專利名稱：基因突變檢測用探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因突變檢測用探針。
背景技術(shù)：
“基因多態(tài)性”是指編碼基因的堿基序列中的堿基變?yōu)榕c某個群體的大多數(shù)的性狀不同的喊基，例如廣生了單喊基取代、缺失、插入、基因融合等基因結(jié)構(gòu)(喊基序列)的差
巳另一方面，“基因多態(tài)性”是指作為“基因突變”的一部分的、某個群體中頻率最高的突變或者等位基因(allele)為99%以下的狀態(tài)，換言之，是指頻率低的突變和/或等位基因的合計頻率為1%以上的狀態(tài)。該1%—值雖簡單，但仍具意義。每代產(chǎn)生的大多數(shù)新的突變通過自然選擇而從群體中被去除，因此可在邏輯上計算其平衡頻率。將比該平衡頻率高的值、1%作為“多態(tài)性”的基準(zhǔn)。即，被視為多態(tài)性現(xiàn)象是指由于某種機(jī)理而導(dǎo)致群體中這些突變的頻率變高并世代被維持的意思。已被指出基因突變與各種疾病的罹患率和/或由于施藥而產(chǎn)生副作用的頻率相關(guān)聯(lián)，從而認(rèn)為通過檢測基因多態(tài)性，能夠預(yù)測各種疾病發(fā)生頻率和/或耐藥性等。因此，人們期待正確且短時間、低成本地測定基因突變的方法?；蚨鄳B(tài)性和基因突變的種類中有由于堿基序列中的一個堿基被取代而產(chǎn)生的單堿基取代、缺失一個以上的堿基的缺失型突變、插入一個以上的堿基的插入型突變、或者基因融合等。以下，將基因多態(tài)性和基因突變統(tǒng)稱為基因突變。目前，已知有下述測定基因突變的方法將含有突變的區(qū)域用PCR法擴(kuò)增之后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針與靶標(biāo)核酸雜交，測定熒光染料的發(fā)光的減少量，并基于熔解曲線分析的結(jié)果來分析堿基序列的突變(參見特開2002-119291號公報)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題然而，為了通過上述使用核酸探針的方法來檢測基因突變，需要使用具有適合于每個突變的序列的核酸探針。另外，在使用核酸探針進(jìn)行熔解曲線分析時，如果核酸探針內(nèi) 存在作為檢測對象的基因突變之外的突變，則由于受到基因突變檢測對象之外的基因突變的影響，熔解溫度(Tm值)產(chǎn)生偏差，因此難以特異性檢測作為檢測對象的基因突變。根據(jù)這些現(xiàn)狀，人們期待進(jìn)一步開發(fā)用于即使編碼基因的堿基序列含有多個基因突變也不受基因突變檢測對象之外的基因突變的影響而精度良好地檢測作為檢測對象的特定基因突變的技術(shù)。本發(fā)明要解決的問題在于，提供一種能夠從編碼基因的堿基序列中包含的多個基因突變中不受非目標(biāo)基因突變的堿基型的影響地僅特異性地檢測出作為檢測對象的特定的基因突變的基因突變檢測用探針，以及使用該基因突變檢測用探針的基因突變檢測方法。另外，本發(fā)明要解決的問題在于，提供一種使用了該基因突變檢測用探針的基因突變檢測用試劑盒。用于解決問題的手段本發(fā)明如下所述?！?> 一種基因突變檢測用探針，所述探針包括從包括下述PU Pl-U ΡΓ及ΡΓ -I的組中選擇的至少一種寡核苷酸，用于檢測對含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因進(jìn)行編碼的堿基序列中的所述目標(biāo)基因突變(PD寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非 互補(bǔ)的堿基，而且其相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分互補(bǔ)的堿基序列具有至少80%以上的同一性；(Pl-I)寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基，而且其與和編碼所述對象基因的堿基序列具有相同堿基序列的寡核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；(ΡΓ )寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基，而且其相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分具有至少80 %以上的同一性；以及(ΡΓ -I)寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基，而且其與具有和編碼所述對象基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。<2>根據(jù)〈1>所述的基因突變檢測用探針，其中，所述基因突變檢測用探針滿足下述(a)至(f)中的任一條件(a)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為A和T中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和T中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為C或G ;(b)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為C和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為C和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或T ;(C)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為A和C中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和C中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為T或G ;(d)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為從A和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為T或C ;(e)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為T和C中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為T和C中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基所述非互補(bǔ)的堿基為T或C，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或G ;(f)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為T和G中的一者，并且所述 非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為T和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基為T或G，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或C。<3>根據(jù)〈1>或〈2>所述的基因突變檢測用探針，其中，所述寡核苷酸為熒光標(biāo)記寡核苷酸?！?>根據(jù)〈3>所述的基因突變檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的3’末端或5’末端的堿基為胞嘧啶，該胞嘧啶用熒光染料標(biāo)記。<5>根據(jù)〈3>或〈4>所述的基因突變檢測用探針，其中所述熒光標(biāo)記寡核苷酸位于從3’末端或者5’末端起數(shù)第I 3位的任意位置。<6>根據(jù)〈1> 〈5>中任一項所述的基因突變檢測用探針，其中，所述基因突變檢測用探針為用于分析熔解曲線的探針。<7>根據(jù)〈3> 〈6>中任一項所述的基因突變檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少或增加。<8>根據(jù)〈3> 〈7>中任一項所述的基因突變檢測用探針，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少?！?> 一種基因突變檢測方法，其使用〈1> 〈8>中任一項所述的基因突變檢測用探針來檢測作為檢測對象的突變目標(biāo)基因突變。<10> 一種目標(biāo)基因突變檢測方法，包括(I)使〈3> 〈8>中任一項所述的基因突變檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸來獲得雜交體；(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動；(III)基于所述熒光信號的變動來獲得雜交體的解離溫度，即Tm值；(IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中目標(biāo)基因突變的存在。<11>根據(jù)〈10>所述的目標(biāo)基因突變檢測方法，還包括在獲得所述(I)的雜交體之前或者與獲得所述(I)的雜交體的同時擴(kuò)增核酸。<12> 一種基因突變檢測用試劑盒，包含〈1> 〈8>中任一項所述的基因突變檢測用探針。<13>根據(jù)〈12>所述的基因突變檢測用試劑盒，還包含引物，所述引物能夠擴(kuò)增具有與<1> 〈8>中任一項所述的基因突變檢測用探針雜交的區(qū)域的堿基序列。發(fā)明效果通過本發(fā)明，能夠提供即使編碼基因的堿基序列含有多個基因突變也不受基因突變檢測對象之外的基因突變的影響而特異性地檢測作為檢測對象的特定的基因突變的基因突變檢測用探針、以及使用該探針的基因突變檢測方法。另外，通過本發(fā)明，能夠提供使用了該基因突變檢測用探針的基因突變檢測用試劑盒。


圖I的(A)為核酸混合物的熔解曲線的示例，圖I的(B)為微分熔解曲線的示例； 圖2的㈧ ⑵為本發(fā)明的實施例I涉及的試樣的微分熔解曲線；圖3的㈧ ⑶為本發(fā)明的實施例2涉及的試樣的微分熔解曲線；圖4的㈧ ⑵為本發(fā)明的比較例I涉及的試樣的微分熔解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針包括從包括PU Pl-U ΡΓ及ΡΓ -I的組中選擇的至少一種寡核苷酸，用于檢測對含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因進(jìn)行編碼的喊基序列中的該目標(biāo)基因突變。由此，即使對基因進(jìn)行編碼的堿基序列含有多個基因突變，本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針也不受檢測對象之外的基因突變的影響而特異性地檢測作為檢測對象的特定的基因突變。本發(fā)明涉及的基因突變檢測方法包括使用至少一種用于檢測所述基因突變的基因突變檢測用探針，即使編碼基因的堿基序列含有多個基因突變，也不受基因突變檢測對象之外的基因突變的影響地進(jìn)行檢測。本發(fā)明涉及的基因突變檢測用試劑盒含有用于檢測目標(biāo)基因突變的所述基因突變檢測用探針。在本發(fā)明中，關(guān)于作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、基因突變檢測用探針或者引物的每個的堿基序列，基于它們的相互互補(bǔ)的關(guān)系所記述的事項，只要不特別指出，也分別適用于其互補(bǔ)堿基序列。在將特定堿基序列的說明適用于其互補(bǔ)堿基序列時，對由該特定的堿基序列識別的堿基序列的說明在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識的范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)如下地應(yīng)用視為由該特定堿基序列進(jìn)行的識別被替換成該特定堿基序列的互補(bǔ)堿基序列進(jìn)行的識別。在本發(fā)明中，“Tm值”是雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度由于雙鏈核苷酸的完全解離而導(dǎo)致總吸光度增加50%時的溫度。S卩，當(dāng)加熱含有雙鏈核酸、例如雙鏈DNA的溶液時，260nm處的吸光度逐漸上升。這是因為雙鏈DNA中的雙鏈間的氫鍵通過加熱而斷裂，解離(DNA的熔解)成單鏈DNA。并且，當(dāng)雙鏈DNA全部解離形成單鏈DNA時，其吸光度顯示加熱開始時的吸光度(當(dāng)全部DNA為雙鏈DNA的形式時的吸光度)的約I. 5倍左右，由此能夠判斷熔解完成。Tm值基于該現(xiàn)象來設(shè)定。