一種枯草芽孢桿菌及其在溫室大棚土壤修復(fù)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明設(shè)及一種自行選育篩選 的枯草芽抱桿菌及在溫室大棚上壤修復(fù)中應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在集約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，±壤作為一個(gè)時(shí)空連續(xù)體，在精準(zhǔn)管理時(shí)必須考慮±壤性質(zhì) 的空間變異性。目前由于農(nóng)民缺乏必要的施肥指導(dǎo)，許多農(nóng)民大多根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行施 肥管理，并且認(rèn)為"高投入，高產(chǎn)出"，運(yùn)導(dǎo)致大量盲目過量的施肥現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。然而，過量 的施肥雖然在短期內(nèi)能提高作物的產(chǎn)量，但是，從長期來看，過量的施肥會(huì)導(dǎo)致±壤的生產(chǎn) 力下降，作物減產(chǎn)，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致地下水污染的危險(xiǎn)。
[0003] 溫室大棚連續(xù)種植幾年蔬菜后，就會(huì)出現(xiàn)很多的問題，如±壤板結(jié)、鹽潰化、酸化， 蔬菜長勢弱、產(chǎn)量低、±傳病害和根結(jié)線蟲發(fā)生嚴(yán)重等。溫室大棚蔬菜生產(chǎn)具有高投入高 產(chǎn)出的特點(diǎn)，菜農(nóng)為了獲得高產(chǎn)，受"施肥越多產(chǎn)量越高"觀念的影響，往往是盲目、超量和 不平衡施肥。而且，多數(shù)蔬菜需氮、憐、鐘的比例為1:0.4:1. 2,而實(shí)際施肥的比例多為1: 0.96 :0. 36,嚴(yán)重失調(diào)。不合理施肥造成大量化肥存積在±壤中，不僅浪費(fèi)，而且還引起± 壤板結(jié)、酸化、鹽化等一系列問題，影響根系和蔬菜正常生長，引起蔬菜死棵。±壤表面長青 苔、發(fā)紅就是由于±壤中含鹽過多引起的。
[0004] 利用生物修復(fù)作用對(duì)溫室大棚±壤進(jìn)行改良，必須遵循的原則，要使用適合的生 物、在適合的場所、適合的環(huán)境條件和適合的技術(shù)費(fèi)用。適合的生物是溫室大棚±壤改良 的先決條件，它是指具有正常生理和代謝能力，并能W較大的速率降解和轉(zhuǎn)化污染物，并在 修復(fù)過程中不產(chǎn)生毒性產(chǎn)物的生物體系；適合的場所是指有污染物和合適的生物相接觸的 地點(diǎn)，污染場地不含對(duì)降解菌種有抑制作用的物質(zhì)且目標(biāo)化合物能夠被降解；適合的環(huán)境 條件是指環(huán)境因子包括溫度、濕度、氧氣、抑值、無機(jī)養(yǎng)分等；適合的技術(shù)費(fèi)用是指生物修 復(fù)技術(shù)費(fèi)用必須盡可能低、至少低于同樣可W消除該污染物的其他技術(shù)。目前，由于設(shè)施栽 培復(fù)種指數(shù)高，產(chǎn)量高，并且能夠?qū)崿F(xiàn)一年四季均衡生產(chǎn)，因此，設(shè)施栽培已經(jīng)成為我國農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。盡管有許多關(guān)于在大田中研究有機(jī)物料對(duì)±壤性質(zhì)及作物產(chǎn)量影 響的報(bào)道，但是有關(guān)從溫室大棚±壤中分離篩選能夠改良溫室大棚±壤的菌種，W及利用 自行選育篩選馴化獲得的枯草芽抱桿菌與其他多菌種根據(jù)菌種的相融性、適用性和安全性 基本要求和菌種特性制備±壤修復(fù)劑用于改良溫室大棚±壤的研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見有關(guān)從溫室大棚±壤中篩選枯草芽抱桿菌作為優(yōu)良菌種并 與多菌種相配伍相融合制備溫室大棚±壤修復(fù)組劑的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種枯草 芽抱桿菌及其用于溫室大棚±壤修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過在溫室大棚±壤中分離出一批 微生物菌株，從中分離篩選出一株編號(hào)為X服0035KC的菌株，并通過利用編號(hào)為X服0035KC 的枯草芽抱桿菌，與巧光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌和鎖擲抱酵母菌相配伍相融合制備± 壤修復(fù)組劑，有效地改良和活化±壤，降解±壤中的有害物質(zhì)，解決±壤的鹽潰化問題，解 決實(shí)際設(shè)施大棚中±壤養(yǎng)分失衡、鹽潰化、沙化或者板結(jié)嚴(yán)重的現(xiàn)狀，綜合將對(duì)于蔬菜生產(chǎn) 的不利影響降低到最低限度，有利于提高蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，獲得良好的技術(shù)效果，在溫 室大棚±壤修復(fù)中具有廣泛而現(xiàn)實(shí)的價(jià)值。 