專利名稱：對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因、其克隆方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因、其克隆方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米(Zea mays)是世界上種植面積最大并且產(chǎn)量最大的禾本科作物之一，大多用于動物飼料，食物以及エ業(yè)原料，在エ農(nóng)業(yè)中均有著廣泛的應(yīng)用。玉米對于現(xiàn)代社會的發(fā)展起到了重要作用。但是，由于玉米蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的a醇溶蛋白(22kD醇溶蛋白和19kD醇溶蛋白)的賴氨酸和色氨酸嚴重缺乏，導(dǎo)致玉米本身的營養(yǎng)價值較差，長期以玉米為單ー糧食會導(dǎo)致嚴重的營養(yǎng)不良。為了改進玉米的蛋白質(zhì)質(zhì)量，人們進行了大量的科學研究。Opaque-2是ー個含有bZIP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并且在1987年被人們通過轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)克隆。突變體表現(xiàn)出了典型的粉質(zhì)胚乳(圖I)，并且在生化成分含量中，ベ 相對于野生型籽粒表現(xiàn)出了高含量的賴氨酸和色氨酸。因此，Opaque-2是ー個著名的籽粒高賴氨酸突變體。目前研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Opaque-2在玉米胚乳中專ー的調(diào)控22kD醇溶蛋白的表達，并且部分調(diào)控19kD醇溶蛋白的表達。由于之前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Opaque-2可以和ー些非醇溶蛋白產(chǎn)生物理結(jié)合，因此，可以認為，Opaque-2在玉米籽粒發(fā)育過程中可能還擔負著一些其他的重要使命。從Opaque-2克隆至今，人們通過ー些方法找到了ー些疑似和Opaque-2有關(guān)的基因，如PBF、OHPU GCN5，但是對于Opaque-2在玉米籽粒發(fā)育中具體的調(diào)控機制依然不為人知。鑒于Opaque-2本身轉(zhuǎn)錄因子的分子結(jié)構(gòu)以及其調(diào)控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人們普遍認為Opaque-2是ー個在籽粒發(fā)育中起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。解釋Opaque-2的具體功能對于人們改進玉米蛋白質(zhì)品質(zhì)具有極為重要的意義。根據(jù)之前研究的經(jīng)驗來看，通過蛋白相互作用的方法在轉(zhuǎn)錄后水平來尋找調(diào)控Opaque-2的蛋白不失為一個重要的手段。蛋白相互作用的方法包括酵母雙雜篩庫、體外的Pul 1-down、體內(nèi)的免疫共沉淀(CoIP)等。酵母雙雜實驗是基于酵母體系在酵母體內(nèi)篩選可能有互作的兩個蛋白的方法。該實驗可以大范圍地篩選可能有直接互作的兩個蛋白。但是，其背景信號較高，會有一些假陽性的情況出現(xiàn)。Pull-down是基于免疫沉淀和Western技術(shù)發(fā)展來的體外或者半體內(nèi)來檢測蛋白互作的ー門技木。該技術(shù)通過抗體的特異性吸附以及互作蛋白之間的相互物理性的結(jié)合來進行互作驗證。該實驗方法相對于酵母雙雜可以大幅降低背景，但是還是不能完全體內(nèi)地來驗證蛋白互作。由Pull-down技術(shù)發(fā)展而來的免疫共沉淀技術(shù)可以在體內(nèi)情況下驗證蛋白互作。 該技術(shù)原理和Pull-down —致,都是利用了免疫沉淀和Western技術(shù)來檢測蛋白互作。但是和Pull-down不同的是免疫共沉淀完全采取了內(nèi)源的組織細胞表達的蛋白。因此，免疫共沉淀的難度更大對抗體的要求更高，但是結(jié)果更可靠。此外，一些其他的實驗方法也可以用來進行蛋白互作之后的功能分析。包括亞細胞定位以及蛋白在植物細胞瞬時表達的酶活測定等。亞細胞定位主要是基于以熒光蛋白為標簽的瞬時轉(zhuǎn)化技木?？梢酝ㄟ^基因槍對洋蔥表皮細胞瞬時轉(zhuǎn)化以及農(nóng)桿菌侵染煙草表皮細胞或者原生質(zhì)體等方法來實現(xiàn)對蛋白的亞細胞定位。在對互作蛋白的功能分析中，采取以⑶S為報道基因，熒光素酶為內(nèi)參通過酶標儀來測定酶活的方法來對互作蛋白的功能分析進行定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于通過酵母雙雜技術(shù)篩選出了ー個對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因，稱為ZmTaxilin。該基因在酵母中和Opaque-2有相互作用。 本發(fā)明的目的之ニ在于提供該基因的克隆方法。本發(fā)明的目的之三在于提供其應(yīng)用價值。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為
