射的熒光的步驟。
實施例1
實施例1示出當(dāng)核酸與含用抗壞血酸還原Cu (II)離子而產(chǎn)生的Cu (I)離子的溶液混合后，在特定條件下 ，通過紫外光照射發(fā)射出橙色的熒光。
<材料和方法>
Cu =CuSO4溶液和(+ ) -L-抗壞血酸鈉(在下文中簡稱為“S.A.，，)是從Sigma-Aldrich公司購買的。
核酸:使用從BioDynamics laboratory Inc.(東京，日本)購買的超聲處理的鮭魚精子 DNA(Sonicated Salmon Sperm DNA)(在下文中簡稱為“ssDNA”)。此外，從 InvitrogenCorporation 購買的 Custom Oligo 被用作低聚-DNA。
緩沖液:從D0JIND0 Laboratories (熊本，日本)購買的HEPPSO依照由廠商提供的指南調(diào)節(jié)PH到8.5后使用。
突光光度計:使用NanoDrop3300 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham,MA, USA)或 F-4500 型突光分光光度計(Hitachi High-Technologies Corporation)。在NanoDrop3300中，使用紫外LED光源來提供激發(fā)光。測量由激發(fā)光激發(fā)的熒光光譜。采用配套軟件，獲得了熒光強度變?yōu)樽畲笾档牟ㄩL對應(yīng)的相對熒光單位數(shù)(RFU)，作為峰值RFU值。在F-4500型突光分光光度計中，使用了由Helix Biomedical Accessories, Inc.生產(chǎn)的石英毛細(xì)管和專用適配體細(xì)胞(dedicated adapter cell)。除非下文另有說明，否則使用的是 NanoDrop3300。
分光光度計=NanoDrop 1000分光光度計被用于測定吸收光譜。
樣品準(zhǔn)備和熒光測定:50mM的HEPPSO緩沖液與氯化鈉(250mM)、CuSO4 (OmM 4mM)、S.A.(4，50mM)、ssDNA (lmg/ml)或低聚 DNA (50，250，500 y M)混合以提供 20 y I 樣品。已知S.A.具有將溶液中的CuSO4K產(chǎn)生的Cu (II)離子還原為Cu (I)的作用(參照非專利文件31)。
< 結(jié)果 >
圖1和圖2各自示出在S.A.濃度為50mM的條件下，通過改變CuSO4的濃度而獲得的熒光光譜和RFU值；(A)示出了熒光光譜，(B)示出了峰值RFU值(peak RFU value)。
圖3和圖4各自示出在CuSO4濃度為0.4mM和S.A.濃度為4mM的條件下，獲得的熒光光譜。具有20、10、6和3的堿基長度的低聚DNA的濃度分別為50 uM,50u M、250 u M和500iiM。圖3示出具有序列編號(SEQ ID N0):1 6中所描述的堿基序列的低聚DNA的結(jié)果。橫軸表示波長，(A)中的縱軸表示每一波長對應(yīng)的RFU值，(B)中的縱軸表示用最大RFU值除各個波長下的RFU值而得到的值。圖4示出了具有序列編號2中描述的堿基序列的低聚DNA (在下文中描述為T (20))的結(jié)果(A)，具有序列編號10中描述的堿基序列的低聚DNA (在下文中描述為T (6))的結(jié)果(B)，具有序列編號:12中描述的堿基序列的低聚DNA (在下文中描述為T (3))的結(jié)果(C)，具有序列編號11中描述的堿基序列的低聚DNA(在下文中描述為T (3))的結(jié)果(D)。各自的橫軸表示波長，各自的縱軸表示各個波長下的RFU 值。
如圖所示，熒光光譜圖的圖案(pattern，模式)(峰值波長和強度)取決于核酸的堿基序列而改變。
接下來是，在CuSO4濃度0.4mM和S.A.濃度為4mM的條件下，測量在低聚DNA T(20)、T (6)和T (3)獲得的熒光光譜和吸收光譜隨時間的變化。在緊接第一次測量熒光光譜和吸收光譜之前，加 入S.A.。在8、14、24和35分鐘后，測量熒光光譜和吸收光譜。結(jié)果示于圖5和圖6中。在圖5中，上面的圖各自示出縱軸為RFU值(絕對值)的熒光光譜，中間的圖各自示出縱軸為RFU值(相對值)的熒光光譜，下面的圖各自示出吸收光譜。圖6示出峰值RFU值隨時間的變化(A)，并且示出波長為346nm時隨時間的變化(B)。
如圖所示，在所有低聚DNA T (20)、T (6)和T (3)中，30分鐘之后，熒光幾乎消失。尤其是，在堿基長度短的低聚DNA中，熒光迅速消失。35分鐘以后，測試熒光光譜。此后立即再加入1.8^1濃度為44!111的5.1溶液到樣品中以進行測量。能再次檢測出熒光。由此，熒光的消失可認(rèn)為是由于Cu (I)離子氧化為Cu (II)離子。在低聚DNA T (6)和T(3)各自的熒光光譜中，隨著峰值強度的減小，在短波長側(cè)觀察到新的峰。
另一方面，在各低聚DNA各自的吸收光譜中，觀察到峰值強度隨時間的降低。與熒光光譜相比，吸收光譜更緩慢地降低。