在本發(fā)明中，關(guān)于寡核苷酸的序列，當(dāng)稱為“從3’末端起數(shù)的第I 3位”時，假定寡核苷酸鏈的3’末端的堿基為從3’末端起第I位堿基。同樣地，當(dāng)稱為“從5’末端起數(shù)第I 3位”時，假定寡核苷酸鏈的5’末端的堿基為從5’末端起第I位堿基。在本說明書中，“步驟” 一詞不僅包含獨立的步驟，也包含哪些不能與其他的步驟明確區(qū)別但達(dá)到了本步驟預(yù)期的效果的過程。在本說明書中，使用“ ”表示的數(shù)值范圍表示將“ ”前后記載的數(shù)值分別作為最小值和最大值包含的范圍。另外，在本發(fā)明中，組成物中的各成分的量在組成物中存在多種相當(dāng)于各成分的物質(zhì)的情況下只要不特別指出就是指組成物中存在的該多種物質(zhì)的合計量。下面說明本發(fā)明。 <基因突變檢測用探針>本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針包括從包括下述PU Pl-U ΡΓ和ΡΓ -I的組中選擇的至少一種寡核苷酸，并用于檢測對含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因進(jìn)行編碼的堿基序列中的該目標(biāo)基因突變。由此，即使編碼基因的堿基序列含有多個基因突變，本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針也不受檢測對象之外的基因突變的影響地特異性地檢測作為檢測對象的特定的基因突變。(PD寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基，而且其相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分互補(bǔ)的堿基序列具有至少80%以上的同一性；(Pl-I)寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基，而且其與和編碼所述對象基因的堿基序列具有相同堿基序列的寡核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；(ΡΓ )寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基，而且其相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分具有至少80 %以上的同一性；以及(ΡΓ -I)寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基，而且其與具有和編碼所述對象基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。本發(fā)明中“對應(yīng)于目標(biāo)基因突變的堿基位置”是指與當(dāng)寡核苷酸的堿基序列與含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的試樣堿基序列以使它們之間最匹配的方式進(jìn)行比對時，寡核苷酸中與試樣堿基序列中的目標(biāo)基因突變的堿基位置相對應(yīng)的堿基位置。腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)分別形成氫鍵。AT對形成兩個氫鍵，而GC對形成三個氫鍵。也就是說在“A-T之間”、“G-C之間”形成氫鍵，并維持雙螺旋結(jié)構(gòu)。在這些堿基之外的堿基的組合中不能形成足以維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵。例如，在試樣核酸中所含的非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的野生型和突變型的堿基的組合為A和T的組合、并且基因突變檢測探針中與非目標(biāo)基因突變的野生型和突變型均不互補(bǔ)的堿基為C或G的情況下，則非目標(biāo)基因突變的突變型堿基和非目標(biāo)基因突變中的野生型堿基(從A和T中選擇的堿基)與跟非目標(biāo)基因突變中的突變型堿基和非目標(biāo)基因突變中的野生型堿基均非互補(bǔ)的堿基(C或G)不形成氫鍵，因此，該基因突變檢測用探針的Tm值不受非目標(biāo)基因突變的影響。另一方面，若將基因突變檢測用探針中與非目標(biāo)基因突變的野生型和突變型均不互補(bǔ)堿基替換成A，則該堿基在非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基為A時試樣核酸中的非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基不形成氫鍵,而在非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基為T的情況下形成氫鍵。在這種狀況下，該基因突變檢測用 探針的Tm值不僅受到目標(biāo)基因突變的影響，而且也受到非目標(biāo)基因突變的影響，從而在使用該本發(fā)明的范圍之外的基因突變檢測用探針的情況下，不能適當(dāng)?shù)貦z測目標(biāo)基因突變的狀態(tài)。如此，在編碼對象基因的堿基序列中所含的多個基因突變中使用與和該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列具有同源性的基因突變檢測用探針來檢測目標(biāo)基因突變的情況下，通過將探針上對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基設(shè)為與該非目標(biāo)基因突變的正常型和突變型中任何一者均不結(jié)合的堿基(非互補(bǔ)的堿基)，能夠避免受到非目標(biāo)基因突變的影響。本發(fā)明涉及的包括所述(PD或(Pl-I)寡核苷酸的基因突變檢測用探針能夠不受非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基型的影響而特異性地檢測目標(biāo)基因突變。同樣地，在編碼對象基因的堿基序列中所含的多個基因突變中使用相對于與該堿基序列相同的堿基序列具有同源性的基因突變檢測用探針來檢測目標(biāo)基因突變的情況下，通過將探針上對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基設(shè)為與該非目標(biāo)基因突變的正常型和突變型中任何一者均不同的堿基(不同的堿基)，能夠避免受到非目標(biāo)基因突變的影響。