專利名稱：一種利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁ニ醇的方法。
背景技術(shù)：
2，3-丁ニ醇(2，3_butanediol，簡稱2，3_BD)廣泛應(yīng)用于化工、食品以及航空航天等眾多領(lǐng)域。其熱值為27200kJ/kg，與こ醇(29100kJ/kg)相近，可用作燃料，同時，還可用于制備聚合物、油墨、香水、防凍劑、香薰劑、增濕劑、炸藥以及藥物的手性載體等。隨著石化資源的日益枯竭以及石化工業(yè)對環(huán)境的影響，可再生資源引來了越來越多的關(guān)注。由于石油價格的不斷上漲及其不穩(wěn)定性，利用可再生資源生產(chǎn)生物基大宗化學(xué)品如生物燃料等引起了人們極大的興趣。利用可再生的生物質(zhì)資源作為底物，將生物發(fā)酵和緑色化學(xué)エ業(yè)有機(jī)結(jié)合，可以建立起環(huán)境友好的、可持續(xù)發(fā)展的化學(xué)エ業(yè)。目前2，3- 丁ニ醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。エ業(yè)上生產(chǎn)2，3- 丁ニ醇的化學(xué)法，主要是以石油裂解時產(chǎn)生的四碳類碳?xì)浠衔镌诟邷馗邏合滤獾玫剑欢瘜W(xué)法生產(chǎn)2，3-丁ニ醇不僅成本高而且過程繁瑣，因此エ業(yè)化生產(chǎn)較困難。生物發(fā)酵法合成2，3-丁ニ醇使用的生物質(zhì)原料可再生，較化學(xué)法生產(chǎn)2，3-丁ニ醇エ藝更簡單、更加環(huán)境友好，不僅可以避免化學(xué)法合成的困難，而且可以促進(jìn)人類社會生產(chǎn)，由傳統(tǒng)的石油煉制向以可再生資源為原料的生物煉制轉(zhuǎn)型，逐漸減少對日益枯竭的石油資源的依賴。目前利用葡萄糖為底物占生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2，3_ 丁ニ醇的大多數(shù)，但由于糧食危機(jī)的存在，利用豐富而且廉價的可再生資源木質(zhì)纖維類物質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁ニ醇成為必然趨勢。木質(zhì)纖維素原料，來源廣泛，且再生迅速。玉米芯作為ー種木質(zhì)纖維素原料，在我國有著極其廣泛的資源?，F(xiàn)階段，我國大部分エ業(yè)生產(chǎn)的木糖是由玉米芯水解液提取得到，在木糖過程中產(chǎn)生了一種纖維素含量豐富的廢棄物——玉米芯殘渣。玉米芯殘渣具有纖維素含量高，結(jié)構(gòu)疏松的特點(diǎn)，是ー種理想的木質(zhì)纖維素原料。因此利用玉米芯殘渣生產(chǎn)高值平臺產(chǎn)物2，3_ 丁ニ醇，以草代糧，不僅解決了與人爭糧的問題，同時實現(xiàn)了ー種エ業(yè)副產(chǎn)物的高值利用，順應(yīng)了環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展的潮流。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以木糖エ業(yè)廢棄物玉米芯殘渣為主要原料，利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)高值平臺化合物2，3- 丁ニ醇，實現(xiàn)資源的綜合利用。鑒于纖維素酶解過程當(dāng)中存在的葡萄糖阻遏，エ業(yè)上對纖維素酶解液的濃縮存在能耗過大的問題，因此本發(fā)明選擇同步糖化發(fā)酵方式，避免了纖維素酶解后的濃縮過程。本發(fā)明對利用玉米芯殘渣進(jìn)行同步糖化發(fā)酵的發(fā)酵條件進(jìn)行了探索，并對各種添加因子進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，最終得到了ー種利用玉米芯提取木糖后殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁ニ醇的方法。 具體步驟如下
第一歩、將玉米芯殘渣原材料烘干粉碎后，按照玉米芯殘渣與NaOH溶液重量體積比I : 8-1 12混合，在60-80°C條件下預(yù)處理l_3h，后將殘渣洗滌至中性，烘干粉碎后過40目篩備用。所述NaOH溶液濃度為
第二歩、將處理后的殘渣加入發(fā)酵液中，殘渣與發(fā)酵液的重量體積比為1:8-1: 15，然后在 115°C下滅菌 20min。發(fā)酵液組成如下尿素I. 4-2. 2g/L，乳酸 l_3g/L，檸檬酸鈉 0. 1-lg/L，EDTA0. 002-0. 006g/L,磷酸氫ニ鉀l_5g/L，磷酸ニ氫鉀4-20g/L，硫酸鎂0. 05-0. 5g/L，硫酸鈣0. 03-0. 06g/L,硫酸亞鐵
0.1-0. 15g/L,氯化鈷 0. 002-0. 006g/L,硫酸銅 0. 0025-0. 0075g/L,硫酸鋅 0. 05-0. 15g/L,硫酸錳 0. 025-0. 05g/L。第四步、接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、多粘類芽抱桿菌(Bacillus polymyxa)CICC10010、陰溝腸桿菌(Bacillus cloacae)CICC10014菌液中的ー種或上述菌種的混合菌液，同時向發(fā)酵液中加入纖維素酶，所述發(fā)酵液中纖維素酶的添加量為每克玉米芯殘渣加入300U-500U纖維素酶。于35-42°C同步糖化發(fā)酵36_84h后2，3- 丁ニ醇的產(chǎn)量為玉米芯殘渣干重的19.59% -36. 13% (2，3-丁ニ醇/玉米芯殘渣干重，W/W)。所述第四步中優(yōu)選接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、多粘類芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)CICC10010 和陰溝腸桿菌(Bacillus cloacae)CICC10014 的混合菌液。