專利名稱：多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效判定方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效判定方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒。
背景技術：
ABCC2基因局部存在于肝細胞的膽管，對將谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、硫酸結合體從膽管輸送到膽管的轉運體進行編碼，并與各種藥劑的代謝有關。另外，近年，在分析日本人的ABCC2基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)之后，發(fā)現(xiàn)了各 種各樣的基因多態(tài)性。另外，已給出了通過對ABCC2基因的與5’末端相距24個堿基的胞嘧啶(C)突變成胸腺嘧啶(T)的C-24T進行測定有可能能夠預測藥物耐受性的啟示(參見Drug Metabolism and Disposition, 2002 年，Vol. 30, No. 4, p. 363-364)。因此，人們期待正確且短時間、低成本并且簡便地測定ABCC2基因的多態(tài)性的方法。另外，作為與藥劑的敏感性相關的突變，例如，除了 C-24T突變之外，還已知有MDRl基因的外顯子26中的第3435位的胞嘧啶(C)突變成胸腺嘧啶(T)的C3435T突變等多種突變(參見日本專利特許第4454366號公報)。因此，不單單檢測ABCC2基因的多態(tài)性，而是通過與C-24T突變一起檢測其他的與藥劑敏感性相關的突變體，有可能能夠更高靈敏度地預測藥劑耐受性。目前，作為測定基因的多態(tài)性的方法，已知有下述的方法使用被設計為擴增含有想要測定的堿基的部分的引物進行PCR，用可以該特定堿基中有無突變來區(qū)分是否切斷的限制性內切酶進行切斷，之后通過電泳檢測有沒有被切斷(PCR-RFLP法)(參見Genet.Mol. Res. ,2010 年，第 9 卷，第 I 號，ρ· 34-40)。另外，還已知有下述的方法在用PCR法擴增含有突變的區(qū)域之后，使用用熒光染料標記了的核酸探針進行熔解曲線分析，并基于熔解曲線分析的結果來分析堿基序列的突變(參見特開2002-119291號公報)。

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的問題但是，ABCC2基因的突變中如上述那樣存在各種突變。因此，在PCR-RFLP法中，需要在PCR反應之后提取擴增產(chǎn)物來進行限制性內切酶處理。因此，擴增產(chǎn)物有可能混入下一反應體系中，由此有時會獲得假陽性、假陰性的結果。另外，由于在PCR結束之后用限制性內切酶進行處理，之后進行電泳，因此有時到檢測為止所需的時間非常長。而且，由于操作復雜，因此難以自動化。根據(jù)這些現(xiàn)狀，期待進一步開發(fā)用于檢測ABCC2基因多態(tài)性的技術。本發(fā)明要解決的問題在于提供一種能夠高靈敏度、簡便地檢測ABCC2基因多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法。另外，本發(fā)明要解決的問題在于提供使用了該多態(tài)性檢測方法的藥效判定方法。而且本發(fā)明要解決的問題在于提供使用了該多態(tài)性檢測用探針的多態(tài)性檢測用試劑盒。用于解決課題的手段本發(fā)明如下所述。<1> 一種多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述Pl和ΡΓ的組中選擇的一種熒光標記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性，(Pl)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的喊基為胞喃唳之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記； 以及(Pr)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記?！?>根據(jù)〈1>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針是下述Pl或下述ΡΓ的所述熒光標記核苷酸，(Pl-I)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I的第217位的堿基對應的喊基為胞B密卩定之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記，并且該熒光標記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性；或者(Pr -I)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記，并且該熒光標記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。<3>根據(jù)〈1>或〈2>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位具有用熒光染料標記的第217位的堿基。<4>根據(jù)〈1> 〈3>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的第217位的堿基。<5>根據(jù)〈1> 〈4>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在未與IE標序列雜交時發(fā)出突光，并且在與該IE標序列雜交時突光強度減少或增加。<6>根據(jù)〈1> 〈5>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與該靶標序列雜交時熒光強度減少。<7>根據(jù)〈1> 〈6>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸的堿基長為12 55。<8>根據(jù)〈1> 〈7>任意一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸的堿基長為15 45。
<9>根據(jù)<1> 〈8>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸的堿基長為18 35。<10>根據(jù)〈1> 〈9>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中所述多態(tài)性檢測用探針為用于分析熔解曲線的探針。<11>根據(jù)〈1> 〈10>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針具有序列編號4、序列編號5、序列編號6、序列編號7、序列編號8、序列編號9、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號15或序列編號16所不的喊基序列?！?2>—種多態(tài)性檢測方法，其通過使用〈1> 〈I 1>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針來檢測ABCC2基因的多態(tài)性。