ー種對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因，其特征在于該基因為SEQ ID N0:1所示的堿基序列。一種克隆上述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因，其特征在于該方法的具體步驟為
a.將均一化的玉米籽粒cDNA片段與單雜載體pGADI7-Rec連接轉(zhuǎn)化,構(gòu)建館質(zhì)粒,選取其中包含bZIP結(jié)構(gòu)域以及核定位信號又屏蔽了其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域02-2片段，將其連入PGBKT7載體中，構(gòu)建庫質(zhì)粒；
b.將步驟a所得的庫質(zhì)粒以及餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，得到酵母轉(zhuǎn)化子，通過DDO與QDO的篩選，共獲得了疑似陽性克隆，對該克隆質(zhì)粒抽提、測序分析以及回轉(zhuǎn)酵母，篩選出一個與Taxilin同源的基因，即得到對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因。上述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因在對轉(zhuǎn)錄因子下游靶標基因的轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。上述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因在和bZIP類轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互結(jié)合并且改變轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)分布中的應(yīng)用。上述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控bZIP類轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活能力中作用。上述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因在抑制被調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子對下游靶標基因的基因表達中的應(yīng)用。通過RT-PCR與Real-time PCR的方法證明了本發(fā)明的基因ZmTaxilin與Opaque-2的表達具有時空重疊性。通過瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞發(fā)現(xiàn)ZmTaxilin與Opaque-2具有一致的共定位。ZmTaxilin在洋蔥表皮細胞中通過改變Opaque-2的亞細胞定位抑制了Opaque-2的功能。由于Opaque-2是ー個能夠調(diào)控22kD醇溶蛋白啟動子表達的轉(zhuǎn)錄因子。因此，將22kD醇溶蛋白啟動子，Opaque-2, ZmTaxilin以及熒光素酶一同轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細胞中，通過酶標儀分別檢測GUS與熒光素酶的酶活。通過研究和bZIP類轉(zhuǎn)錄因子有互作的蛋白為線索，利用酵母雙雜的方法，以O(shè)paque-2為館質(zhì)粒,篩選出了一個含有Taxilin結(jié)構(gòu)域的蛋白。通過NCBI預(yù)測，該蛋白是一個疑似的細胞骨架蛋白。通過酵母回轉(zhuǎn)驗證以及半體內(nèi)的GST Pull-down實驗,證明了和Opaque-2的互作。此外,通過對ZmTaxilin的時空表達分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白和Opaque-2具有時空重疊性。在對ZmTaxilin調(diào)控Opaque-2的亞細胞定位以及功能分析中發(fā)現(xiàn)，ZmTaxilin在洋蔥表皮細胞中可以改變Opaque-2的亞細胞定位,從而降低Opaque-2對22kD醇溶蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白能夠和bZIP類的轉(zhuǎn)錄因子Opaque-2發(fā)生互作，從而改變了 Opaque-2的亞細胞定位,并且抑制Opaque-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。對于解釋Opaque-2的具體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制具有極為重要的意義，為高品質(zhì)玉米的大規(guī)模生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。本專利適用于一般玉米常規(guī)品種，具體以W22自交系為例說明。


圖I是野生型與Opaque-2突變體雜交的F2代籽粒。黑色箭頭分別指出了由于Opaque-2突變而導(dǎo)致的不透明的Opaque表型籽粒以及野生型的透明的籽粒；