所述混合菌液中，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011優(yōu)選體積百分比為25-30%，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518優(yōu)選體積百分比為20-30%，多粘類芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)CICC10010優(yōu)選體積百分比為10_20%，陰溝腸桿菌(Bacillus cloacae) CICC10014 體積百分比為 25-35%。本發(fā)明所產(chǎn)生的技術(shù)效果本發(fā)明利用玉米芯生產(chǎn)木糖的廢料——玉米芯殘渣生產(chǎn)2，3_ 丁ニ醇，實現(xiàn)了ー種エ業(yè)廢料的高值利用，即使原料利用不完全，廢液中固液分離容易，剰余殘渣可循環(huán)利用。本發(fā)明以草代糧、變廢為寶，減小環(huán)境污染的同時降低了 2，3- 丁ニ醇的生產(chǎn)成本；而且利用優(yōu)選的菌種采用科學(xué)篩選的添加比例進(jìn)行發(fā)酵，從而使發(fā)酵エ藝效率更好，并實現(xiàn)更加良好的糖化發(fā)酵，使發(fā)酵產(chǎn)率有了較大提高。
具體實施例方式實施例I將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 8(纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎，測得預(yù)處理后的殘渣含纖維素88. 92%、木質(zhì)素3. 35%。影響纖維素水解的木質(zhì)素含量明顯降低。將處理后及未處理的玉米芯殘渣按照纖維素比發(fā)酵液I : 8(W/V)的比例加入至含有1.61g/L尿素的發(fā)酵液當(dāng)中，裝液量50mL/250mL，初始pH 5.0，滅菌后按每克玉米芯殘洛400U的比例加入纖維素酶,接入10%肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011菌液，35°C，150r/min搖瓶發(fā)酵36h，發(fā)酵液中2，3- 丁ニ醇與こ偶姻濃度和分別為8. 525g/L (未處理)和28. 482g/L (處理)，經(jīng)堿法預(yù)處理的玉米芯殘渣較未處理殘渣單位時間內(nèi)產(chǎn)量提高3. 34倍。發(fā)酵液組成為尿素I. 6g/L，乳酸2g/L，檸檬酸鈉0. 3g/L，EDTAO. 003g/L,磷酸氫ニ鉀3g/L，磷酸ニ氫鉀8g/L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸鈣0. 04g/L,硫酸亞鐵0. lg/L，氯化鈷
0.004g/L，硫酸銅 0. 0045g/L，硫酸鋅 0. lg/L，硫酸錳 0. 04g/L。實施例2將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 10 (纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎。將處理后的玉米芯殘渣按固液比I : 10(纖維素原料干重發(fā)酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，檸檬酸鈉lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氫ニ鉀5g/L，磷酸ニ氫鉀20g/L,硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鈣0. 05g/L,硫酸亞鐵0. 15g/L，氯化鈷0. 005g/L,硫酸銅0. 0075g/L,硫酸鋅0. 15g/L，硫酸錳0. 05g/L的發(fā)酵液中，裝液量50mL/250mL，初始PH 5. 0，滅菌后按每克玉米芯殘渣400U的比例加入纖維素酶，接入5 %肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011 菌液,35°C，150r/min 搖瓶發(fā)酵 36h,發(fā)酵液中 2, 3-丁ニ醇濃度為23. 484g/L，2，3-丁ニ醇與こ偶姻濃度和為25. 041g/L,占玉米芯殘渣干重的25. 04%。實施例3將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 12 (纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎。將處理后的玉米芯殘渣按固液比I : 12(纖維素原料干重發(fā)酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，檸檬酸鈉lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氫ニ鉀5g/L，磷酸ニ氫鉀20g/L,硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鈣0. 05g/L,硫酸亞鐵0. 15g/L，氯化鈷0. 005g/L,硫酸銅0. 0075g/L,硫酸鋅0. 15g/L，硫酸錳0. 05g/L的發(fā)酵液中，裝液量50mL/250mL，初始PH 5. 0，滅菌后按每克玉米芯殘渣400U的比例加入纖維素酶，接入5 %產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) CICC21913 菌液，35 °C，150r/min 搖瓶發(fā)酵 36h,發(fā)酵液中 2,3- 丁ニ醇濃度為17.618g/L，2，3-丁ニ醇與こ偶姻濃度和為18. 548g/L，占玉米芯殘渣干重的22. 26%。實施例4將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 15 (纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎。將處理后的玉米芯殘渣按固液比I : 15 (纖維素原料干重發(fā)酵液，W V)加入至含有尿素L 61g/L，乳酸2g/L，檸檬酸鈉lg/L，EDTAO. 006g/L,磷酸氫ニ鉀5g/L，磷酸ニ氫鉀20g/L，硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鈣0. 05g/L，硫酸亞鐵0. 15g/L，氯化鈷0. 005g/L，硫酸銅
