專(zhuān)利名稱(chēng)：多態(tài)性檢測(cè)用探針、多態(tài)性檢測(cè)方法、藥效評(píng)價(jià)方法、疾病預(yù)測(cè)方法以及多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多態(tài)性檢測(cè)用探針、多態(tài)性檢測(cè)方法、藥效評(píng)價(jià)方法、疾病預(yù)測(cè)方法以及多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒。
背景技術(shù)：
—直以來(lái),作為高尿酸血癥的治療祀標(biāo)分子，已知作為尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的Urate轉(zhuǎn)運(yùn)子(URAT1/SLC22A12)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 9 (GLIT9/SLC22A12)。 近年來(lái)，明確了由也被稱(chēng)為 BCRP (breast cancer resistance protein)的ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2)基因編碼高容量性的排尿轉(zhuǎn)運(yùn)子。另外，受到ABCG2基因的多態(tài)性的存在與痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)的啟發(fā)，明確了 ABCG2基因是痛風(fēng)的主要致病基因(例如，參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)2010年，第28卷，第8號(hào)，p.1285-1289)。另外，還受到ABCG2基因的多態(tài)性的存在與胎盤(pán)中的蛋白質(zhì)表達(dá)異常有關(guān)聯(lián)(例如，參見(jiàn)Drug. Metab. Dispos.，2005年，第33卷，第I號(hào)，p. 94-101)的啟示啟發(fā)，人們期待短時(shí)間、低成本并且簡(jiǎn)便地測(cè)定ABCG2基因的多態(tài)性的方法。作為測(cè)定基因的多態(tài)性的方法，已知有使用被設(shè)計(jì)為擴(kuò)增含有想要測(cè)定的堿基的部分的引物進(jìn)行PCR，用能夠以該特定堿基中有無(wú)突變來(lái)區(qū)分是否切斷的限制性內(nèi)切酶來(lái)切斷，之后用電泳檢測(cè)是否切斷了的方法(PCR-RFLP法)(例如，參見(jiàn)Genet. Mol. Res. ,2010年，第9卷，第I號(hào)，p. 34-40)。另外，還已知有在用PCR法擴(kuò)增了含有突變的區(qū)域之后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行熔解曲線分析，并基于熔解曲線分析的結(jié)果來(lái)分析堿基序列的突變的方法(例如，參見(jiàn)日本專(zhuān)利文獻(xiàn)特開(kāi)2002-119291號(hào)公報(bào))。但是，在PCR-RFLP法中，在PCR反應(yīng)之后需要提取擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物有可能混入下一反應(yīng)體系，由此有可能獲得假陽(yáng)性、假陰性的結(jié)果。另夕卜，由于在PCR結(jié)束后用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，之后進(jìn)行電泳，因此有時(shí)到檢測(cè)為止需要的時(shí)間非常長(zhǎng)。而且，由于操作復(fù)雜，難以自動(dòng)化。因此，期望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于ABCG2基因多態(tài)性檢測(cè)的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明要解決的問(wèn)題在于提供能夠高靈敏度且簡(jiǎn)便地檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測(cè)用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明要解決的問(wèn)題在于提供使用了該檢測(cè)方法的藥效評(píng)價(jià)方法和疾病預(yù)測(cè)方法。此外，本發(fā)明要解決的問(wèn)題還在于提供使用了該檢測(cè)用探針的多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒。用于解決問(wèn)題的手段
用于解決上述問(wèn)題的具體手段如下。<1> 一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，含有從包括下述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(Pl)寡核苷酸，其為與含有在序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)I互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸，其為與含有在序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)I相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第311 位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長(zhǎng)為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)2互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第251位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2’)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長(zhǎng)為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)2相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第251位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長(zhǎng)為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)3互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第152位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；以及(P3’)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長(zhǎng)為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)3相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。 <2>根據(jù)〈1>所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第311位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置,所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第251位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置,所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第152位堿基位于從3’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置?！?>根據(jù)〈1>或〈2>所述的ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pl或P1’突光標(biāo)記寡核苷酸的被突光染料標(biāo)記的第311位堿基位于5’末端,所述P2或P2’突光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第251位堿基位于5’末端，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被突光染料標(biāo)記的第152位堿基位于3’末端。<4>根據(jù)〈1> 〈3>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度減少或增加。<5>根據(jù)〈1> 〈4>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度減少?！?>根據(jù)<1> <5>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為11 40，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為18 40，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為10 40。<7>根據(jù)〈1> 〈6>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為11 28，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為20 30，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為15 30。<8>根據(jù)〈1> 〈7>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為14 18，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為22 26，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為18 22。 <9>根據(jù)〈1> 〈8>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述多態(tài)性檢測(cè)用探針為熔解曲線分析用的探針。<10> 一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)方法，其使用〈1> 〈9>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針。<11>根據(jù)〈10>所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，其使用從包括〈1> 〈9>中任一項(xiàng)所述的所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少兩種多態(tài)性檢測(cè)用探針。<12>根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，包括(I)使〈1> 〈9>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來(lái)獲得雜交體；(II)通過(guò)改變含有所述雜交體的試樣的溫度來(lái)使所述雜交體解離，并測(cè)定基于所述雜交體的解離的熒光信號(hào)的變動(dòng)；(III)基于所述熒光信號(hào)的變動(dòng)來(lái)測(cè)定雜交體的解離溫度、即Tm值。(IV)基于所述Tm值來(lái)檢測(cè)所述試樣中的單鏈核酸中的ABCG2基因中的多態(tài)性的存在。〈13>根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，還包括在所述(I)的獲得雜交體之前或者與(I)的獲得雜交體的同時(shí)擴(kuò)增核酸。<14> 一種藥劑的藥效判定方法，包括通過(guò)〈10> 〈13>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性；以及基于檢測(cè)到的多態(tài)性的有無(wú)來(lái)判定對(duì)藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。<15> 一種疾病預(yù)測(cè)方法，包括通過(guò)〈10> 〈13>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性；以及基于檢測(cè)到的多態(tài)性的有無(wú)來(lái)預(yù)測(cè)疾病的罹患風(fēng)險(xiǎn)。<16> 一種多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，包含權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針。<17>根據(jù)〈16>所述的多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，還包含下述引物對(duì)中的至少一者能夠擴(kuò)增含有序列編號(hào)I所示的堿基序列中的、與所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對(duì)；能夠擴(kuò)增含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的、與所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對(duì)；以及能夠擴(kuò)增含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的、與所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對(duì)。發(fā)明效果通過(guò)本發(fā)明，能夠提供可高靈敏度且簡(jiǎn)便地檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測(cè)用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測(cè)方法。另外，通過(guò)本發(fā)明，能夠提供使用了該檢測(cè)方法的藥效評(píng)價(jià)方法和疾病預(yù)測(cè)方法。此外，通過(guò)本發(fā)明還能夠提供使用了該檢測(cè)用探針的多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒。


圖I的(A)是示出核酸混合物的熔解曲線的示例的圖，以及圖I的(B)是示出微 分熔解曲線的示例的圖；圖2的(A)和⑶是使用本發(fā)明實(shí)施例1-1涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖3是使用本發(fā)明實(shí)施例1-2涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖4的(A) (H)是使用本發(fā)明實(shí)施例2涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖5的(A) (C)是使用本發(fā)明實(shí)施例3涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖6的(A) (C)是使用本發(fā)明實(shí)施例4涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖7的(A) (C)是使用本發(fā)明實(shí)施例4涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖8的(A)和(B)是使用本發(fā)明比較例I涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖9是使用本發(fā)明比較例I涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖10的(A) ⑶是使用本發(fā)明比較例2涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線；圖11的(A) (C)是使用本發(fā)明比較例3涉及的多態(tài)性檢測(cè)用探針而獲得的熔解曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的探針是ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其含有從包括P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸。通過(guò)本發(fā)明，能夠高靈敏度且簡(jiǎn)便地檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性。ABCG2基因的堿基序列相當(dāng)于與GeneID :9429,GenBank登錄號(hào)No. 000004(版本000004. 11)相當(dāng)?shù)男蛄兄械牡?9011415位堿基 第89080010位堿基的序列。本說(shuō)明書(shū)中，將該第89011415位堿基 第89080010位堿基的序列作為“ABCG2基因的堿基序列”。本發(fā)明中，關(guān)于作為檢測(cè)對(duì)象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測(cè)用探針或者引物的每個(gè)的序列，基于它們的相互互補(bǔ)的關(guān)系所記述的事項(xiàng)，只要不特別指出，也適用于各個(gè)序列和相對(duì)于各序列互補(bǔ)的序列。在將本發(fā)明的事項(xiàng)適用于相對(duì)于各序列互補(bǔ)的該序列時(shí)，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)的范圍內(nèi)，由該互補(bǔ)的序列識(shí)別的序列視為將說(shuō)明書(shū)全體替換為與對(duì)應(yīng)的本說(shuō)明書(shū)中記載的序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明中，“Tm值”是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時(shí)的溫度。即，當(dāng)加熱含有雙鏈核酸、例如雙鏈DNA的溶液時(shí)，260nm處的吸光度上升。這是因?yàn)殡p鏈核酸DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離成單鏈DNA (DNA的熔解)。并且，全部雙鏈核酸DNA解離成單鏈DNA時(shí)，其吸光度顯示為加熱開(kāi)始時(shí)的吸光度(僅雙鏈核酸DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基于該現(xiàn)象而設(shè)定。在本發(fā)明中，關(guān)于寡核苷酸的序列，當(dāng)稱(chēng)為“從3’末端起數(shù)的第I 3位”時(shí)為以寡核苷酸鏈的3’末端為第I位起數(shù)的。同樣地，當(dāng)稱(chēng)為“從5’末端起數(shù)的第I 3位”時(shí) 為以寡核苷酸鏈的5’末端為第I位起數(shù)的。在本說(shuō)明書(shū)中，“步驟” 一詞不僅包含獨(dú)立的步驟，即使在不能與其他的步驟明確區(qū)別的情況下只要達(dá)到了本步驟預(yù)期的效果，則包含在本術(shù)語(yǔ)之內(nèi)。另外，在本說(shuō)明書(shū)中，使用“ ”表示的數(shù)值范圍為將“ ”的前后記載的數(shù)值分別作為最小值和最大值包含的范圍。另外，在本發(fā)明中，組成物中的各成分的量在所述組成物中存在多種相當(dāng)于各成分的物質(zhì)的情況下，只要不特別指出，是指所述組成物中存在的該多種物質(zhì)的合計(jì)量的意思。下面說(shuō)明本發(fā)明。<多態(tài)性檢測(cè)用探針>本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針(以下，有時(shí)僅稱(chēng)為“探針”)包含從由包括下述P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(以下，有時(shí)僅稱(chēng)為“熒光標(biāo)記