圖7 (A)至圖7 (C)示出由F-4500型熒光分光光度計檢測的從低聚DNA T (20)、T (6)和T (3)獲得的二維熒光光譜。圖8示出在各低聚DNA獲得的激發(fā)光譜(虛線)和熒光光譜(實線)。該光譜圖是以Inm的熒光波長間隔及2nm的激發(fā)波長間隔測量的。
如圖所示，證實了熒光光譜的圖案取決于低聚DNA的堿基長度而改變。也證實了激發(fā)光譜的圖案取決于堿基長度而改變。
為進一步考察堿基序列與光譜之間的關(guān)系，測量了各自具有由序列編號11和18描述的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)組合獲得的三堿基長度序列的低聚DNA的熒光。結(jié)果示于圖9和圖10中。在圖9中，(A)的縱軸表示由Nanodrop測試的各波長下的RFU值，(B)的縱軸表示用最大RFU值除各波長下的RFU值而得到的值。圖10示出RFU的最大值和峰值波長的三次測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
如圖所示，證實了熒光強度和峰值波長取決于低聚DNA的堿基序列而改變。
圖11示出在包括序列編號19和20描述的序列的低聚DNA獲得的測試結(jié)果。證實了盡管在具有序列編號20描述的序列的低聚DNA中的熒光強度弱，但是具有含尿嘧啶(U)的序列編號20描述的序列的低聚DNA發(fā)射的熒光與含胸腺嘧啶(T)的具有序列編號19描述的序列的低聚DNA發(fā)射的熒光具有相似的光譜形狀和峰位置。
< 討論 >
本實施例顯示，當(dāng)DNA與其中混有CuSO4和5.么.的含氯化鈉的HEPPSO緩沖溶液混合時，通過紫外光照射觀察到波長大約為500nm 700nm的橙色熒光。證實了熒光強度取決于CuSO4的濃度，且熒光強度和光譜都受核酸的堿基序列影響。
在至少包含胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)或尿嘧啶(U)的低聚DNA中觀察到熒光。在使用各具有包含胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的三個堿基長度的低聚DNA的試驗中，在任何序列中都觀察到熒光。此外，還顯示熒光強度和光譜不僅受胸腺嘧啶(T)或腺嘌呤(A)的量影響，還受在低聚DNA上的位置(序列順序)的影響。
在加入S.A.后，隨時間的延長，熒光強度隨時間而減小，但是由于S.A.的再加入而恢復(fù)。同時，Cu (I)離子在氧氣的存在下非常不穩(wěn)定，且一旦失去了 S.A.的還原作用，Cu (I)就轉(zhuǎn)變?yōu)镃u (II)或固體銅。由此，認(rèn)為熒光是源于Cu (I)離子與核酸的復(fù)合物。為了通過銅與核酸之間的相互作用檢測熒光，期望把反應(yīng)溶液與空氣中的氧的接觸減至最低。
實施例2
實施例2示出當(dāng)含核酸的溶液與固體銅接觸時，在一定條件下，通過紫外光照射發(fā)射出與實施例1中觀察到的熒光相似的橙色熒光。
〈材料和方法〉
銅粉(銅，粉末，-75ym，99.9%/Cat.N0.030-18352/由 Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.生產(chǎn),大阪，日本)被用作與核酸接觸的銅。
作為RNA，使用大鼠腦總 RNA (Rat Brain Total RNA) (Cat.N0.636622, TakaraBio Inc.，大津，日 本)，將其溶解于經(jīng)DEPC處理的水(Cat.N0.312-90201/ffako純化學(xué)工業(yè)有限公司，日本)。
PIPES、ACES、BES, TAPSO, HEPPSO, EPPS、TAPS、CAPS、TES、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)和OPSO是從D0JIND0 Laboratories (熊本，日本)購買的。其中的每個依照由廠商提供的指南調(diào)節(jié)PH值后使用。其他試劑與實施例1中的一樣。
通過將各種核酸、鹽和銅粉混合入總量為40毫升的溶液中，并攪拌15分鐘，從而使核酸與銅接觸。除非另有說明，否則銅粉的加入量為每毫升溶液375mg。除非另有說明，否則鹽或氯化鈉(NaCl)的量是500mM。
在將樣品離心以使銅粉沉降之后，測量上層清液的熒光光譜和強度。熒光光譜和強度的測量采用與實施例1中相似的步驟實施。
< 結(jié)果 >
對加入了 1.5mg/ml的ssDNA的反應(yīng)溶液測3次熒光。結(jié)果示于圖12中(橫軸:波長，縱軸:RFU)。如圖所示，當(dāng)含核酸的樣品與固體銅接觸、然后用紫外光激發(fā)時，可檢測到在大約600nm處具有峰的熒光。
接下來，通過基于ImL的反應(yīng)溶液加入數(shù)量分別為375mg、250mg、125mg、62.5mg、37.5mg、12.5mg和Omg的銅粉來配制反應(yīng)溶液。將1.5mg/ml的ssDNA加入反應(yīng)溶液中。測3次熒光。結(jié)果示于圖13中。如圖所示，熒光強度取決于銅粉的量。在本實施例中所使用的銅粉中，當(dāng)含量為37.5mg/ml或更多時，可觀察到明顯的熒光。另一方面，當(dāng)含量為12.5mg/ml或更少時，觀察不到明顯的熒光。