0.0075g/L，硫酸鋅0. 15g/L，硫酸錳0. 05g/L的發(fā)酵液中，裝液量50mL/250mL，初始pH 5. 0，滅菌后按每克玉米芯殘渣400U的比例加入纖維素酶，接入5%多粘類芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa) CICC10010菌液，35 °C，150r/min搖瓶發(fā)酵48h，發(fā)酵液中2,3- 丁ニ醇濃度為、12. 238g/L，2，3-丁ニ醇與こ偶姻濃度和為13. 062g/L,占玉米芯殘渣干重的19. 59%。實施例5將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 15(纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后 將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎。將處理后的玉米芯殘渣按固液比I : 15(纖維素原料干重發(fā)酵液，W : V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，檸檬酸鈉lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氫ニ鉀5g/L，磷酸ニ氫鉀20g/L，硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鈣0. 05g/L，硫酸亞鐵0. 15g/L，氯化鈷0. 005g/L，硫酸銅0. 0075g/L,硫酸鋅0. 15g/L，硫酸錳0. 05g/L的發(fā)酵液中，裝液量50mL/250mL，初始pH5.0，滅菌后按每克玉米芯殘渣400U的比例加入纖維素酶，接入5%陰溝腸桿菌(Bacilluscloacae) CICC10014菌液，40°C，150r/min搖瓶發(fā)酵48h，發(fā)酵液中2，3- 丁ニ醇濃度為15. 295g/L，2，3-丁ニ醇與こ偶姻濃度和為16. 259g/L，占玉米芯殘渣干重的24. 39%。實施例6將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 10 (纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎。將處理后的玉米芯殘渣按固液比I : 10(纖維素原料干重發(fā)酵液，W : V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，檸檬酸鈉0. 5g/L，EDTAO. 004g/L,磷酸氫ニ鉀lg/L，磷酸ニ氫鉀4g/L，硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鈣0. 034g/L,硫酸亞鐵0. 136g/L，氯化鈷0. 0044g/L，硫酸銅0. 005g/L，硫酸鋅0. 096g/L，硫酸錳0. 0275g/L的發(fā)酵液中，于5L發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝液量3L，按每克玉米芯殘渣400U的比例加入纖維素酶，接入2 %肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011 菌液,發(fā)酵過程中控制 pH5. 0,攬拌獎轉(zhuǎn)速 400r/min,通氣量I. 4Vvm0 38°C發(fā)酵84小時后，發(fā)酵液中2，3- 丁ニ醇濃度為31. 857g/L，2，3- 丁ニ醇與こ偶姻濃度和為33. 754g/L，占玉米芯殘渣干重的33. 75%。實施例7將玉米芯生產(chǎn)木糖エ業(yè)的廢棄物玉米芯殘渣粉碎后按固液比I : 10 (纖維素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液當(dāng)中，80°C條件下預(yù)處理3h，處理結(jié)束后將殘渣洗滌至中性，烘干后粉碎。將處理后的玉米芯殘渣按固液比I : 10 (纖維素原料干重發(fā)酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L,乳酸2g/L，檸檬酸鈉0. 5g/L，EDTAO. 004g/L,磷酸氫ニ鉀lg/L，磷酸ニ氫鉀4g/L，硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鈣0. 034g/L，硫酸亞鐵0. 136g/L，氯化鈷0. 0044g/L，硫酸銅0. 005g/L，硫酸鋅0. 096g/L，硫酸錳0. 0275g/L的發(fā)酵液中，于5L發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝液量3L，按每克玉米芯殘渣400U的比例加入纖維素酶，接入6 %的混合菌液，所述混合菌液中含有體積百分比為26%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011、體積百分比為24%的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、體積百分比為23%的多粘類芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)CICC10010、體積百分比為27%的陰溝腸桿菌(Bacilluscloacae) CICC10014。發(fā)酵過程中控制pH5. 0，攪拌槳轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量I. 4vvm。42°C發(fā)酵72小時后，發(fā)酵液中2，3-丁ニ醇濃度為34. 879g/L，2，3-丁ニ醇與こ偶姻濃度和為36. 128g/L，占玉米芯殘渣干重的36. 13%。
