一種芽孢桿菌及其同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于有機酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及k乳酸的生產(chǎn)方法，具體設(shè)及一種芽抱桿 菌極其同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純度k乳酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物質(zhì)是指W木質(zhì)素、纖維素、半纖維素W及其他有機質(zhì)為主的陸生植物和水生 植物，是一種穩(wěn)定的可再生能源資源，來源豐富，僅我國農(nóng)作物賴桿產(chǎn)量每年約為7億噸。 在上世紀石油危機后，人們開始重視由生物質(zhì)為原料制備乳酸、燃料酒精的技術(shù)。
[0003] 乳酸（分子式：C2H5OCOOH)，即為a-徑基丙酸，由于其分子中簇基a位碳原子為 不對稱原子，因而具有旋光性，可分成U+)和D(-)兩種構(gòu)型，心乳酸為右旋型，D-乳酸為 左旋型。乳酸已廣泛用于食品、飲料、飼料、現(xiàn)代醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)藥、日用化工、造紙及電子等行 業(yè)。高光學(xué)純度的心乳酸是一種重要的食品添加劑和中間體，在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工等 行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，Wk乳酸為單體合成的聚k乳酸是環(huán)境友好的生物質(zhì)塑料，可代替石 油來源的塑料，可緩解石油日益枯竭的能源危機，又可減緩環(huán)境污染。高光學(xué)純度的k乳 酸，是重要的手性中間體和有機合成原料，在提高聚乳酸熱穩(wěn)定性等方面也具有重要作用。
[0004] 目前限制心乳酸的廣泛應(yīng)用的主要原因有：（1化-乳酸的生產(chǎn)成本高，其發(fā)酵 生產(chǎn)的原材料成本高，提純和精制成本高；（2)沒有篩選到合適的能發(fā)酵產(chǎn)生高光學(xué)純度 k乳酸的菌株，因為一般的乳酸菌主要W發(fā)酵產(chǎn)生消旋乳酸為主；(3)現(xiàn)有已知的乳酸菌 一般不能利用戊糖，例如木糖、核糖和阿拉伯糖作為碳源。 陽0化]微生物發(fā)酵法是目前制備k乳酸的最主要方法之一，由于k乳酸的理化性質(zhì)與D-乳酸極其相似，在生產(chǎn)工藝上可W借鑒，因此生產(chǎn)k乳酸的關(guān)鍵在于篩選出高光學(xué)純度 k乳酸高產(chǎn)菌種，并應(yīng)用低廉有廣泛來源的原料進行發(fā)酵，簡化發(fā)酵和提純工藝，降低成 本。
[0006] 目前主要研究報道的菌種如表1所示。根據(jù)所采用的微生物菌種的不同，目前 k乳酸的微生物發(fā)酵分為根霉發(fā)酵和細菌發(fā)酵兩大主要類型。根霉發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵， 需要較高水平的空氣及攬拌系統(tǒng)，對電、蒸汽等能源的消耗較大，而且在發(fā)酵乳酸的同時還 進行其他途徑的代謝，產(chǎn)生較多雜酸，降低了葡萄糖的轉(zhuǎn)發(fā)率，生產(chǎn)成本高。故而用于工業(yè) 生產(chǎn)乳酸的菌種多為同型乳酸發(fā)酵的細菌，主要有乳桿菌屬化actobacillus)、鏈球菌屬 (Streptoccoccus)、乳球菌屬（Lactococcus)。
[0007] 表1菌種及其發(fā)酵溫度
[0008] L/IN 丄WUiUiOUO A <" /J 乙/ ( X
[0009] 細菌發(fā)酵一般為同型發(fā)酵，發(fā)酵過程中雜質(zhì)生成少，葡萄糖轉(zhuǎn)發(fā)率高。運兩類 菌的共同特點發(fā)酵溫度較低一般為30~42°C。容易污染雜菌，因此需要對發(fā)酵液進行 滅菌，造成能量的浪費和營養(yǎng)的損失。而化學(xué)合成法由于要用到乙醒和劇毒的氨氯酸， 酶法生產(chǎn)工藝復(fù)雜。微生物發(fā)酵法中主要用的菌種為乳酸菌（包括乳酸桿菌和鏈球菌） 和一些絲狀真菌。乳酸菌作為生產(chǎn)菌株具有發(fā)酵周期短，代謝產(chǎn)物單一等優(yōu)勢。90%的 文獻報道是關(guān)于乳酸菌作為生產(chǎn)菌株的，尤其是LactococcusIactis,Lactobacillus de化rueckii,Lactobacillushelveticus,Lactobacilluscasei等菌株報道得很多，運些 菌株的缺陷有W下幾方面：（1)其發(fā)酵溫度較低為30~37°C，該溫度范圍易染雜菌，造成發(fā) 酵產(chǎn)物k乳酸的光學(xué)純度不純；（2)代謝產(chǎn)物中本身含有相當數(shù)量的D-乳酸；（3)乳酸菌 本身在合成維生素B和某些氨基酸方面有缺陷，在發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要補充添加復(fù)雜的營 養(yǎng)成分，對后續(xù)的乳酸的分離純化及降低生產(chǎn)成本非常不利。絲狀真菌的發(fā)酵雖然可W彌 補上述乳酸菌的一些缺點，例如可W耐受較高的初始糖濃度，可用碳源廣泛，菌絲體的分離 容易進行等，但是也存在如下的缺點，例如絲狀真菌的發(fā)酵生產(chǎn)是好氧發(fā)酵，需要配置較高 水平的空氣供應(yīng)和攬拌系統(tǒng)，對電、蒸汽等的消耗較大，而且在產(chǎn)生乳酸的同時，還容易產(chǎn) 生其他雜酸，例如米根霉發(fā)酵強度低，原料利用率不高，菌體形態(tài)難W控制等問題。