然后，改變反應(yīng)溶液中鹽的類型和濃度。將1.5mg/ml的ssDNA加入到反應(yīng)溶液中。比較測得的熒光強度。結(jié)果示于圖14中。(A)示出在加入0.5M、0.25M、0.1M、0.05M、0.025M和OM氯化鈉(NaCl)的反應(yīng)溶液中測得的熒光強度。(B)示出在加入0.45M氯化鈉(NaCl )、0.45M氯化鉀(KC1)、0.45M氯化鎂(MgCl2)和45%乙醇(EtOH)的反應(yīng)溶液中測得的熒光強度。熒光強度用604nm處的RFU表示，測3次。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差來示出。如圖所示，熒光強度取決于氯化鈉的量。另外，在氯化鉀和氯化鎂以及氯化鈉共存下檢測出熒光。
圖15示出當(dāng)加入到反應(yīng)溶液中的核酸濃度改變時，測得的熒光強度的比較結(jié)果。(A)7]\ 出在力口入 5mg/ml、2.5mg/ml、lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.lmg/ml>0.05mg/ml 和Omg/ml的ssDNA的反應(yīng)溶液中測得的熒光強度。(B)示出在加入2.5mg/ml、0.25mg/ml和Omg/ml的RNA的反應(yīng)溶液中測得的熒光 強度。橫軸表示核酸的濃度，縱軸表示在熒光波長為604nm處的RFU。測試進行3次。氯化鈉(NaCl)的濃度是0.25M，銅粉的量是200mg/ml。除非另有說明，否則在下面的實驗中使用該條件。如圖所示，熒光強度取決于DNA的濃度和RNA的濃度。
接下來，測量加入了 0.1mM具有序列編號:1、2、5、6和9描述的不同序列的低聚DNA的反應(yīng)溶液的熒光。結(jié)果示于圖16中。(A)圖的縱軸表示由Nanodrop測得的RFU值，(B)圖的縱軸表示當(dāng)峰高被設(shè)定為I時的相對RFU值。如圖所示，熒光強度和峰值波長受堿基序列影響。尤其是，可證實當(dāng)胸腺嘧啶(T)的百分比高時，熒光強度也高，且峰值波長變得更長。
還米用F-4500型突光分光光度計測試了具有序列編號:1、2、5和6描述的序列的低聚DNA的反應(yīng)溶液。圖17示出當(dāng)用360nm的激發(fā)光(狹縫寬度為IOnm)照射時，在400nm 700nm內(nèi)的熒光光譜(狹縫寬度為2.5nm)的結(jié)果。再次證實，在含胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的序列中，當(dāng)胸腺嘧啶(T)的百分比高時，熒光強度也高，且峰值波長變得更長。圖18示出通過掃描330nm 390nm (狹縫寬度為3nm)及400nm 700nm (狹縫寬度為2.5nm)的激發(fā)光來測量激發(fā)-熒光光譜的結(jié)果。(A)示出三維圖，而(B)示出等高線。EX軸表示激發(fā)波長(nm)，EM軸表示熒光波長(nm)，高度方向表示熒光強度?；谶@些結(jié)果，可了解到激發(fā)和熒光光譜及強度由于DNA的不同堿基序列而改變。
為了進一步考察堿基序列和光譜之間的關(guān)系，測量了各具有序列編號21和26描述的8個堿基的胞嘧啶(C)和12個堿基的胸腺嘧啶(T)的組合序列的低聚DNA的熒光。結(jié)果示于圖19中。如圖所示，當(dāng)序列不同時，即使DNA的堿基組成是相同的，熒光強度也不同。
接下來，測量了包括錯配的雙鏈DNA的熒光光譜的圖案。作為雙鏈DNA，使用以下三種類型:各具有序列編號I所示的序列的低聚DNA與各具有序列編號2所示的序列的低聚DNA的混合物((e)+(f))，各具有序列編號5所示的序列的低聚DNA與各具有序列編號2所示的序列的低聚DNA的混合物((d)+ (f))，各具有序列編號I所示的序列的低聚DNA與各具有序列編號6所示的序列的低聚DNA的混合物((e)+(c))。任何低聚DNA都以0.5mg/ml的最終濃度混合。結(jié)果示于圖20中。(A)的縱軸表示由Nanodrop測得的RFU值，(B)的縱軸表示當(dāng)峰高被設(shè)定為I時的相對RFU值。橫軸表示波長(nm)。如圖所示，雙鏈DNA中的熒光強度比單鏈DNA中的低。然而，在具有胸腺嘧啶(T)的錯配的雙鏈DNA中，證實有強的突光。
比較了當(dāng)緩沖液類型和反應(yīng)溶液中的pH值改變時測得的熒光強度。結(jié)果示于圖21中。(A)示出含ssDNA的樣品(+ )和不含核酸的樣品(-)在各個緩沖條件下的峰值RFU值的相對值。(B)示出在相同條 件下，含具有有序列編號I所示的序列的低聚DNA的樣品的峰值RFU值的相對值。(C)示出在相同條件下，含具有序列編號2所示的序列的低聚DNA的樣品的峰值RFU值的相對值。各緩沖液的濃度是50mM，ssDNA的最終濃度是0.5mg/ml，低聚DNA的最終濃度是25mM。峰值RFU值的相對值是指將在無緩沖的條件下測得的峰值RFU值設(shè)定為I。熒光強度取決于緩沖液的類型。當(dāng)在緩沖液中無核酸存在時幾乎不能檢測到熒光。