權(quán)利要求
1.ー種利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁ニ醇的方法，包括如下步驟 第一歩、將含有纖維素玉米芯殘渣原材料粉碎，烘干備用； 第二步、粉碎后玉米芯殘渣與NaOH溶液按照重量體積比I : 8-1 12混合，在60-80°C條件下預(yù)處理l_3h，后將殘渣洗滌至中性，烘干粉碎后過40目篩備用； 第三步、將烘干粉碎后殘渣加入發(fā)酵液中，烘干粉碎后殘渣與發(fā)酵液的重量體積比為1:8-1: 15，然后在 115°C下滅菌 20min ; 第四步、接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC 21518、多粘類芽抱桿菌(Bacillus polymyxa)CICC 10010、陰溝腸桿菌(Bacillus cloacae)CICC10014菌液中的ー種或上述菌種的混合液，同時向發(fā)酵液中加入纖維素酶，所述發(fā)酵液中纖維素酶的添加量為每克玉米芯殘渣加入300U-500U纖維素酶，于35-42°C同步糖化發(fā)酵36_84h。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3_丁ニ醇的方法，其特征在于，所述第四步中接入2% -10%的混合菌液，所述混合菌液中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011體積百分比為25-30 %，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) CICC21518 體積百分比為 20-30 %,多粘類芽抱桿菌(Bacilluspolymyxa)CICC 10010 體積百分比為 10-20%,陰溝腸桿菌(Bacillus cloacae)CICC10014體積百分比為25-35%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3_丁ニ醇的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液組成為尿素1.4-2. 2g/L，乳酸l_3g/L，檸檬酸鈉0. I-Ig/L，EDTA0. 002-0. 006g/L,磷酸氫ニ鉀ト5g/L，磷酸ニ氫鉀 4_20g/L，硫酸鎂 0. 05-0. 5g/L,硫酸鈣 0. 03-0. 06g/L,硫酸亞鐵 0. 1-0. 15g/L，氯化鈷 0. 002-0. 006g/L,硫酸銅0.0025-0. 0075g/L，硫酸鋅 0. 05-0. 15g/L，硫酸錳 0. 025-0. 05g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述ー種利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁ニ醇的方法，其特征在于，所述混合菌液中含有體積百分比為26%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)CICC 10011、體積百分比為 24的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、體積百分比為23%的多粘類芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)CICC 10010、體積百分比為27%的陰溝腸桿菌(Bacillus cloacae)CICC10014。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述ー種利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁ニ醇的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液中纖維素酶的添加量為每克玉米芯殘渣加入400U纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用玉米芯殘渣同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法，屬于屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，提供了以使用玉米芯提取木糖后的殘渣為原料進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法以玉米芯殘渣為碳源，尿素為氮源，利用肺炎克雷伯氏菌CICC 10011、產(chǎn)酸克雷伯氏菌CICC 21518、多粘類芽孢桿菌CICC 10010、陰溝腸桿菌CICC 10014及其混合菌液進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，2，3-丁二醇與乙偶姻達(dá)到玉米芯殘渣干重的19.59％-36.13％。本發(fā)明以玉米芯殘渣為碳源，有效降低了生產(chǎn)成本，實現(xiàn)資源的高值利用，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
文檔編號C12P7/18GK102643869SQ20121013493
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者張翠英, 彭曉培, 杜麗平, 肖冬光, 董健, 郭學(xué)武, 陳葉福 申請人:天津科技大學(xué)