圖2是酵母雙雜篩庫中館質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖。由于Opaque-2本身就是一個轉(zhuǎn)錄因子，具有較強的轉(zhuǎn)錄激活能力，所以利用Opaque-2全長基因篩庫會有很高的自激活背景。因此，根據(jù)Opaque-2的序列特性，將Opaque-2全長分為三段，選擇第二段02_2(即包括了 bZIP結(jié)構(gòu)域又屏蔽了轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)作為餌，和已經(jīng)成功構(gòu)建的庫質(zhì)粒進行篩庫；
圖3是酵母雙雜篩庫獲得的陽性克隆滴板驗證結(jié)果圖，其中3-42即為ZmTaxilin在篩庫中使用的編號，AD+02-2以及3-42+BD都為負對照；
圖4是通過RT PCR與Real-time PCR檢測ZmTaxilin在根、莖、葉、雄花、須、穗與籽粒中的表達，并且還檢測了籽粒授粉后不同時期的表達情況；
圖5是通過半體內(nèi)的GST Pull-down實驗驗證ZmTaxilin與Opaque-2的相互作用。GST +kernel extracts 與單獨的 kernel extracts 為負對照；
圖6是利用基因槍瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞來檢測ZmTaxilin與Opaque-2的亞細胞定
位；
圖7同樣利用基因槍瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞來檢測ZmTaxilin對Opaque-2調(diào)控22kD醇溶蛋白啟動子的影響。其中，ZlC啟動子+YFP、Z1C啟動子+CFP為負對照。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施事例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S. Clark編’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例一利用酵母雙雜實驗篩選和0paque-2有互作的蛋白
首先采取了 SMART方法，獲得了均一化的玉米籽粒cDNA片段。將該cDNA片段與單雜載體pGADI7-Rec連接轉(zhuǎn)化，獲得了約I. OX IO6個克隆。在餌質(zhì)粒的構(gòu)建中，由于全長Opaque-2轉(zhuǎn)錄背景較高，因此選取了包含bZIP結(jié)構(gòu)域以及核定位信號又屏蔽了其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的02-2片段，參見圖2)，將其連入pGBKI7載體中。通過 PEG/LiAc法將構(gòu)建的庫質(zhì)粒以及餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，得到IO6個酵母轉(zhuǎn)化子。通過DDO與QDO的篩選，共獲得了 50個疑似陽性克隆。對這些克隆質(zhì)粒抽提、測序分析以及回轉(zhuǎn)酵母，篩選出一個與Taxilin同源的基因，參見圖3。實施例二 ZmTaxilin和Opaque-2的半體內(nèi)互作驗證
為了進一步驗證ZmTaxilin和Opaque-2的互作,采取了優(yōu)化的GST Pull-down方法。首先利用pGEX-4t-l的大腸桿菌外源表達載體構(gòu)建了含有GST標簽的ZmTaxilin。擴增GST-taxilin的特異引物的堿基序列為
正向引物從 5'端至 3'端為GCGAAITCATGGAAGGCTCGCCGGTGGC ( + )
反向引物從 5'端至 3'端為GCCCCGGGTTAAGATTCTTGACTTGTCG (-)
將構(gòu)建完的GST-taxilin轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌外源表達菌株中進行誘導(dǎo)。經(jīng)過誘導(dǎo)條件的摸索，確定最佳的誘導(dǎo)條件為30攝氏度，ImM IPTG在OD為0. 6時誘導(dǎo)6小時。利用超聲破碎的方法裂解大腸桿菌獲得含有GST-taxilin的總蛋白。Pull-down 的過程是基于PIERCE 的GST Pull-down試劑盒(ProFound Pull-DownGST Protein:Protein Interaction Kit)來進行的。首先利用已去頭的槍頭吸取50 u I含有谷胱甘肽的瓊脂糖珠子(Immobilized Glutathione)至離心柱中，利用事先配置的緩沖液(ProFound 裂解液TBS=1:1)洗滌5遍，每遍800 y I。其次，在含有GST-taxilin的總蛋白中加入等量的ProFound 裂解液,取800 ii I的總蛋白至離心柱中，使其與珠子一起4°C孵育I小時。I小時后首先同樣利用800 u I緩沖液清洗珠子3遍，隨后用自配的蛋白抽提buffer清洗珠子3遍。保存于4°C備用。蛋白抽提buffer的配方為
25mM Tris-Cl pH7. 4-7. 5 IOmM EDTA pH7. 4-7. 5 120mM NaCl
0. 2% NP-40ImM PMSF
0.1%蛋白酶抑制劑(Sigma)