< 討論 >
基于本實施例中的結(jié)果，表明當(dāng)核酸與固體銅粉接觸時，在包括含鹽濃度的適當(dāng)條件下，與核酸與Cu (I)離子接觸的情況一樣，可檢測到熒光。似乎在銅離子和固體銅的各種情況中觀察到的熒光是以相同的機理提供的，因為它們的特性，如波長特性和序列依賴性，幾乎是相同的。另外，當(dāng)RNA被用作核酸時，也觀察到熒光。此外，在雙鏈DNA中，尤其是在胸腺嘧啶(T)中存在錯配時，觀察到強的熒光。這表明，與互補序列的結(jié)合可能抑制由核酸與銅結(jié)合導(dǎo)致的熒光物質(zhì)的生成。另外，認(rèn)為在錯配位點的熒光強度的增加可應(yīng)用于檢測在核酸的堿基序列中的變異的方法。
在用于比較各種緩沖條件下的熒光的實驗中，在PIPES、BES、HEPPSO、EPPS、TAPS、CAPS,TES和POPSO的緩沖液中觀察到熒光。尤其是，在PIPES、HEPPSO、EPPS和POPSO的緩沖液中，檢測到強的熒光。在7.0 10.5之間的pH范圍內(nèi)，可觀察到熒光。發(fā)現(xiàn)取決于緩沖液類型和PH值的熒光強度的變化呈現(xiàn)取決于核酸的堿基序列的不同圖案。另一方面，具有螯合及穩(wěn)定Cu (II)離子特性的緩沖液有觀察不到熒光的傾向。盡管在本實施例中沒有提供數(shù)據(jù)，但當(dāng)使用含例如Tris緩沖液、EDTA等的反應(yīng)溶液時，幾乎觀察不到熒光。
實施例3
在實施例3中，證實了在使核酸與濺射在玻璃表面的銅接觸后，可檢測到熒光，并且分析了熒光的特性。
<材料和方法>
作為DNA，使用實施例1中描述的ssDNA。作為RNA，使用實施例2中描述的RNA。
采用由ULVAC，Inc.(神奈川，東京)制造的裝有99.99%的Cu靶(Ko jundo ChemicalLaboratory C0.，Ltd.，埼玉，日本)的SH-350裝置在玻璃表面上濺射銅。在濺射中，設(shè)定厚度為40nm，基于預(yù)先測定的沉積速度，設(shè)定適當(dāng)?shù)臑R射時間。用于濺射銀的玻璃是由日本神奈川的 Kyodo International, Inc.生產(chǎn)的。
在濺射了銅或銀的玻璃載片或未處理的玻璃載片上，放置樣品溶液，在其上覆蓋間隙蓋玻片(gap cover glass) (24X25N0.4/#CG00024/Matsunami Glass Ind., Ltd ,大阪，日本)。在靜置大約5分鐘后，觀察熒光。倒置顯微鏡T1-U (Nikon C0.，東京，日本)用于觀察。濾波器組UV-1A (Ex:365/10，DM:400，BA:400/Nikon)用于獲取熒光。數(shù)字CCD攝像機Retiga2000R (Qlmaging, BC，加拿大)和20X物鏡用于捕獲和記錄圖像。
< 結(jié)果 >
圖22示出在含5mg/ml的DNA和0.5M的NaCl的樣品在濺射有銅的玻璃表面上靜置5分鐘后捕獲的圖像。圖23示出在含5mg/ml的RNA和0.5M的NaCl的樣品在濺射有銅的玻璃表面上靜置5分鐘后捕獲的圖像。
如圖22(A)所示，當(dāng)使用含DNA的樣品時，在整個捕獲圖像上觀察到平滑(smooth)的突光。另一方面，如圖23 (A)和(B)所不，當(dāng)使用含RNA的樣品時,在捕獲的圖像內(nèi)觀察到具有獨特的波狀圖案的熒光。RNA所特有的圖案的預(yù)計原因是單鏈RNA彼此雜交以生成高級結(jié)構(gòu)。
接下來，將在捕獲圖像內(nèi)的熒光強度轉(zhuǎn)化為數(shù)字。如圖22 (B)所示，每一個捕獲圖像被分為九個部分。九個部分中的一個(圖中的C)被設(shè)定為測量范圍。計算出在測量范圍內(nèi)的熒光強度的平均值。對于每個樣品，捕獲載片上的五個部分以計算每個圖像的平均值。將所得五個平均值進一步平均并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖24示出當(dāng)含DNA或RNA的樣品與濺射在玻 璃上的銅或銀接觸時，獲得的熒光強度。在圖 24 中，“ DNA/Cu ”、“ RNA/Cu ”、和 “(-)/Cu ” 表示含 5mg/ml 的 DNA 的樣品、含 5mg/ml的RNA的樣品及不含核酸的樣品；熒光強度是在濺射有銅的玻璃表面上測量的。此外，“DNA/Ag”、“RNA/Ag”、和 “(-) /Ag” 表示含 5mg/ml 的 DNA 的樣品、含 5mg/ml 的 RNA 的樣品及不含核酸的樣品；熒光強度是在濺射銀的玻璃表面上測量的。每個樣品含0.5M的NaCl。由于“DNA/Cu”中的熒光強度明顯高于其他樣品，它的曝光時間為I秒。除了 “DNA/Cu”以外的所有樣品中，曝光時間為5秒。
如圖所示，在濺射有銅的玻璃上，“DNA/Cu”和“RNA/Cu”具有高于“(_) /Cu”的熒光強度。尤其是在DNA樣品中，檢測到強的熒光。另一方面，在濺射銀的玻璃上，與“(_)/Ag”相比，“DNA/Ag”和“RNA/Ag”沒有顯示出熒光強度的增加。與“(_) /Cu”相比，“(-)/Ag”顯示了更高的測量值。這可能是由來自濺射銀的表面上的反射光、散射光或自發(fā)熒光的背景引起的。