[0010] 理想的心乳酸的生產(chǎn)菌株應(yīng)具備W下要求：（1)細胞能夠迅速生長達到高的生物 量；（2)可利用廉價原料進行發(fā)酵生產(chǎn)k乳酸，而且在生產(chǎn)過程中能耐受高濃度糖的抑制 作用；（3)具有高生產(chǎn)速率和產(chǎn)物得率，而且能耐受高濃度底物的抑制作用；(4)提取工藝 過程中副產(chǎn)物盡可能少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種芽抱桿菌及利用其同步糖 化發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純度k乳酸的方法，該方法中k乳酸的產(chǎn)量高，碳源來源廣泛。
[0012] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0013] 本發(fā)明篩選得到一株可用于k乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的耐高溫菌株芽抱桿菌度acillus SP. ) 13002,該菌株可在45~65°C的高溫下進行發(fā)酵，大大減少了發(fā)酵過程中污染雜菌的 機會，甚至可W在培養(yǎng)基不滅菌的情況下進行發(fā)酵生產(chǎn)，降低了能耗和生產(chǎn)成本。同時該菌 株的k乳酸光學(xué)純度高達99. 8%W上，易于后續(xù)的分離純化，因此，用Bacillus13002發(fā) 酵生產(chǎn)k乳酸具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。所述芽抱桿菌13002菌株具有如下性質(zhì)：
[0014] (1)形態(tài)特征：菌落呈圓形凸起且富有光澤，邊緣整齊無皺權(quán)，表面光滑，呈乳白 色，稍透明。菌種經(jīng)革蘭氏染色后，再經(jīng)過16X100放大在光學(xué)顯微鏡下觀察如圖1所示，菌 體為桿狀，單個排列；革蘭氏陽性細菌，在一定條件下可產(chǎn)生芽抱，為兼性菌，菌體為桿狀， 單個排列，寬約0. 5~1.Oym,長約3. 0~5.Oym。
[0015] (2)生理特征：接觸酶、過氧化氨酶、V-P實驗、硫化氨都為陽性，能水解酪蛋白、 明膠和淀粉，能利用巧樣酸鹽、硝酸鹽，不能利用丙酸鹽，嗎I噪實驗為陰性，最高生長溫度為 65°C;能利用葡萄糖、薦糖、麥芽糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖，不能利用鼠李糖。
[0016] (3)提取其DNA，擴增其16SrDNA并測序其與Bacilluscoagulans(凝結(jié)芽胞桿 菌）的菌種的16SrDNA序列有大于99%的同源性，見核巧酸序列，如表1。
[0017] 根據(jù)形態(tài)、生理生化特性和DNA保守序列等3方面的信息，確定其為凝結(jié)芽抱桿 -tt： 園O
[0018] 一種同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)k乳酸的方法，包括如下步驟：
[0019] (1)種子培養(yǎng)液制備：將處于對數(shù)期生長的芽抱桿菌13002的菌懸液接種于種子 培養(yǎng)基中，進行連續(xù)活化培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基為：按照質(zhì)量比計算，細 菌學(xué)蛋白腺0. 2份~1. 0份，酵母提取粉0. 1份~0. 5份，葡萄糖1. 0份~2. 0份，化Cl0. 5 份~1. 5份，用蒸饋水定容至100份，調(diào)節(jié)抑至6. 0~7. 5,滅菌后冷卻即可；
[0020] 似同步糖化發(fā)酵心乳酸：W體積比2~10 :100的比例，將種子培養(yǎng)液接種于發(fā) 酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中啟動發(fā)酵后，W恒定補料速率向發(fā)酵培養(yǎng)基中補充a-淀粉酶和 糖化酶的混合液，培養(yǎng)至7化~9化收集發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0021] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：W重量份數(shù)計，15~25 %的淀粉溶液60~80份，葡萄糖 1. 0~2. 5份，氮源1. 0~4. 0份，屯水合硫酸儀0.Ol~0. 10份，用蒸饋水定容至100份， 調(diào)培養(yǎng)基抑至6. 0~7. 5,滅菌后冷卻至45~65 °C。
[0022] 所述氮源是指：酵母粉、蛋白腺、牛肉膏、豆巧水解液、酵母浸膏、玉米漿蛋白水解 液中的一種或兩種W上W任意比例組合。 陽02引所述a-淀粉酶的添加量是W每100g干淀粉加入a-淀粉酶為0. 02~0. 08血，W每100g干淀粉加入糖化酶0. 05~0. 20mL，兩種酶混合后，用無菌水稀釋5~10倍。
[0024] 所述a-淀粉酶和糖化酶的混合液的流加速率為0. 5~2. 0血/min。
[0025] 所述淀粉為玉米淀粉、木馨淀粉、馬鈴馨淀粉、大米粉或糖米粉中的一種或兩種W 上。
[0026] 步驟似所述發(fā)酵溫度為45~65 °C。
[0027] 步驟（1)所述連續(xù)活化培養(yǎng)2~3次，發(fā)酵溫度均為45°C，培養(yǎng)時間均為2地。
[0028] 利用手性柱高效液相色譜法測定k乳酸的含量