寡核苷酸”)。(Pl)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)I互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；(P1’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)I相同堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第311位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長(zhǎng)為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)2互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第251位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長(zhǎng)為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)2相同堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第251位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；
(P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長(zhǎng)為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)3互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第152位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；以及(P3’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長(zhǎng)為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)3相同堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。通過(guò)含有至少一種上述特定的熒光標(biāo)記寡核苷酸，能夠更高靈敏度且簡(jiǎn)便地第檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性。 序列編號(hào)I所不的喊基序列為ABCG2基因的喊基序列的一部分，對(duì)應(yīng)于ABCG2基因的第I位 第68595位堿基中的第18597位 第19196位的601個(gè)堿基。在ABCG基因的野生型中，與序列編號(hào)I所示的堿基序列的第301位對(duì)應(yīng)的堿基為G (鳥(niǎo)嘌呤)，而在突變型中突變成A (腺嘌呤)。另外，在野生型的ABCG2基因中，ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)子的氨基酸序列中的第12位的氨基酸為纈氨酸(Val)，而在突變型的ABCG2基因中，為蛋氨酸(Met)(以下稱(chēng)為“V12M突變”)。另外，在所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸中，“與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基”是與序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第311位堿基G(鳥(niǎo)嘌呤)互補(bǔ)的堿基C(胞嘧啶)。在所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸中，該被熒光標(biāo)記的互補(bǔ)的堿基C能夠存在于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置。另外，能夠存在于5’末端。由此，例如多態(tài)性檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高。另外，能夠生產(chǎn)性良好地獲得Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸。所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸是能夠檢測(cè)序列編號(hào)I所示的堿基序列的第301位堿基的多態(tài)性的探針。該堿基的野生型為G，突變型為A。所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)需為11 50。在堿基長(zhǎng)為10以下或51以上的情況下，ABCG2基因多態(tài)性的檢測(cè)靈敏度降低。另外，從多態(tài)性檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)可以為11 40、11 28或14 18。另外，通過(guò)改變所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)，例如能夠?qū)⒂蒔l或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈(靶標(biāo)序列)形成的雜交體的解離溫度、即Tm值調(diào)節(jié)到期望的值。本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸與除了第311位的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外和序列編號(hào)I所示的堿基序列互補(bǔ)的序列具有同源性。具體地，本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸相對(duì)于與序列編號(hào)I所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列具有80%以上的同一性。另外，從檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)，也可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一丨I"生。在將本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸和下述與序列編號(hào)I互補(bǔ)的序列進(jìn)行比較時(shí)的同一性低于80%的情況下，對(duì)含有突變型的ABCG2基因的試樣核酸的檢測(cè)靈敏度變低，所述與序列編號(hào)I互補(bǔ)的序列是除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)I互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的所述P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸與除了第311位堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有和序列編號(hào)I相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。雜交可以根據(jù)公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來(lái)進(jìn)行。該文獻(xiàn)通過(guò)參考被并入本說(shuō)明書(shū)中。嚴(yán)謹(jǐn)條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴(yán)謹(jǐn)條 件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。作為本發(fā)明的條件的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下進(jìn)行雜交的條件,但不限于此。此外，嚴(yán)謹(jǐn)條件被記載在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻(xiàn)通過(guò)參考被并入本說(shuō)明書(shū)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等來(lái)容易地選擇這樣的條件。以下，在表I中示出本發(fā)明的pi或Pr熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基序列的示例，但本發(fā)明不限于這些。在表I中，與序列編號(hào)I的第301位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用大寫(xiě)字母表示，并且一并示出與該序列編號(hào)I的第301位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為C、T、A或G時(shí)的寡核苷酸與各熒光標(biāo)記寡核苷酸之間的雜交體的Tm值。這里Tm 值是使用 Meltcalc 99 free (http://www. meltcalc. com/)在設(shè)定條件Oligoconc [ u M] 0. 2、Na eq. [mM] 50 的條件下計(jì)算的。表I
權(quán)利要求