接下來，考察了熒光強度隨核酸與銅的接觸時間的變化。將含5mg/ml的ssDNA和0.5M的NaCl的樣品放置在濺射有銅的玻璃和間隙蓋玻片之間的時間點被指定為每隔預(yù)定時間測量熒光強度的起點。每隔15秒捕獲圖像，每個捕獲階段打開和關(guān)閉激發(fā)光快門。使用XlO物鏡，曝光時間為I秒。在每一次，捕獲的一幅圖像被用于測量熒光強度。結(jié)果示于圖25中。
如圖所示，在引入樣品之后的幾分鐘內(nèi)，熒光強度逐漸增加，并在大約3分鐘以內(nèi)達到最大值。
從核酸與銅接觸起，經(jīng)過一段預(yù)定時間之后，考察由溫度變化而引起的熒光強度的變化。捕獲圖像之后，立即將它保持在室溫下。50秒之后，將加熱至65°C的加熱塊輕輕地放在濺射有銅的玻璃上。100秒之后，將熱塊移開。每隔5秒捕獲圖像。150秒之后，暫時停止測量并關(guān)閉激發(fā)光快門。900秒之后，再次開始測量。結(jié)果示于圖26中。
如圖所示，在最初的50秒內(nèi)，熒光強度逐漸減小。這可能是由熒光光褪色引起的。在接下來的50秒期間，熒光以明顯不同于熒光光褪色的速度消失。在加熱塊被移開并且回到室溫之后，熒光逐漸恢復(fù)。900秒之后，熒光強度回到從初始熒光強度中扣除褪色的熒光強度的水平。這些結(jié)果顯示從與銅接觸的核酸中發(fā)射的熒光是熱敏的，且隨著溫度升高而可逆消失。
實施例4
實施例4示出通過將含細(xì)胞的樣品引入到濺射有銅的玻璃上，可熒光觀測細(xì)胞核。
<材料和方法>
無Ca/Mg 的 Dulbecco 憐酸鹽緩沖鹽水(Invitrogen Corporation, CA, USA)被用作 PBS。
在洋蔥薄皮實驗中，用一對鑷子將市售洋蔥的薄皮小心剝離，浸入到蒸餾水中清洗以供使用。將洋蔥薄皮放置于濺射有銅的玻璃上，浸入PBS中，用蓋玻片覆蓋，然后再觀察。
在人類白細(xì)胞樣品的實驗中，對IMMUN0-TR0L Cells (Cat.N0.6607077, BeckmanCoulter, Inc.，F(xiàn)ullerton, CA, USA)作如下處理:首先，分離 500 毫升 IMMUN0-TR0L Cells,用PBS清洗，并采用離心機(1200rpm，5分鐘)沉降。此后，棄去上層清液以剝離(flake)顆粒(pellet)，重復(fù)兩次水溶血處理以提供樣品。樣品用PBS稀釋，由此配制白細(xì)胞樣品。水溶血處理按如下方式進行:在充分剝離作為離心產(chǎn)物而獲得的沉淀之后，加入9ml去離子水，倒轉(zhuǎn)混合30秒，加入Iml的10XPBS緩沖液(Nippon Gene C0.,Ltd.，東京，日本)并充分?jǐn)嚢?。?xì)胞被離心分離(1200rpm，5分鐘)，并沉降以除去上層清液。白細(xì)胞樣品被放置于濺射有銅的玻璃上，用蓋玻片覆蓋，然后再觀察。
濺射有銅的玻璃、蓋玻片、顯微鏡等與實施例3中的相同。在濺射中，厚度設(shè)定為20nm、40nm或100nm。除非另有說明，否則在以下實驗中厚度設(shè)定為40nm。當(dāng)只在玻璃載片表面的一部分濺射銅時，在玻璃載片表面粘貼聚酰亞胺帶，在中心部位留出5mm的正方形，從而實施濺射。然后除去聚酰亞胺帶。這樣，就制作成只在中心部位的5mm正方形上生成了 Cu層的濺射有銅的玻璃。
采用激發(fā)濾光器(365/10nm)、二向色鏡(400nm)和熒光濾光器(590LP)對洋蔥薄皮進行熒光觀察。采用濾光器組UV-1A (Ex =365/10, DM:400，BA:400/Nikon)對白細(xì)胞樣品和Jurkat細(xì)胞進行熒光觀察。
< 結(jié)果 >
圖27示出在濺射有銅的玻璃上的洋蔥薄皮的熒光觀察并捕獲的圖像。(a)和(b)示出在濺射有銅的玻璃上觀察到的圖像。(C)和(d)示出在其上未濺射有銅的玻璃載片上觀察到的圖像。(a)和(C)是明視場觀察到的圖像。(b)和(d)是熒光圖像。(a) (d)是采用X 10物鏡捕獲的圖像。(e)是采用X40物鏡捕獲的圖像。
如圖所示，在濺射有銅的玻璃上的細(xì)胞上觀察到細(xì)胞核所特有的強熒光。盡管在部分細(xì)胞壁等上觀察到微弱的熒光，但認(rèn)為是細(xì)胞壁等的自發(fā)熒光，因為其在未濺射有銅的玻璃載片上的細(xì)胞上也被發(fā)現(xiàn)。
接下來，觀察動物細(xì)胞。圖28示出在濺射有銅的玻璃上的人類白細(xì)胞樣品的熒光觀察和捕獲的圖像。(a)是明視場觀察到的圖像。(b)是熒光圖像。使用了 X40的物鏡。
在熒光圖像中，明顯觀察到白細(xì)胞所特有的分頁核中性白細(xì)胞(segmentedneutrophils)。
圖29示出使用只在玻璃載片表面的一部分濺射銅的銅濺射玻璃觀察到的圖像。在銅濺射玻璃上，散布人類白細(xì)胞細(xì)胞珠，即Jurkat細(xì)胞，用蓋玻片覆蓋，然后用X 20的物鏡觀察。在銅濺射玻璃上沉積銅的區(qū)域和沒有沉積銅的區(qū)域之間的邊界上捕獲圖像。(a)和(c)是明視場觀察的圖像；占據(jù)超過一半的黑色區(qū)域是不能透光的區(qū)域，因為形成了銅膜。(b)和(d)是熒光圖像。