本發(fā)明涉及的包括所述(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸的基因突變檢測用探針能夠不受非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基型的影響而特異性地檢測目標(biāo)基因突變。本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針能夠識別包括單堿基取代型、缺失型以及插入型在內(nèi)的突變中的任意一種突變。其中，從檢測靈敏度的觀點來說，本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針作為識別單堿基取代型的突變(單堿基突變)的基因突變檢測用探針尤其有用。本發(fā)明涉及的(Pl)或(P1-1)寡核苷酸是除了對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置處之外，相對于與編碼含有目標(biāo)基因突變的基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列具有同源性的寡核苷酸。另一方面，(Pr )或(ΡΓ -I)的寡核苷酸為除了對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置處之外，相對于與編碼含有目標(biāo)基因突變的基因的堿基序列相同的堿基序列具有同源性的寡核苷酸。公知的所有基因均可以應(yīng)用于本發(fā)明涉及的對象基因。另外，本發(fā)明的對象基因中含有結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)中的某個。在本說明書中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)是指廣泛存在于基因信號序列的5’上游區(qū)域(也可以存在于第一內(nèi)含子)的序列，是在RNA聚合酶從基因轉(zhuǎn)錄RNA時控制其轉(zhuǎn)錄的序列。另外，在結(jié)構(gòu)基因中，外顯子的位點或內(nèi)含子的位點可以存在基因突變。在更具體的實施例中，基因突變也可以存在于外顯子的位點。在本發(fā)明中“具有同源性”例如可以是編碼本發(fā)明的基因突變檢測用探針的堿基序列和“與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分互補(bǔ)的堿基序列”之間具有80 % 100%的同源性的寡核苷酸。另外，從檢測靈敏度的觀點來說，可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或者99%以上的同一性。

如果同源性為80%以上，則針對含有包含作為檢測對象的目標(biāo)基因突變的對象基因的試樣核酸的檢測靈敏度變得良好。在一實施例中，根據(jù)本發(fā)明的Pl或Pl-I寡核苷酸除了對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置、以及可選地除了對應(yīng)于目標(biāo)基因突變的堿基位置之外，與編碼含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因的部分堿基序列互補(bǔ)(完全互補(bǔ))。在另一實施例中，根據(jù)本發(fā)明的Pl或Pl-I寡核苷酸除了對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置、以及可選地除了對應(yīng)于目標(biāo)基因突變的堿基位置之外，與編碼含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因的全部堿基序列互補(bǔ)。在一實施例中，根據(jù)本發(fā)明的Ρ?；颚宝?-I寡核苷酸除了對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置、以及可選地除了對應(yīng)于目標(biāo)基因突變的堿基位置之外，與編碼含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因的部分堿基序列相同。在另一實施例中，根據(jù)本發(fā)明的Ρ?；颚宝?-I寡核苷酸除了對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置、以及可選地除了對應(yīng)于目標(biāo)基因突變的堿基位置之外，與編碼含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因的全部堿基序列相同。下面說明本發(fā)明中的“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”。雜交可以根據(jù)公知的方法或者基于公知方法的方法，例如可以根據(jù)MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進(jìn)行。該文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書中。嚴(yán)謹(jǐn)條件是指發(fā)生特異性雜交而形成雜交體但非特異性雜交不發(fā)生的條件。典型的嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，例如可以舉出在鉀濃度為約25mM 約50mM、以及鎂濃度為約I. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。作為本發(fā)明的條件的示例，例如可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KC1、以及I. 5mM的MgCl2下進(jìn)行雜交的條件，但是不限于此。此外，嚴(yán)謹(jǐn)條件被記載在 Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press,2001)中。該文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等來容易地選擇上述條件。以下說明本發(fā)明涉及的(PD、(Pl-I)、(ΡΓ)和(ΡΓ-l)的寡核苷酸。根據(jù)需要，以序列編號I或序列編號2所示的堿基序列為例進(jìn)行說明，但是本發(fā)明涉及的(Pl)、(Ρ1-1)、(Pr )和(ργ -D的寡核苷酸不限于此。