同樣利用蛋白抽提buffer抽提授粉后15天(15DAP)的玉米野生型籽粒。抽提方法為取5-6顆15DAP的玉米野生型籽粒液氮研磨，加入800 U I的蛋白抽提buffer。冰上靜置30分鐘后，4°C離心取上清，即為玉米籽?？偟鞍兹芤?。將獲得的總蛋白加入已經(jīng)處理的珠子中，使總蛋白與珠子在4°C孵育2小時。2小時后離心回收珠子，用蛋白抽提buffer清洗珠子5遍去除非特異結(jié)合的蛋白。將清洗干凈的珠子按照說明書的指示加入用蛋白抽提buffer溶解的谷胱甘肽溶液，洗脫結(jié)合在珠子上的蛋白，離心收集蛋白溶液用于Western檢測。Western使用的抗體分別為GST抗體(Abcam)以及02抗體(自備)。經(jīng)過GST Pull-down實驗發(fā)現(xiàn)，GST-Taxilin可以在體外非常穩(wěn)定地和Opaque-2發(fā)生直接的結(jié)合。由于我們在Pull-down過程中，使用的是玉米籽粒內(nèi)源的未變性的0paque-2復(fù)合物代替了大腸桿菌外源表達的Opaque-2，因此反應(yīng)條件更接近體內(nèi)的實際情況，結(jié)果更為可靠。實施例三ZmTaxilin在玉米組織中的時空表達分析
首先收取玉米各組織器官的材料，包括根、莖、葉、雄穗、須、雌穗以及從3DAP至36DAP的籽粒，抽提并且反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。以ZmUBQ(GenBank Accession BT018032)為內(nèi)參，對所有反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行定量PCR ( (MJ Research)。以玉米籽粒授粉后18天(18DAP)的表達量為參照(設(shè)定為I )，對其他的樣品進行相對表達分析。定量PCR中使用到的ZmTaxi I in以及ZmUBQ的弓丨物堿基序列為ZmTaxilin :正向引物從 5'端至 3'端為TCAACCTACCGTCCGTCTCAG ( + )
反向引物從 5'端至 3'端為GTAGGAATGCACCACTAGGCTCT (-)
ZmUBQ :正向引物從 5'端至 3'端為CTGGTGCCCTCTCCATATGG ( + )
反向引物從 5'端至 3'端為CAACACTGACACGACTCATGACA (-)
經(jīng)過定量分析發(fā)現(xiàn)，ZmTaxilin雖然在所有組織中均有表達，但是在籽粒胚乳約授粉后10天左右的時期具有表達高峰。因此，可以認為，ZmTaxilin與Opaque-2在表達的時間和空間上具有重疊性，參見圖4。實施例四ZmTaxilin和Opaque-2在洋蔥表皮細胞中的單獨定位與共定位
將ZmTaxilin和Opaque-2基因全長通過GATEWAY體系分別連入pB7CWG2和pB7YWG2載體中，使其N端帶有熒光蛋白標簽。載體鑒定正確后分別大抽質(zhì)粒，并且將質(zhì)粒濃度稀釋至Li I U g/U I。利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的方法通過Biolistic PDS-1000/He Gene GunSystem (Bio-Rad)基因槍將這兩個載體分別打入已經(jīng)在MS固體培養(yǎng)基中25°C暗培養(yǎng)至少8小時的洋蔥表皮細胞中。MS固體培養(yǎng)基配方為
MS salt 4.33g/L
鹿糖30g/L 瓊脂粉7g/L
用 1M/L KOH 調(diào) pH 至 5. 8
轟擊完畢后，繼續(xù)25°C暗培養(yǎng)I天。將洋蔥表皮細胞在載玻片中制備成樣本在共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 710)中觀察ZmTaxilin和Opaque-2的單獨定位與共定位。在共聚焦顯微鏡的觀察中，采用了 433nm激發(fā)波長以及458nm發(fā)射波長來檢測CFP的信號，采用了 513nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長來檢測YFP的信號。在共聚焦顯微鏡的觀察過程中發(fā)現(xiàn)，YFP-02主要定位在細胞核，但在細胞質(zhì)中有一定彌散分布(圖6A)。相比于YFP-02，CFP-Taxilin并沒有定位于細胞核，并在細胞核附近聚集分布(圖6B)。從這兩個蛋白單獨定位的結(jié)果中可以很明顯的觀察到，YFP-02和CFP-Taxilin在單獨表達的時候具有各自不同的定位。而當這兩個蛋白共表達的時候，YFP-02非但和CFP-Taxilin有非常一致的共定位，而且共定位信號類似于CFP — Taxilin單獨定位的部位(圖6C)。同時，原本主要定位于細胞核，并且在細胞質(zhì)中呈現(xiàn)彌散分布的YFP-02主要在細胞質(zhì)中表達。因此，可以認為，CFP-Taxilin可以改變YFP-02的定位。實施例五在洋蔥表皮細胞中檢測ZmTaxilin對Opaque-2調(diào)控22kD醇溶蛋白啟動子的影響
由于在實施例四中發(fā)現(xiàn)CFP-Taxilin可以改變YFP-02的定位，為了查清ZmTaxilin在Opaque-2調(diào)控22kD醇溶蛋白的過程中起到了什么作用。我們利用洋蔥活細胞系統(tǒng)來檢測ZmTaxilin的功能。為了和實施例四的結(jié)果具有可比較性，因此繼續(xù)選擇CFP-Taxilin和YFP-02這兩個載體，并且重新構(gòu)建pUC18-P22kD:⑶S和pUC18_35S: Luciferase載體。pUC18-P22kD:⑶S載體中的22kD醇溶蛋白啟動子包含了 I個Prolamin box和3個Opaque-2結(jié)合位點。pUC18_P22kD:⑶S構(gòu)建的引物堿基序列為
正向引物從 5’ 至 3’ 端為GCCCCGGGGGAITTCAATTAGTCTATA 反向引物從 5’ 至 3’ 端為GCGAAITCTGTTGTTAGGTTGITGCTA