在沉積銅的區(qū)域中，只在細(xì)胞的細(xì)胞核上觀察到強熒光。圖30示出使用其上生成厚度為20nm (a)或IOOnm (b)的銅層的銅濺射玻璃觀察Jurkat細(xì)胞的結(jié)果。在兩種厚度下都觀察到來自細(xì)胞核的熒光。
〈討論〉
本實施例中的結(jié)果顯示通過使細(xì)胞核與銅接觸，也能檢測到熒光。顯然這種現(xiàn)象只發(fā)生在其上濺射有銅的玻璃基板上，并且是細(xì)胞核與銅之間的作用結(jié)果。
洋蔥薄皮細(xì)胞和白細(xì)胞的熒光觀察結(jié)果明顯顯示出各細(xì)胞中的細(xì)胞核的形狀之間的差異。由此，根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法，可識別取決于細(xì)胞類型的細(xì)胞核的不同形狀。
盡管在本實施例中沒有示出，但是在使用在其一部分上濺射有銅的玻璃載片的實驗中，在觀察僅來自沉積銅的區(qū)域上的細(xì)胞的熒光之后，傾斜玻璃載片以使細(xì)胞從沉積銅的區(qū)域移動到未沉積銅的區(qū)域。移動之后，繼續(xù)觀察到熒光。由此，即使銅與細(xì)胞接觸的位置與熒光觀察細(xì)胞的位置分隔，發(fā)現(xiàn)通過在兩個部位之間放置用于移動細(xì)胞的裝置可以檢測到熒光。`
在證實來自位于銅濺射玻璃和蓋玻片之間的細(xì)胞的細(xì)胞核的熒光之后，移去蓋玻片，含細(xì)胞的溶液被暴露在空氣中。然后，熒光迅速消失。同樣，在實施例1中使用Cu(II)離子和S.A.的實驗中，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)溶液暴露于空氣中較長時間之后，熒光消失。熒光的消失可認(rèn)為是由于與空氣接觸而導(dǎo)致的Cu (I)離子的氧化。因此，可能通過使樣品溶液與空氣接觸而抑制熒光的產(chǎn)生(尤其是，暴露于空氣中所含的氧氣)。認(rèn)為通過限制與空氣的接觸(例如在微芯片中)實施根據(jù)本技術(shù)的核酸檢測方法是優(yōu)選的。
實施例5
在實施例5中，證實了在與實施例1中相似的實驗條件下，可從具有兩個堿基長度的低聚DNA發(fā)射熒光。
<材料和方法>
采用與實施例1中相似的材料和方法，測量了從Invitrogen公司購買的七種類型的低聚DNA的熒光。使用的低聚DNA中的堿基序列是T (20)(序列編號:1)、T (10)(序列編號:19)、T (6)(序列編號:10)、Τ (5)(序列編號:27)、T (4)(序列編號:28)、Τ (3)(序列編號:12)、T (2)(序列編號:29)。在這里，CuSO4濃度設(shè)定為0.4mM，S.A.濃度設(shè)定為4mM，NanoDrop3300被用于測量。
〈結(jié)果〉
圖31示出T (20)的測量結(jié)果。低聚DNA的各自濃度為(a) 100 μ M、(b) 50 μ M、(c)50μΜ, (d) 25μΜ、(θ) 12.5μΜ和(f) 6.25 μ M0在各圖中，橫軸表示波長(nm)，縱軸表示熒光強度(RFU值)。圖32至圖37示出各低聚DNA T (10)、T (6)、T (5)、T (4)、T (3)和T (2)的測量結(jié)果。圖中各曲線中示出的數(shù)值表示低聚DNA的濃度。
圖38示出在熒光強度為最高的濃度條件下各低聚DNA所獲得的熒光光譜。橫軸表不波長(nm),縱軸表不相對值(峰值RFU值設(shè)為I)。(a)表不T (20)的突光光譜，(b)表75 T (10)的突光光譜，(c)表不T (6)的突光光譜，(d)表不T (5)的突光光譜，(e)表不T (4)的熒光光譜，Cf)表示T (3)的熒光光譜，(g)表示T (2)的熒光光譜。
圖39示出了標(biāo)繪了各低聚DNA在各濃度的峰值RFU值的圖。橫軸表示各低聚DNA的濃度(μ M)，縱軸表 示峰值RFU值(對數(shù)值)。(a)表示T (20)的結(jié)果，(b)表示T (10)的結(jié)果，(c)表不T (6)的結(jié)果，Cd)表不T (5)的結(jié)果，Ce)表不T (4)的結(jié)果，Cf)表不T(3)的結(jié)果，(g)表示T (2)的結(jié)果。
〈討論〉
本實施例的結(jié)果揭示了從具有胸腺嘧啶兩個堿基長度的低聚DNA觀察到熒光。發(fā)現(xiàn)即使當(dāng)?shù)途跠NA的濃度改變時，熒光光譜的形狀也幾乎不變，但是熒光峰傾向于隨著堿基長度變短而向短波長側(cè)移動(參照圖38)。可以看出，熒光光譜的強度傾向于依賴低聚DNA的濃度，但當(dāng)濃度超過某一值時，到達穩(wěn)定水平(plateau)，并反向下降(參照圖39)。而且，在實施例2中使用銅粉的實驗中觀察到，當(dāng)DNA的濃度太高時，熒光強度是減小的(參照圖 15)。
實施例6