陽006] 本發(fā)明采用主要的技術(shù)方案：
[0007] 通過微生物菌種的分離篩選，在溫室大棚±壤中分離出一批微生物菌株，經(jīng)過進(jìn) 一步分離、篩選、選育、馴化，獲得一株編號(hào)為XHS0035KC的枯草芽抱桿菌株。通過對(duì)所獲菌 株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性及16srDNA區(qū)段序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其 分類地位。同時(shí)，將編號(hào)為XHS0035KC的枯草芽抱桿菌與巧光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌 和鎖擲抱酵母菌相配伍相融合制備溫室大棚±壤修復(fù)組劑，按照重量份比核計(jì)，W編號(hào)為 XHS0035KC的枯草芽抱桿菌70份-80份、巧光假單胞菌20份-40份、膠凍樣芽胞桿菌25 份-45份和鎖擲抱酵母菌15份-35份進(jìn)行混合，菌種混合液充分吸附于載體中，并與輔料 相混合，通過利用發(fā)酵技術(shù)制備溫室大棚±壤修復(fù)組劑。利用溫室±壤修復(fù)組劑可W改良 溫室大棚±壤的品質(zhì)，有效地防治蔬菜生育期的各類病害，將溫室大棚±壤對(duì)蔬菜生產(chǎn)的 不利影響降低到最低限度，有效地改良和活化±壤、降解±壤中的有害物質(zhì)、解決±壤的鹽 潰化問題，將±壤對(duì)果蔬生產(chǎn)中的不利影響降低到最低限度，有利于提高蔬菜的產(chǎn)量和品 質(zhì)，獲得良好的技術(shù)效果，在溫室大棚上壤修復(fù)中具有現(xiàn)實(shí)的意義和作用。
[0008] 本發(fā)明具體提供一種枯草芽抱桿菌度acillus Subtilis),通過在溫室大棚±壤 中分離、篩選、馴化和培養(yǎng)，獲得一批細(xì)菌類微生物菌株，從中篩選出一株編號(hào)為X服0035KC 的菌株，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于枯草芽抱桿菌度acillus Subtilis)。 W09] 具體的，本發(fā)明提供菌株編號(hào)為X服0035KC的枯草芽抱桿菌度aci1Ius Subtilis)。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期是2014年7月10日，保藏號(hào) 是CGMCCNo. 9434。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為BacillusSubtilis。該菌株最適生長條件為： 溫度28°C，抑7. 2,時(shí)間4她；該菌株菌落中等且平滑，呈透明、白色、表面濕潤、邊緣整齊， 生長較快；桿狀，革蘭氏陽性，嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)，接觸酶陽性，M.R和V-P試驗(yàn)陽性， 淀粉水解陽性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，巧樣酸鹽利用陽性；經(jīng)微生物學(xué)鑒定為 BacillusSubtilis菌。依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey,SManualof SystematicBacterio-logy》）和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對(duì)XHS0035KC菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué) 測定，生理生化檢測確定XHS0035KC菌株為枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)中的成員。 通過BLAST同源比對(duì)，菌株XHS0035KC的16SrRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析 后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，菌株XHS0035KC與 30334-3175她acillusSubtilisKCTC1028 是其 近似種，因而根據(jù)16SrDNA序列分析結(jié)果，結(jié)合形態(tài)及生理生化特性，將菌株X服0035KC鑒 定為枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)。