序列編號I所示的堿基序列為對藥物代謝酶CYP3A4的基因突變(CYP3A4*lBrs2740574)進(jìn)行編碼的堿基序列。對CYP3A4進(jìn)行編碼的CYP3A4基因位于人的第7染色體。CYP3A4基因突變例如被報告與免疫抑制劑他克莫司(TaciOlimus)等藥物代謝相關(guān)聯(lián)(Clin. Pharmacol. Ther.，2006 年，Vol. 80, p. 179-191)。因此，CYP3A4 基因的突變的檢測結(jié)果在選擇更有效的疾病治療方法時等是極其重要的信息。這里，作為CYP3A4基因突變的rs2740574在序列編號I的第501位堿基處具有突變喊基。該 rs 編號表不 National Center for Biotechnology Information 的 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(//www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/)的登錄編號(以下相同)。在 CYP3A4 基因的野生型中，與序列編號I所示的堿基序列的第501位對應(yīng)的堿基為A (腺嘌呤)，在突變型中突變?yōu)镚 (鳥嘌呤)。序列編號2所示的堿基序列示出了用于檢測序列編號I所示的堿基序列中第501位的目標(biāo)基因突變的、本發(fā)明涉及的基因突變檢測用探針的示例。 本發(fā)明中的、編碼對象基因的堿基序列含有多個基因突變。具體地，編碼所述對象基因的堿基序列含有兩個以上的基因突變，例如可以含有三個基因突變、四個基因突變。在編碼對象基因的堿基序列中所含的多個基因突變中，可以根據(jù)需要從編碼對象基因的堿基序列中適當(dāng)選擇目標(biāo)基因突變。例如，在編碼序列編號I的CYP3A4基因的堿基序列中，可以將第501位的基因突變選擇為作為檢測對象的目標(biāo)基因突變。因此，以序列編號I為例，本發(fā)明涉及的“目標(biāo)基因突變的突變型堿基”為A(腺嘌呤)或G(鳥嘌呤)，本發(fā)明涉及的“目標(biāo)基因突變的野生型堿基”為A(腺嘌呤)或G(鳥嘌呤)中的另一者。在(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸中，以序列編號I所示的堿基序列為例，T (胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)對應(yīng)于“對應(yīng)于目標(biāo)基因突變的堿基位置處的、與目標(biāo)基因突變的堿基的野生型和突變型中任意一者互補(bǔ)的堿基”。在(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸的示例中，以序列編號I所示的堿基序列為例，序列編號I所示的堿基序列的第507位的R對應(yīng)于“非目標(biāo)基因突變的突變型堿基”。第507位堿基位置處，R在野生型中為A(腺嘌呤)，在突變型中突變成了 G(鳥嘌呤)。在(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸中，以序列編號I所示的堿基序列為例，A(腺嘌呤)或G(鳥嘌呤)對應(yīng)于“對應(yīng)于非目標(biāo)基因突變的堿基位置處的、與非目標(biāo)基因突變的堿基的野生型和突變型中任何一者均非互補(bǔ)的堿基”。在(Pl)寡核苷酸中，以序列編號I所示的堿基序列為例，與由編碼CYP3A4基因的堿基序列中的第496位 第516位的堿基形成的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列對應(yīng)于“與編碼所述對象基因的喊基序列互補(bǔ)的喊基序列”。在(Pl-I)寡核苷酸中，以序列編號I所示的堿基序列為例，具有與由編碼CYP3A4基因的堿基序列中的第496位 第516位的堿基形成的堿基序列相同堿基序列的寡核苷酸對應(yīng)于“與編碼所述對象基因的堿基序列具有相同堿基序列的寡核苷酸”。在(ΡΓ)或(ΡΓ-l)寡核苷酸中，以序列編號I所示的堿基序列為例，A(腺嘌呤)或G(鳥嘌呤)對應(yīng)于“與目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿
其”在(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸中，以序列編號I所示的堿基序列為例，T (胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)對應(yīng)于“與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基”。關(guān)于(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸的與(Pl)或(Pl-I)寡核苷酸共同的除上述以外的方面，適用對所述(PD或(Pl-I)寡核苷酸描述的所有事項。
此外，目標(biāo)基因突變的堿基位置處的堿基是一個野生型的堿基和一個突變型的堿基的情況、是一個野生型的堿基和兩個突變型的堿基的情況、以及是一個野生型的堿基和三個突變型的堿基的情況中的任意情況均被包括在本發(fā)明的“目標(biāo)基因突變”中。本發(fā)明中的(PI)、(Pl-I)、(ΡΓ )或(ΡΓ -I)寡核苷酸可以舉出滿足下述(a)至(f)中任一關(guān)系的寡核苷酸。(a)在所述非目標(biāo)基因變異為從A和T中選擇的堿基的情況下，所述非互補(bǔ)的堿基或所述不同的堿基為C或G。即，在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為A和T中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和T中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為C或G。(b)在所述非目標(biāo)基因變異為從C和G中選擇的堿基的情況下，所述非互補(bǔ)的堿基 或所述不同的堿基為A或T。即，在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為C和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為C和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或T。