在實施例6中，在與實施例1中相似的實驗條件下，采用具有由T和C或T和G構(gòu)成的三個堿基長度的低聚DNA進行實驗。
〈材料和方法〉
采用與實施例1中相似的材料和方法，測量從Invitrogen Corporation購買的低聚DNA的熒光。所用低聚DNA的序列為TTT (序列編號:12)、TTC、TCT、CTT、TCC、CTC、CCT、CCC、TTG、TGT、GTT、TGG、GTG、GGT、GGG。CuSO4 濃度設(shè)定為 0.4mM, S.A.濃度設(shè)定為 4mM,低聚DNA濃度設(shè)定為0.5mM, NanoDrop3300被用于測量。
< 結(jié)果 >
結(jié)果示于圖40和41中。在圖40中，(a)表示TTT (序列編號:12)的結(jié)果，(b)表示TTC的結(jié)果，(C)表示TCT的結(jié)果，Cd)表示CTT的結(jié)果，Ce)表示TCC的結(jié)果，Cf)表示CTC的結(jié)果，(g)表示CCT的結(jié)果，且(h)表示CCC的結(jié)果。在圖41中，(a)表示TTT (序列編號:12)的結(jié)果，(b)表示TTG的結(jié)果，(c)表示TGT的結(jié)果，(d)表示GTT的結(jié)果，(e)表不TGG的結(jié)果，Cf)表不GTG的結(jié)果，(g)表不GGT的結(jié)果，且(h)表不GGG的結(jié)果。橫軸表示波長(nm)，且縱軸表示熒光強度(RFU值)的對數(shù)值。
在具有T和C的混合序列的低聚DNA中，熒光強度在TTT序列最強，然后是CTT、CCT和TCT。在TTC和CTC中確定有弱熒光(參照圖40)。另一方面，確定在TCC和CCC中沒有在大約600nm處有峰的熒光。在具有T和G的混合序列的低聚DNA中，確定了在TTG序列有中等強度的熒光，在GTT有弱熒光，但在其他序列，確定沒有在大約600nm處有峰的熒光(參照圖41)。
< 討論 >
在具有T和C的混合序列的低聚DNA中，在第二和第三位包括T的CTT序列顯示熒光強度比TCT和TTC高。而且，在第三位包括T的TCT和CCT顯示熒光強度比在第二位包括T的TTC和CTC高。由此可認(rèn)為在具有T和C的混合序列的低聚DNA中，在第三堿基位的T對熒光做出非常大的貢獻，而在第二堿基位的T對熒光做出次要貢獻。
在具有T和G的混合序列的低聚DNA中，除了 TTG和GTT之外，確定沒有在大約600nm處有峰的熒光。熒光強度通常比具有有C和T的混合序列的低聚DNA低。由此，可認(rèn)為G具有吸收熒光能量和猝滅熒光的作用。
實施例7
在實施例7中，證實了熒光被淬滅色料淬滅。
<材料和方法>
采用與實施例1中相似的材料和方法，從Invitrogen Corporation購買的低聚DNA T (10)(序列編號:19)和由 Black Hole Quencher-2 (BHQ2)修飾低聚 DNA T (10)的3’末端而提供的低聚DNA (T (10)BHQ2) (Sigma-Aldrich Corporation)被用于測量突光。CuS04濃度設(shè)定為0.4mM, S.A.濃度設(shè)定為4mM，低聚DNA濃度設(shè)定為0.05mM, NanoDrop3300被用于測量。
< 結(jié)果 >
結(jié)果示于圖42中。橫軸表示波長(nm)，縱軸表示熒光強度(RFU值)。在T (10)中觀察到明顯的熒光，但是在淬滅劑修飾的T (10)BHQ2中沒有檢測到熒光。
< 討論 >
BHQ2是已知有效吸收尤其是大約560nm 650nm范圍內(nèi)的光的淬滅劑。認(rèn)為是由于BHQ2的作用而導(dǎo)致在T (10)中觀察的熒光在T (10)BHQ2中不再能觀察到。結(jié)果表明可以將銅的作用與FRET結(jié)合。
實施例8
在實施例8中，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的熒光強度和光譜形狀被再次比較，證實了強度是不同的，但兩者的光譜形狀是相同的。此外，考察了甲基化胞嘧啶(MeC)和肌苷(I)的熒光產(chǎn)生，且揭示了二者均不產(chǎn)生熒光。
<材料和方法>
采用與實施例1中相似的材料和方法，測量了多種低聚DNA的熒光。從InvitrogenCorporation購買的T (10)(序列編號:19)、U (9)G (序列編號:20)、A (10)(序列編號:30)和I (9) G (序列編號:31)被用作低聚DNA。而且,從Sigma-Aldrich Corporation購買的C (10)(序列編號:32)、C (4) MeC (6)(序列編號:33，MeC是5-甲基2-脫氧胞苷)被用作低聚DNA。CuSO4濃度設(shè)定為0.4mM, S.A.的濃度設(shè)定為4mM，低聚DNA濃度設(shè)定為0.05mM, NanoDrop3300 被用于測量。
< 結(jié)果 >
T (10)和U (9)各三次的測量結(jié)果示于圖43中。(a)是具有代表波長(nm)的橫坐標(biāo)及代表熒光強度(RFU值)的縱坐標(biāo)的曲線。(b)是具有代表作為相對值(各低聚DNA的峰值RFU值設(shè)定為I)的熒光強度(RFU值)的平均值的縱坐標(biāo)的曲線。確認(rèn)了 U (9G)發(fā)射比T (10)強度低的熒光，但具有與T (10)相似的光譜形狀。