<13>根據(jù)〈12>所述的多態(tài)性檢測方法，包括 (I)使〈1> 〈11>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體；(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動；(III)基于所述熒光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值；以及(IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCC2基因的多態(tài)性的存在。<14>根據(jù)〈13>所述的多態(tài)性檢測方法，還包括在所述⑴之前或者與⑴同時擴增核酸。<15>根據(jù)〈12> 〈14>中任一項所述的多態(tài)性檢測方法，還包括通過使用從包括MDRl基因的多態(tài)性檢測用探針和CYP3A5基因的多態(tài)性檢測用探針的組中選擇的至少一種探針，來檢測從包括MDRl基因和CYP3A5基因的組中選擇的至少一種基因的多態(tài)性。<16> 一種藥效評價方法，包括通過〈12> 〈15>中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCC2基因的多態(tài)性；以及基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。<17> 一種多態(tài)性檢測用試劑盒，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性，所述多態(tài)性檢測用試劑盒包含〈1> 〈11>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。<18>根據(jù)<17〉所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含能夠擴增含有與所述Pl熒光標記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。<19>根據(jù)<17〉或〈18>所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含從包括用于檢測MDRl基因的多態(tài)性的探針以及用于檢測CYP3A5基因的多態(tài)性的探針的組中選擇的至少一種以上的多態(tài)性檢測用探針。發(fā)明效果通過本發(fā)明，能夠提供可以高靈敏度、簡便地檢測ABCC2基因多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法。另外，本發(fā)明能夠提供使用了該多態(tài)性檢測方法的藥效判定方法。而且，本發(fā)明能夠提供使用了該多態(tài)性檢測用探針的多態(tài)性檢測用試劑盒。


圖I的(A)是核酸混合物的熔解曲線的示例，圖I的(B)是微分熔解曲線的示例。圖2的㈧ (F)是本發(fā)明的實施例I涉及的試樣的微分熔解曲線。圖3的㈧ (C)是本發(fā)明的實施例2涉及的試樣的微分熔解曲線。圖4的㈧ (C)是本發(fā)明的比較例I涉及的試樣的微分熔解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明涉及的ABCC2基因的多態(tài)性檢測用探針(以下，有時僅稱“多態(tài)性檢測用探 針”)為如下的多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述Pi和ΡΓ的組中選擇的一種熒光標記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性(Pl)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的喊基為胞B密卩定之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80 %以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記；以及(Pr)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記。本發(fā)明涉及的ABCC2基因多態(tài)性檢測方法包括使用至少一種用于檢測所述ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針來檢測ABCC2基因的多態(tài)性。本發(fā)明涉及的藥劑的藥效判定方法包括通過所述ABCC2基因多態(tài)性檢測方法檢測ABCC2基因的多態(tài)性；以及基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定針對藥劑的耐受性或藥劑的藥效。本發(fā)明涉及的多態(tài)性檢測用試劑盒包含用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針。本發(fā)明中的“ABCC2基因”已經(jīng)是公知的，其堿基序列表示NCBI的登錄號No. NC_000010. 10的101542463 101611662的序列。序列編號I的堿基序列為NCBI的dbSNP的登錄號No. rs717620的I 611的序列，相應于ABCC2基因的啟動子區(qū)域中的核酸的堿基序列的一部分。在本發(fā)明中，關于作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測用探針或者引物的每個的序列，基于它們的相互互補的關系所記述的事項，只要不特別指出，也適用于各個序列和相對于各序列互補的序列。在將本發(fā)明的事項適用于相對于各序列互補的該序列時，由該互補的序列識別的序列，在本領域技術人員的技術常識的范圍內，視為將說明書全體替換為與對應的本說明書中記載的序列互補的序列。在本發(fā)明中，“Tm值”是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。即，當加熱含有雙鏈核酸、例如雙鏈核酸DNA的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈核酸DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離成單鏈DNA (DNA的熔解)。并且，當雙鏈核酸DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基于該現(xiàn)象而設定。本發(fā)明中的Tm值只要不特別指出，均是指吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。在本發(fā)明中，關于寡核苷酸的序列，當稱為“從3’末端起數(shù)的第I 3位”時是以寡核苷酸鏈的3’末端為第I位起數(shù)的。在本說明書中，“步驟” 一詞不僅包含獨立的步驟，即使在不能與其他的步驟明確區(qū)別的情況下只要達到了本步驟預期的效果，則也包含在本術語之內。另外，在本說明書中，使用“ ”表示的數(shù)值范圍為將“ ”的前后記載的數(shù)值分別 作為最小值和最大值包含的范圍。另外，在本發(fā)明中，組成物中的各成分的量在組成物中存在多種相當于各成分的物質的情況下只要不特別指出就是指所述組成物中存在的該多種物質的合計量。下面說明本發(fā)明。