(C)在所述非目標(biāo)基因變異為從A和C中選擇的堿基的情況下，所述非互補(bǔ)的堿基為A或C，所述不同的堿基為T或G。在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為A和C中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和C中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為T或G。(d)在所述非目標(biāo)基因變異為從A至G中選擇的堿基的情況下，所述非互補(bǔ)的堿基為A或G，所述不同的堿基為T或C。在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為從A和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為T或C。(e)在所述非目標(biāo)基因變異為從T和C中選擇的堿基的情況下，所述非互補(bǔ)的堿基為T或C，所述不同的堿基為A或G。在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為T和C中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為T和C中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基所述非互補(bǔ)的堿基為T或C，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或G。(f)在所述非目標(biāo)基因變異為從T和G中選擇的堿基的情況下，所述非互補(bǔ)的堿基為T或G，所述不同的堿基為A或C。在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為T和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為T和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基為T或G，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或C。另外，本發(fā)明中的寡核苷酸中也包含通過插入、缺失或取代了至少一個堿基來修飾所述Ρ1、Ρ1-1、Ρ?；颚宝?-I的寡核苷酸而獲得的寡核苷酸。通過插入、缺失或取代了至少一個堿基來修飾所述Ρ1、Ρ1_1、Ρ?；颚宝?-I的寡核苷酸而獲得的寡核苷酸只要顯示與所述PU Pl-U Ρ?；颚宝?-I的寡核苷酸同等程度的作用即可。在插入、缺失或取代了堿基的情況下，該插入、缺失或取代的位置無特別限定。作為插入、缺失或取代了的堿基的數(shù)量，可以舉出一個堿基或兩個堿基以上，根據(jù)寡核苷酸全體的長度而不同，例如可以舉出I堿基 10堿基或I堿基 5堿基。作為本發(fā)明的所述Ρ1、Ρ1_1、Ρ?；颚宝?l的寡核苷酸的長度，可以舉出為Ilmer 60mer的情況。在為該范圍的情況下，基因突變的檢測靈敏度變得良好。另外，作為本發(fā)明的所述PU Pl-U Ρ?；颚宝?-I的寡核苷酸的長度，可以為12mer 55mer> 15mer 45mer、或 18mer 40mer。倉泛夠設(shè)置為 12mer 55mer 的范圍。由此，例如有檢測靈敏度變高等的傾向。另外，通過改變所述PU Pl-I、Ρ?；颚宝?-I的寡核苷酸的堿基長，例如能夠?qū)⑺?述PU Pl-U Ρ?；颚宝?-I的寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈(靶標(biāo)序列)所形成的雜交體的解離溫度、即Tm值調(diào)節(jié)至期望的值。以下，對用于設(shè)計本發(fā)明的基因突變檢測用探針的方法，舉出具體例進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明不限于這些。序列編號3所示的堿基序列為含有rs20542的序列。在序列編號3所示的堿基序列中，含有第251位堿基的目標(biāo)基因突變和其附近的第256位堿基的非目標(biāo)基因突變。在這種情況下，在相當(dāng)于所述(PD或(P1-1)的寡核苷酸的基因突變檢測用探針中，將第251位的堿基處與野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基選擇作為Pl或Pl-I中對應(yīng)堿基位置處的堿基，而將第256位堿基處與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基均不互補(bǔ)的堿基，選擇作為Pl或Pl-I寡核苷酸中的對應(yīng)堿基位置的堿基。具體地，在表I中，可舉出序列編號4或序列編號5所示的基因突變檢測用探針。另外，在相當(dāng)于所述(ΡΓ)或(ΡΓ-l)的寡核苷酸的基因突變檢測用探針中，將第251位的堿基處與野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基選擇作為Ρ?；颚宝?-I中對應(yīng)堿基位置處的堿基，而將第256位堿基處與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基均不同的堿基，選擇作為ΡΓ或ΡΓ -I寡核苷酸中的對應(yīng)堿基位置的堿基。具體地，在表I中，可舉出序列編號6或序列編號7所示的基因突變檢測用探針。通過使用所得到的序列編號4 序列編號7所示的基因突變檢測用探針中的任意一種探針，當(dāng)檢測有無序列編號3所示的堿基序列中的第251位的目標(biāo)基因突變時，即使在該第251位的堿基的附近存在非目標(biāo)基因突變的情況下，也能夠特異性地檢測有無該第251位的目標(biāo)基因突變。在表I中，帶下劃線的大寫字母表示作為檢測對象的目標(biāo)基因突變，未帶下劃線的大寫字母表示非目標(biāo)基因突變。以下相同。表I
序列編號4(突光染料)-cTccagCagggcgagga
序列編號5(突光染料)-cAccagCagggcgagga
序列編號6(突光染料)-cctcgccctActggAgct
序列編號7(突光染料)-cctcgccctActggTgct