T (10)、C (10)和C (4) MeC (6)的測量結(jié)果示于圖44中。橫軸代表波長(nm)，且縱軸表示熒光強度(RFU)。從T (10)中觀察到明顯的熒光，但從C (10)和C (4)MeC (6)中觀察不到熒光。
T (10), A (10)和I (9) G的測量結(jié)果示于圖45中。橫軸代表波長(nm)，且縱軸表示熒光強度(RFU)。從T (10)中觀察到明顯的熒光，從A (10)中觀察到弱熒光，但從I(9)G中觀察不到熒光。
< 討論 >
與從具有胸腺嘧啶序列的核酸中發(fā)射的熒光相比，從具有尿嘧啶序列的核酸中發(fā)射的熒光強度較低，但具有類似的光譜形狀。實施例1支持此結(jié)果。此外，證實了具有胞嘧啶的序列或具有胞嘧啶和甲基化胞嘧啶序列的核酸不發(fā)射熒光。
這些結(jié)果顯示，通過用銅檢測熒光，可將尿嘧啶從胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中識別出來。這表明根據(jù)本發(fā)明的核酸檢測方法可檢測通過硫酸氫鹽反應(yīng)進行的尿嘧啶(U)對胞嘧啶(C)的取代，以及分析DNA分子的甲基化。
工業(yè)實用性
根據(jù)本技術(shù)，僅通過使樣品與銅接觸，就可以簡便檢測或測量核酸是否存在及數(shù)量、樣品中的堿基序列；及樣品中細(xì)胞核的形狀、分布、數(shù)量和大小。
這一技術(shù)對改善在包括醫(yī)療領(lǐng)域(病理學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、移植、遺傳學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、化學(xué)治療等)、藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域、 臨床檢查領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、工程領(lǐng)域、法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和刑事鑒定領(lǐng)域的多個領(lǐng)域中的核酸或細(xì)胞的分析和分析研究作出貢獻。
權(quán)利要求
1.一種核酸的檢測方法，包括以下步驟: 使含所述核酸的樣品與銅接觸，并且 檢測從所述樣品發(fā)射的熒光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中， 基于檢測步驟中檢測出的熒光的強度和/或光譜來分析所述核酸的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中， 基于檢測步驟中檢測出的熒光的強度和/或光譜來分析形成所述核酸的雙鏈中的錯配。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，包括以下步驟: 用硫酸氫鹽處理所述樣品，其中， 基于在檢測步驟中從硫酸氫鹽處理前的所述樣品檢測出的熒光的強度和/或光譜與從硫酸氫鹽處理后的所述樣品檢測出的熒光的強度和/或光譜之間的差異來分析所述核酸中的胞嘧啶的甲基化或脫甲基化。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中， 所述銅是固體銅。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其中， 接觸步驟是在鹽的共存下使所述樣品與銅接觸的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其中， 檢測步驟是通過用300 μ m至420 μ m波長的光照射所述樣品而檢測從所述樣品發(fā)射的熒光的步驟。
8.一種含核酸的樣品的光學(xué)觀察方法，包括以下步驟: 使所述樣品與銅接觸，并且 檢測從所述樣品發(fā)射的熒光。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的光學(xué)觀察方法，其中， 所述樣品是細(xì)胞。
10.一種熒光物質(zhì)，其包含銅與`核酸的復(fù)合物。
全文摘要
一種簡便地檢測核酸的方法，不要求復(fù)雜的操作，例如在微觀尺度流路內(nèi)的液體的混合和清洗。提供了一種檢測核酸的方法，包括以下步驟使含核酸的樣品與銅接觸，并且檢測從樣品中發(fā)射的熒光。根據(jù)這種檢測核酸的方法，僅通過將含核酸的樣品與銅接觸，就能簡便地檢測出源于核酸與銅的復(fù)合物的熒光。
文檔編號C12N15/09GK103189509SQ20118005320
公開日2013年7月3日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者新田尚 申請人:索尼公司