1.一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，含有從包括下述PU PI’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其為與含有在序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)I互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第311位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記； (Pr )寡核苷酸，其為與含有在序列編號(hào)I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)I相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第311位喊基對(duì)應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記； (P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長(zhǎng)為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)2互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記； (P2’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長(zhǎng)為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)2相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第251位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記； (P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長(zhǎng)為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對(duì)于除了與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外與序列編號(hào)3互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；以及 (P3’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長(zhǎng)為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤之外具有與序列編號(hào)3相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第152位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中， 所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第311位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置， 所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第251位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置， 所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第152位堿基位于從3’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中， 所述pi或pr熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第311位堿基位于5’末端， 所述P2或P2’突光標(biāo)記寡核苷酸的被突光染料標(biāo)記的第251位堿基位于5’末端， 所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第152位堿基位于3’末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度減少或增加。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時(shí)的熒光強(qiáng)度減少。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pi或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為11 40，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為18 40，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為10 40。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pi或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為11 28，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為20 30，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為15 30。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為14 18，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為22 26，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長(zhǎng)為18 22。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述多態(tài)性檢測(cè)用探針為熔解曲線分析用的探針。
10.一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)方法，其使用權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針。
11.一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)方法，其使用從包括權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的所述PU PI’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少兩種多態(tài)性檢測(cè)用探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，包括 (I)使權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來(lái)獲得雜交體； (II)通過(guò)改變含有所述雜交體的試樣的溫度來(lái)使所述雜交體解離，并測(cè)定基于所述雜交體的解離的熒光信號(hào)的變動(dòng)； (III)基于所述熒光信號(hào)的變動(dòng)來(lái)測(cè)定雜交體的解離溫度、即Tm值。
(IV)基于所述Tm值來(lái)檢測(cè)所述試樣中的單鏈核酸中的ABCG2基因中的多態(tài)性的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，還包括所述在所述(I)的獲得雜交體之前或者與(I)的獲得雜交體的同時(shí)擴(kuò)增核酸。
14.一種藥劑的藥效判定方法，包括 通過(guò)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性；以及 基于檢測(cè)到的多態(tài)性的有無(wú)來(lái)判定對(duì)藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。
15.一種疾病預(yù)測(cè)方法，包括 通過(guò)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)ABCG2基因的多態(tài)性；以及 基于檢測(cè)到的多態(tài)性的有無(wú)來(lái)預(yù)測(cè)疾病的罹患風(fēng)險(xiǎn)。
16.一種多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，包含權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒，還包含下述引物對(duì)中的至少一者 能夠擴(kuò)增含有序列編號(hào)I所示的堿基序列中的、與所述pi或Pr熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對(duì)；能夠擴(kuò)增含有序列編號(hào)2所示的堿基序列中的、與所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對(duì)；以及 能夠擴(kuò)增含有序列編號(hào)3所示的堿基序列中的、與所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明提供多態(tài)性檢測(cè)用探針、多態(tài)性檢測(cè)方法、藥效評(píng)價(jià)方法、疾病預(yù)測(cè)方法以及多態(tài)性檢測(cè)用試劑盒。ABCG2基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針通過(guò)包含下述的寡核苷酸等而構(gòu)成其為與含有序列編號(hào)1所示的堿基序列中的第301位～第311位堿基的堿基長(zhǎng)為11～50的堿基序列互補(bǔ)且具有至少80％以上的同一性，并且與第311位堿基對(duì)應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102766681SQ20121013201
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月2日
發(fā)明者井口亞希, 黑瀬熏 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社