此外，選擇熒光素酶作為該實驗體系的內(nèi)參，將熒光素酶基因全長連入pUC18-35S中。pUC18_35S:Luciferase構(gòu)建的引物喊基序列為正向引物從 5’ 至 3’ 端為GCGGATCCATGGAAGACGCCAAAAACAT 反向引物從 5’ 至 3’ 端為GCGAAITCTTACACGGCGATCTTTCCG
載體構(gòu)建完成后，大抽質(zhì)粒并且打基因槍。步驟同亞細胞定位。培養(yǎng)一天后，進行酶活測定。酶活測定步驟為
I.將已培養(yǎng)的洋蔥表皮細胞從MS培養(yǎng)基中小心取出放入I. 5ml離心管中，并且液氮研磨。2.加入⑶S裂解緩沖液，并且12000rpm 4度離心5分鐘，取上清；
GUS裂解緩沖液配方為
IOOmM 磷酸鉀 pH7.8 ImM EDTA 1% Triton X-100 10%甘油
7mM 巰基乙醇
3.BCA定量；
4.取50ill上清加入到180 u I經(jīng)過37°C預(yù)熱的⑶S活性檢測液(2mM 4-MUG)中，迅速混勻，并立刻取出IOiU加入到190 ill反應(yīng)終止液(0. 2M Na2C03)中，將該管作為酶促反應(yīng)的0點，其余的反應(yīng)液繼續(xù)37°C孵育，并且計時；
5.⑶S活性檢測液(2mM4-MUG)配方為將50mg 4-MUG溶解到72ml⑶S酶提取液中，配制成2mM工作液。6.在10分鐘，30分鐘，60分鐘時分別取出10 U I反應(yīng)液，轉(zhuǎn)入190 U I反應(yīng)終止
液中；
7.用酶標儀在365nm激發(fā)波長，455nm發(fā)射波長下，測定不同時間點的GUS吸光度；
8.在測定熒光素酶活性的實驗中，首先配制熒光素酶反應(yīng)緩沖液，配方為
20mM Tricine pH7. 8
5mM MgC12
0.ImM EDTA
3.3mM DTT
0.27mM 輔酶 A500mM熒光素500mM ATP
9.取10 ill蛋白樣品加入190 ill熒光素酶反應(yīng)緩沖液中，用酶標儀測定不同樣品的熒光素酶吸光度。 通過3次重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，ZmTaxilin本身不具有對祀標啟動子的激活活性,但是可以抑制Opaque-2對祀標啟動子(22kD醇溶蛋白)的轉(zhuǎn)錄激活功能。綜合在實施例四中CFP-Taxi I in可以改變YFP-02的定位的結(jié)果，我們得出以下結(jié)論=ZmTaxi I in可以通過改變bZIP類轉(zhuǎn)錄因子Opaque-2的亞細胞定位，從而起到抑制下游被調(diào)控基因(22kD醇溶蛋白)啟動子的表達。
序列表
<110>上海大學
〈120〉對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因、其克隆方法及其應(yīng)用
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211〉 1278
〈212〉 DNA
〈213〉基因序列
〈400〉 I
Atgga aggct cgccg gtggc gcgcc tcccg gaggc taatt ctctc cccga cggct tcgtc60
cccga cagcg agagc tcaga cacgg acgcg gctcc tccct cctcc gcgcc catag ttgac120
gatgc aatcg actcc gatag tcccg acgcc accaa ccccg gtggt gagga aaccc taagt180
gatcc ctccc ttccc gcgtc caccg ccgaa gatgc ctcct cagcc gccgc tgctg aagca240
ttgga cacac tttgt ctgga cgttg ttgcg gatcc ggagc gcgct ctagg ggagc acgga300
cccac cactg ctgca agagg tgaag gatcc ttgaa ggaaa atcgt gcatc agagc aagtg360
ggcgc tccaa gtgat caaaa ggtgg tcaag gggag cggtg agcca aaacg caagg tcatc420
aagca tagca agctt gagaa ggaca aagag ttatt tcaac tagcc cagca atacc acaaa480
gtggt tgcag aaagg gatca agcca ttgca gtcaa agata gacta gaatc tcttt gtagg540
gaatt tcagc gtcaa aacaa aatgc taaag gaaga gtgcc aaagg gtatc gacag aggga600
cagaa catgc gtacg gaatt gtctg aaaaa tttga tcatg ccata aaggg tgtca gtgcc660
aaact tgagg agcag agagt tgagc gcatt tctca gctag aagag aacaa tacgt tgaga720
agtaa actga aagac cttgc tgatc aatat aacat tactc agcag aaata tgctc accaa780
ttgaa agaga aaatg ctgga acttg aactt gctga tctga gactt caaca acatc aagag840