序列編號8所不的喊基序列為含有rsll881222的序列。在序列編號8所不的喊基序列中，含有第355位中的目標(biāo)基因突變和其附近的第364位的非目標(biāo)基因突變。在這種情況下，在相當(dāng)于所述(Pl)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突變檢測用探針中，將第355位的堿基處與野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基選擇作為Pl或Pl-I中對應(yīng)堿基位置處的堿基，而將第364位堿基處與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基均不互補(bǔ)的堿基，選擇作為Pl或Pl-I寡核苷酸中的對應(yīng)堿基位置的堿基。具體地，在表2中，可以舉出序列編號9或序列編號10所示的基因突變檢測用探針。另外，在相當(dāng)于所述(ΡΓ)或(ΡΓ-l)的寡核苷酸的基因突變檢測用探針中，將第355位的堿基處與野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基選擇作為Ρ?；颚宝?-I中對應(yīng)堿基位置處的堿基，而將第364位堿基處與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基均不同的堿基，選擇作為P1’或Pl’-l寡核苷酸中的對應(yīng)堿基位置的堿基。具體地，在 表2中，可舉出序列編號11或序列編號12所示的基因突變檢測用探針。通過使用所得到的序列編號9 序列編號12所示的基因突變檢測用探針中的任意一種探針，當(dāng)檢測有無序列編號8所示的堿基序列中的第355位的目標(biāo)基因突變時，即使在該第355位的堿基的附近存在非目標(biāo)基因突變的情況下，也能夠特異性地檢測有無該355位的目標(biāo)基因突變。表2
序列編號9 tccAtctctcctCtcccc-(熒光染料)
序列編號10 tccGtctctcctCtcccc-(熒光染料)
序列編號11 gggaGaggagagaTggac-(熒光染料)
序列編號12 gggaGaggagagaCggac-(熒光染料)序列編號13所示的堿基序列為含有rs80230660的序列。在序列編號13所示的堿基序列中，含有第201位的目標(biāo)基因突變和其附近的第187位的非目標(biāo)基因突變。在這種情況下，在相當(dāng)于所述(Pl)或(Pl-I)的寡核苷酸的基因突變檢測用探針中，將第201位的堿基處與野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基選擇作為Pl或Pl-I中對應(yīng)堿基位置處的堿基，而將第187位堿基處與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基均不互補(bǔ)的堿基，選擇作為Pl或Pl-I寡核苷酸中的對應(yīng)堿基位置的堿基具體地，在表3中，可舉出序列編號14或序列編號15所示的基因突變檢測用探針。另外，在相當(dāng)于所述(ΡΓ)或(ΡΓ-l)的寡核苷酸的基因突變檢測用探針中，將第201位的堿基處與野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基選擇作為ΡΓ或ΡΓ -I中對應(yīng)堿基位置處的堿基，而將第187位堿基處與非目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基均不同的堿基，選擇作為P1’或Pl’-l寡核苷酸中的對應(yīng)堿基位置的堿基。具體地，在表3中，可舉出序列編號16或序列編號17所示的基因突變檢測用探針。通過使用所得到的序列編號14 序列編號17所示的基因突變檢測用探針中的任意一種探針，當(dāng)在序列編號13所示的堿基序列中檢測有無第201位的目標(biāo)基因突變時，即使在該第201位的堿基的附近存在非目標(biāo)基因突變的情況下，也能夠特異性地檢測有無該第201位的目標(biāo)基因突變。表權(quán)利要求
1.一種基因突變檢測用探針，用于檢測對含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因進(jìn)行編碼的堿基序列中的所述目標(biāo)基因突變，所述探針包括從下述pi、pi-i、pi’及pr -I的組中選擇的至少一種寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基，而且其相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分互補(bǔ)的堿基序列具有至少80%以上的同一性； (Pl-I)寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基，而且其與和編碼所述對象基因的堿基序列具有相同堿基序列的寡核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交； (pr )寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基，而且其相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分具有至少80%以上的同一性；以及 (pr -D寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任意一者相同的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置處具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基，而且其與具有與編碼所述對象基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因突變檢測用探針，其中，所述基因突變檢測用探針滿足下述(a)至(f)中的任一條件 (a)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為A和T中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和T中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為C或G ; (b)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為C和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為C和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或T ; (c)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為A和C中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和C中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為T或G ; (d)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為從A和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為A和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基或者與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿 基中任何一者均不同的堿基為T或C ; (e)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為T和C中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為T和C中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基所述非互補(bǔ)的堿基為T或C，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或G ; (f)在所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置的野生型堿基為T和G中的一者，并且所述非目標(biāo)基因突變的突變型堿基為T和G中的另一者的情況下，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均非互補(bǔ)的堿基為T或G，與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基中任何一者均不同的堿基為A或C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因突變檢測用探針，其中，所述寡核苷酸為熒光標(biāo)記寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因突變檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸的3’末端或5’末端的堿基為胞嘧啶，該胞嘧啶用熒光染料標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因突變檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸位于從3’末端或5’末端起數(shù)第I 3位的任意位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因突變檢測用探針，其中，所述基因突變檢測用探針為用于分析熔解曲線的探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因突變檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少或增加。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因突變檢測用探針，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的突光強(qiáng)度比未與祀標(biāo)序列雜交時的突光強(qiáng)度減少。
9.一種基因突變檢測方法，其使用權(quán)利要求I至8中任一項所述的基因突變檢測用探針來檢測作為檢測對象的目標(biāo)基因突變。
10.一種目標(biāo)基因突變檢測方法，包括 (I)使權(quán)利要求3至8中任一項所述的基因突變檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸來獲得雜交體； (II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動； (III)基于所述熒光信號的變動來獲得雜交體的解離溫度，即Tm值； (IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中目標(biāo)基因突變的存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的目標(biāo)基因突變檢測方法，還包括在獲得所述(I)的雜交體之前或者與獲得所述(I)的雜交體的同時擴(kuò)增核酸。
12.—種基因突變檢測用試劑盒，包含權(quán)利要求I至8中任一項所述的基因突變檢測用探針。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的基因突變檢測用試劑盒，還包含引物，所述引物能夠擴(kuò)增具有與權(quán)利要求I至8中任一項所述的基因突變檢測用探針雜交的區(qū)域的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種即使對基因進(jìn)行編碼的堿基序列含有多個基因突變也能夠不受基因突變檢測對象之外的基因突變的影響而特異性地檢測作為檢測對象的特定的基因突變的基因突變檢測用探針。基因突變檢測用探針用于檢測編碼含有目標(biāo)基因突變和非目標(biāo)基因突變的對象基因的堿基序列中的所述目標(biāo)基因突變，并包括(P1)寡核苷酸等，(P1)寡核苷酸，其在對應(yīng)于所述目標(biāo)基因突變的堿基位置具有與所述目標(biāo)基因突變的野生型堿基或突變型堿基互補(bǔ)的堿基，并且在對應(yīng)于所述非目標(biāo)基因突變的堿基位置具有與所述非目標(biāo)基因突變的野生型堿基和突變型堿基均非互補(bǔ)的堿基，而且相對于與編碼所述對象基因的堿基序列的全部或部分互補(bǔ)的堿基序列具有至少80％以上的同一性。
文檔編號C12Q1/68GK102766683SQ20121013217
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月2日
發(fā)明者井口亞希, 平井光春, 黑瀬熏 申請人:愛科來株式會社