[0010] 該菌株XHS0035KC在膜蛋白腺大豆瓊脂燈SA)培養(yǎng)基生長良好，經(jīng)鑒定板試驗(yàn)證 明XHS0035KC培養(yǎng)時(shí)的主要氮源包括但不限于蛋白腺、酵母粉；使用的主要碳源包括但不 限于薦糖、甘油、甘露醇、麥芽糖；使用的無機(jī)組分包括包括但不限于氯化鐘、氯化鋼、憐酸 二氨鋼、氨二鐘、憐酸=巧、二水氯化巧、屯水合硫酸儀、屯水和硫酸亞鐵。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)XHS0035KcCGMCC NO. 9434在溫室大棚±壤修復(fù)中的應(yīng)用。通過利用XHS0035KC菌株制備±壤修復(fù)劑應(yīng)用于 改良溫室大棚的±壤，有效地改良和活化±壤、降解±壤中的有害物質(zhì)、解決±壤的鹽潰化 問題，獲得顯著良好的技術(shù)效果。
[0012] 同時(shí)，本發(fā)明具體提供一種溫室大棚±壤修復(fù)組劑的制備方法，具體制備方法步 驟如下： 陽〇1引 （1)接種：制備枯草芽抱桿菌度acillusSubtiIis)X服0035KCCGMCCNO. 9434、巧 光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌和鎖擲抱酵母菌四種菌種的固體培養(yǎng)基，滅菌后嚴(yán)格進(jìn)行無 菌操作，從斜面轉(zhuǎn)接至平板，溫度28°C下培養(yǎng)3天。
[0014] (2) -級(jí)培養(yǎng)：從步驟（1)中的固體培養(yǎng)基上挑取單菌落轉(zhuǎn)接至裝有液體培養(yǎng)基 的50血錐形瓶中，無菌操作，28°C、120r/min培養(yǎng)2地-4她。
[001引做二級(jí)發(fā)酵：將上述步驟一級(jí)培養(yǎng)菌種接種于盛有液體培養(yǎng)基的SOOmL錐形瓶 中，無菌操作，28°C、120;r/min培養(yǎng)24h-4她。
[0016] (4)菌種發(fā)酵液的配伍：按照重量份比核計(jì)，選用步驟（3)制備的枯草芽抱桿菌 度acillusSubtilis)XHS0035KCCGMCCNO. 9434二級(jí)發(fā)酵液70份-80份、巧光假單胞菌二 級(jí)發(fā)酵液20份-40份、膠凍樣芽胞桿菌二級(jí)發(fā)酵液25份-45份和鎖擲抱酵母菌二級(jí)發(fā)酵 液15份-35份進(jìn)行混合，制備復(fù)合菌種的混合液。
[0017] (5)添加輔料：將步驟（4)制備的復(fù)合菌種混合液充分吸附于載體中，載體選用溫 室大棚±壤；輔料采用尿素和過憐酸巧，其中尿素與過憐酸巧的重量比為1:3 ;載體和輔料 的用量按照重量比為1:3. 5配比混合，加水至含水量40-70%，然后按體積比每立方米載體 與輔料混合用料加入上述步驟（4)制備的復(fù)合菌種混合液100-300g，并混合均勻，制備獲 得溫室大棚±壤修復(fù)組劑。
[0018] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供應(yīng)用上述溫室大棚±壤修復(fù)組劑在溫室大棚中的應(yīng)用。通 過利用自行篩選分離馴化獲得枯草芽抱桿菌度acillusSubtilis)XHS0035KCCGMCC NO. 9434,通過實(shí)踐與巧光假單胞菌、膠凍樣芽胞桿菌和鎖擲抱酵母菌S種菌種融合試驗(yàn)， 實(shí)踐證明制備的±壤修復(fù)組劑應(yīng)用于改良溫室大棚的±壤，對(duì)于改良和活化±壤、降解± 壤中的有害物質(zhì)、解決±壤的鹽潰化問題，獲得顯著突出的技術(shù)效果。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述溫室大棚±壤修復(fù)組劑的應(yīng)用方法：在空氣溫度20-30°C 下堆制；堆制是在覆蓋草簾下進(jìn)行，堆制開始后每30天翻堆一次，翻堆時(shí)補(bǔ)水至含水量 40-70%，堆制時(shí)間持續(xù)120天；堆制完成后攤驚至干燥后即可直接施用于±壤。
[0020] 本發(fā)明所選用編號(hào)為XHS0035KC的