aaggc tgctc aggaa catac acaaa tgcag ttgta tgctg aacaa gtttc tcagc ttatg900
actac tgaga agaac ctgcg gttgc aacta gcttc tgacg gggaa agatt tcagc acttt960
cagga tgcct tgtca aaaag caatg aagtc tttga aactt acaag cagga gatgg aaaag1020
atgat ttcag tgata aagaa tctta agaag gagaa cgaat ttctg aaggg aaaat gtgag080
aactc agata ttgct attgt gaagc tcatt gaaga gcgtg agcta acaaa gaagc aaata1140
gagaa attga aaaat caaag ggaga agctc gaatc cctgt gtcga acact acagg cagaa1200
aggaa acaag gcccc tccgc cagta ttcca gatgc ccctt ctagc caaga agtgt cagcg1260 acaag tcaag aatct taa1278
權(quán)利要求
1.ー種對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因，其特征在于該基因為SEQ ID N0:1所不的喊基序列。
2.一種克隆根據(jù)權(quán)利要求I所述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因，其特征在于該方法的具體步驟為 將均一化的玉米籽粒cDNA片段與單雜載體pGADH-Rec連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建餌質(zhì)粒，選取其中包含bZIP結(jié)構(gòu)域以及核定位信號又屏蔽了其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域02-2片段，將其連入PGBKT7載體中，構(gòu)建庫質(zhì)粒； b.將步驟a所得的庫質(zhì)粒以及餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，得到酵母轉(zhuǎn)化子，通過DDO與QDO的篩選，共獲得了疑似陽性克隆，對該克隆 質(zhì)粒抽提、測序分析以及回轉(zhuǎn)酵母，篩選出一個與Taxilin同源的基因，即得到對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因。
3.ー種根據(jù)權(quán)利要求I所述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因在對轉(zhuǎn)錄因子下游靶標基因的轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。
4.ー種根據(jù)權(quán)利要求I所述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因在和bZIP類轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互結(jié)合并且改變轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)分布中的應(yīng)用。
5.ー種根據(jù)權(quán)利要求I所述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控bZIP類轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活能力中作用。
6.ー種根據(jù)權(quán)利要求I所述的對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因在抑制被調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子對下游靶標基因的基因表達中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用的基因、其克隆方法及其應(yīng)用。該基因為SEQIDNO1所示的堿基序列。該序列可以和bZIP類轉(zhuǎn)錄因子(如Opaque-2)發(fā)生蛋白互作，和互作轉(zhuǎn)錄因子(以O(shè)paque-2為例)具有時空表達重疊性；在ZmTaxilin和互作轉(zhuǎn)錄因子(以O(shè)paque-2為例)的亞細胞定位以及共定位中發(fā)現(xiàn)，ZmTaxilin可以明顯改變互作轉(zhuǎn)錄因子(以O(shè)paque－2為例)的亞細胞定位；在植物活細胞體系中進行轉(zhuǎn)錄激活活性檢測，發(fā)現(xiàn)ZmTaxilin可以抑制互作轉(zhuǎn)錄因子(以O(shè)paque-2為例)對靶標基因(以22kD醇溶蛋白基因為例)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
文檔編號C12N15/29GK102653766SQ20121013308
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者喬禎逸, 宋任濤, 張男, 梁錚, 許政暟 申請人:上海大學