〈ABCC2基因多態(tài)性檢測用探針>本發(fā)明涉及的ABCC2基因的多態(tài)性檢測用探針(以下，有時僅稱為“多態(tài)性檢測用探針”)為如下的多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述Pi和ΡΓ的組中選擇的一種熒光標記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性(Pl)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的喊基為胞B密卩定之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80 %以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記；以及(Pr)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外與具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記。本發(fā)明的從包括所述Pl和所述ΡΓ的組中選擇的一種熒光標記寡核苷酸(以下也稱為“所述Pi或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸”。)是能夠檢測序列編號I所示的堿基序列的第207位的堿基的多態(tài)性的探針。另外，本發(fā)明的所述Pl和ΡΓ熒光標記寡核苷酸具體為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的序列。在ABCC2基因的野生型中，與序列編號I所示的序列的第207位對應的堿基為C (胞嘧啶)，但在突變型中突變成T (胸腺嘧啶)(以下，稱為“C-24T突變”)，該堿基相當于ABCC2基因的第-428位 第183位的堿基中的第207位的堿基。本發(fā)明的所述Pl熒光標記寡核苷酸需要除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為c(胞嘧啶)之外相對于具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列具有同源性。具體地，本發(fā)明的所述Pl熒光標記寡核苷酸除了與序列編號I中的第217位的喊基對應的喊基為c(胞喃唳)之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列顯不80%以上的同一性。另外，從檢測靈敏度的觀點來說，可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一'I"生。在對本發(fā)明的所述Pl熒光標記寡核苷酸和除了與序列編號I中的第 217位的堿基對應的堿基為C(胞嘧啶)之外具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列進行比較時的同一性低于80%的情況下，針對含有突變型的ABCC2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變低。另外，作為本發(fā)明涉及的所述Pl熒光標記寡核苷酸，也可以是熒光標記寡核苷酸(Pl-I)，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外相對于具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記，并且該熒光標記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。該熒光標記寡核苷酸具有對含有突變型的ABCC2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變高的傾向。本發(fā)明中的所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸需要除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為C(胞嘧啶)之外具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交。雜交可以根據(jù)公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進行。該文獻通過參考被并入本說明書中。嚴謹條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴謹條件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約5. OmM中進行雜交的條件。作為本發(fā)明的條件的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下進行雜交的條件,但是不限于此。此外,嚴謹條件被記載在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻通過參考被并入本說明書中。本領域技術人員能夠通過改變雜交反應、雜交反應液的鹽濃度等來容易地選擇這樣的條件。另外，作為本發(fā)明涉及的所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸，也可以是熒光標記寡核苷酸(Pr -I)，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外和具有與序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記，并且該熒光標記寡核苷酸(ΡΓ -I)識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。該熒光標記寡核苷酸除了具有特定的堿基序列之外，還具有識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性的功能，因此具有對含有突變型的ABCC2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變高的傾向。另外，本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸還包括在所述Pi或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸中插入、缺失或者取代了堿基的熒光標記寡核苷酸。
該插入、缺失或取代了堿基的熒光標記寡核苷酸只要顯示與所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了堿基的情況下，其插入、缺失或取代的位置無特別限定。插入、缺失或取代的堿基的數(shù)量可以舉出I個堿基或2個堿基以上，該數(shù)量根據(jù)熒光標記寡核苷酸全體的長度而不同，例如可以舉出I個堿基 10個堿基或I個堿基 5個堿基。在插入、缺失或取代中，作為本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸，也可以舉出取代了所述Pl或所述Pr熒光標記寡核苷酸的堿基的熒光標記寡核苷酸。取代的位置無特別限定。例如，從檢測靈敏度的觀點來說，可以舉出位于序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基之外的堿基被取代。作為被取代的堿基的數(shù)量，可以舉出I個堿基或2個堿基以上。被取代的堿基的數(shù)量根據(jù)熒光標記寡核苷酸全體的長度而不同，例如可以舉出I個堿基 5個堿基、或I個堿基 3個堿基。

本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ的熒光標記寡核苷酸的長度需要是Ilmer 60mer。在所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸的長度為IOmer以下或者61mer以上的情況下，ABCC2基因多態(tài)性的檢測靈敏度變低。另外，本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸的長度可以為12mer 55mer、15mer 45mer或18mer 35mer。通過設成12mer 55mer的范圍，例如具有檢測靈敏度變高等的傾向。另外，通過改變所述Pl或所述P I’熒光標記寡核苷酸的堿基長，例如能夠將由Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸與其互補鏈(靶標序列)形成的雜交體的解離溫度、即Tm值調整至期望的值。以下將本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸中的堿基序列的示例示于表1，但是本發(fā)明不限于此。此外，在表I中，將與序列編號I的第207位的堿基對應的堿基用小寫字母表示，并且一并不出了與該序列編號I的第207位對應的堿基為A、G、T和C時的寡核苷酸與各個熒光標記寡核苷酸的雜交體的Tm值。另外，相對于序列編號I所示的序列增加了突變的堿基帶有下劃線。這里Tm 值是使用 Meltcalc 99 free (http://www. meltcalc. com/)在設定條件Oligoconc [ μ Μ] O. 2、Na eq. [mM] 50 的條件下計算的。
序列(5’一3')mer ~mt T「^~一 ^]※字列編號
TCTGGAACgAAGACTCTTC — 1950.2" 43.27.0 4
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTC~ 3765.6 62.3__3,3__5
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTCTATTAATATGATTGTGTTQT57一 67.4 ■ 65.42.0__6
TCTGgAACgAAGACTCTTC19— 30.139.4— 9.3 7
AATGATACCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTC37— 61.7 51.8__9,9__8
CATGATTCCTGGACTGCGTCTGGAACaAAGACTCTTCTAGGAATATGATTGTGTTGT5766.7~ 64.6— 2.19
CtAAGACTCTTC12—16.8 12.7__41__10
C^AAGACTCTTCI 12I 12.5I 9.7 I 2.8 I ” ■X Λ為mt (突變型)和WT (野生型)的Tm值之差在本發(fā)明中，所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸與具有互補的堿基序列的DNA雜交時的Tm值(表I中的Tm(mt))、和與僅序列編號I的第207位的堿基對應的堿基為非互補的寡核苷酸雜交時的Tm值(表I中的Tm(WT))之差，例如可以舉出2. 0°C以上、3. 0°C以上、5. O0C以上、或7. O0C以上等。通過所述Tm值之差為2. 0°C以上，例如能夠更高靈敏度地檢測序列編號I中的第207位的堿基的突變。另外，本發(fā)明的所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸的第217位的堿基需要用熒光染料標記。在所述Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸中，該熒光標記了的第217位的堿基能夠存在于從3’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置。另外，能夠存在于3’末端。由此，多態(tài)性檢測靈敏度進一步提高。另外，能夠生產(chǎn)性良好地獲得Pl或所述ΡΓ熒光標記寡核苷酸。本發(fā)明的所述熒光標記寡核苷酸可以是其與靶標序列雜交時的熒光強度比未與靶標序列雜交時的熒光強度減少(淬滅)或增加的熒光標記寡核苷酸。其中，可以是與靶 標序列雜交時的突光強度比未與祀標序列雜交時的突光強度減少的突光標記寡核苷酸。利用了這種突光淬滅現(xiàn)象(Quenching phenomenon)的探針一般稱為鳥嘌呤淬滅探針，已知為所謂Q Probe (注冊商標)。其中可以舉出如下的寡核苷酸其被設計為3’末端或5’末端為胞嘧啶(C)，并用熒光染料標記該末端的C使其靠近鳥嘌呤(G)時發(fā)光變弱。若使用這樣的探針，則能夠根據(jù)信號的變動來容易地確認雜交和解離。此外，除了使用Q Probe的檢測方法之外，也可以應用公知的檢測方式。作為這種檢測方式，可舉出Taq-man探針法、雜交探針(Hybridization Probe)法、分子信標(Molecular Beacon)法或 MGB 探針法等。作為所述熒光染料無特別限制，例如可以為熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述熒光染料的市售產(chǎn)品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。所述熒光標記寡核苷酸的檢測條件無特別限制，可以根據(jù)使用的所述熒光染料適當確定。例如Pacific Blue能夠在波長445 480nm下檢測，TAMRA能夠在波長585 700nm下檢測，BODIPY FL能夠在波長520 555nm下檢測。如果使用具有這種熒光染料的探針，則能夠根據(jù)各個熒光信號的變動來容易地確認雜交和解離?？梢园凑胀ǔ５姆椒?、例如日本專利文獻特開2002-119291號公報等中記載的方法，來將所述熒光染料結合至寡核苷酸。另外，所述熒光標記寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。因為通過在所述熒光標記寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能夠充分抑制探針自身由于基因擴增反應而延長。如后面所述，檢測有無突變的DNA(靶標DNA)可以通過PCR等基因擴增法來制備。此時，通過使用在3’末端添加有磷酸基的熒光標記寡核苷酸，能夠使其共存于擴增反應的反應液中。另外，通過在3’末端例如添加前述那樣的標記物質(熒光染料)，也能夠得到同樣的效果。下面示出具有上述堿基序列并且3’末端的C用熒光染料被標記的寡核苷酸的具體例(大寫字母的堿基表示突變點，(TAMRA)相當于所述熒光染料)。但是，本發(fā)明中的熒光標記寡核苷酸不限于以下的寡核苷酸。表權利要求
1.一種多態(tài)性檢測用探針，其為從包括下述pi和Pr的組中選擇的一種熒光標記寡核苷酸，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性 (PD熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞喃唳之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記；以及 (Pr )熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記。
2.根據(jù)權利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針是下述Pl或下述P1’的所述熒光標記核苷酸， (Pl-I)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I的第217位的堿基對應的堿基為胞喃唳之外相對于具有與序列編號I相同的喊基的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記，并且該熒光標記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性；或者 (PI’ -D熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號I所示的序列中的第207位 第217位的堿基的堿基長為11 60的序列，該序列除了與序列編號I中的第217位的堿基對應的堿基為胞嘧啶之外與具有和序列編號I相同的堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號I所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記，并且該熒光標記寡核苷酸識別序列編號I的第207位的堿基的多態(tài)性。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第I位 第3位具有用熒光染料標記的第217位的堿基。
4.根據(jù)權利要求I至3中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標記的第217位的堿基。
5.根據(jù)權利要求I至4中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與該靶標序列雜交時熒光強度減少或增加。
6.根據(jù)權利要求I至5中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸在未與靶標序列雜交時發(fā)出熒光，并且在與該靶標序列雜交時熒光強度減少。
7.根據(jù)權利要求I至6中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸的堿基長為12 55。
8.根據(jù)權利要求I至7中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸的堿基長為15 45。
9.根據(jù)權利要求I至8中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標記寡核苷酸的堿基長為18 35。
10.根據(jù)權利要求I至9中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針為用于分析熔解曲線的探針。
11.根據(jù)權利要求I至10中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針具有序列編號4、序列編號5、序列編號6、序列編號7、序列編號8、序列編號9、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號15或序列編號16所不的喊基序列。
12.一種多態(tài)性檢測方法，其通過使用權利要求I至11中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針來檢測ABCC2基因的多態(tài)性。
13.根據(jù)權利要求12所述的多態(tài)性檢測方法，包括 (I)使權利要求I至11中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體； (II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動； (III)基于所述熒光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值；以及 (IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCC2基因的多態(tài)性的存在。
14.根據(jù)權利要求13所述的多態(tài)性檢測方法，還包括在所述(I)之前或者與(I)同時擴增核酸。
15.根據(jù)權利要求12至14中任一項所述的多態(tài)性檢測方法，還包括通過使用從包括MDRl基因的多態(tài)性檢測用探針和CYP3A5基因的多態(tài)性檢測用探針的組中選擇的至少一種探針，來檢測從包括MDRl基因和CYP3A5基因的組中選擇的至少一種基因的多態(tài)性。
16.—種藥效評價方法，包括 通過權利要求12至15中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCC2基因的多態(tài)性；以及 基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。
17.一種多態(tài)性檢測用試劑盒，用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性，所述多態(tài)性檢測用試劑盒包含權利要求I至11中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。
18.根據(jù)權利要求17所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含能夠擴增含有與所述Pl熒光標記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。
19.根據(jù)權利要求17或18所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含從包括用于檢測MDRl基因的多態(tài)性的探針以及用于檢測CYP3A5基因的多態(tài)性的探針的組中選擇的至少一種以上的多態(tài)性檢測用探針。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠高靈敏度且簡便地檢測ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效判定方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒。用于檢測ABCC2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針是(P1)熒光標記寡核苷酸，其為含有序列編號1所示的序列中第207位～第217位的堿基的堿基長11～60的序列，除了與序列編號1中的第217位的堿基對應的堿基為C之外相對于具有與序列編號1相同堿基的堿基序列具有至少80％以上的同一性，并且與序列編號1所示的序列的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記；或者(P1’)熒光標記寡核苷酸，其與具有與序列編號1相同堿基的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交，并且與序列編號1所示的序列中的第217位的堿基對應的堿基用熒光染料標記。
文檔編號C12N15/11GK102766682SQ20121013213
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權日2011年5月2日
發(fā)明者井口亞希 申請人:愛科來株式會社