專利名稱：血管瘤集落形成細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法。本發(fā)明更特別涉及利用兩步處理法體外產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，第一步，在存在至少一種足夠?qū)⑷伺咛ジ杉?xì)胞誘導(dǎo)分化成胚狀體的量的生長因子的情況下，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述胚胎衍生干細(xì)胞；第二步，在存在至少一種足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在含胚狀體的培養(yǎng)基中擴(kuò)增的量的生長因子的情況下，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述胚狀體。本發(fā)明還涉及人血管瘤集落形成細(xì)胞的制備。本發(fā)明還涉及使人血管瘤集落形成單位沿著造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞譜系分化的方法，以及制備部分或完全分化自血管瘤集落形成細(xì)胞的細(xì)胞類型的 方法。血管瘤集落形成細(xì)胞及由其分化出的細(xì)胞具有各種體內(nèi)外用途。能夠在體外如此大批量地產(chǎn)生擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞，首次揭示了可大量衍化人血管瘤集落形成衍生細(xì)胞類型的潛力，所述人血管瘤集落形成衍生細(xì)胞類型例如人造血干細(xì)胞、或內(nèi)皮細(xì)胞、分化的造血細(xì)胞(例如紅細(xì)胞和血小板)，它們將具有多種治療用途。此外，可將通過本發(fā)明衍生出的大量人血管瘤集落形成細(xì)胞以全新的治療策略用于治療造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞紊亂或用于血液庫存。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞(HSC)能夠自我更新，并能產(chǎn)生全部血細(xì)胞譜系。這些細(xì)胞位于骨髓，構(gòu)成成人造血系統(tǒng)的基礎(chǔ)。這些細(xì)胞的移植代表著現(xiàn)在臨床上最常見的基于細(xì)胞的治療。HSC移植被用于治療患急性或慢性白血病，再生障礙性貧血和多種免疫缺陷綜合癥，以及多種非血液惡性腫瘤和自身免疫紊亂的患者。對于患血液惡性腫瘤的患者,HSC移植可以拯救患者免于治療導(dǎo)致的發(fā)育不全(可以發(fā)生在高劑量化學(xué)療法和/或放射療法后)。盡管HSC移植被普遍應(yīng)用于臨床，但HSC的三種主要來源(人骨髓、外周血和臍帶血)有限，因為需要成體HSC移植的患者中的三分之二缺乏良好匹配的供者。例如，對于任何一個特定的患者，其兄弟姐妹的人類白細(xì)胞抗原(HLA)與其相匹配的機(jī)會只有25%。HLAs是位于細(xì)胞表面的蛋白，它幫助免疫系統(tǒng)識別哪些細(xì)胞是自我的(屬于自身)，哪些細(xì)胞是非我的(外源或來自于體外)。HLA蛋白由基因簇編碼，所述基因簇形成位于人6號染色體的被稱為主要組織相容性復(fù)合體(或MHC)的區(qū)域，由MHC基因座編碼的這些蛋白在移植排斥中發(fā)揮重要作用。因此，也將HLA蛋白稱為MHC蛋白。雖然使移植物的MHC分子與受者的MHC分子匹配能顯著提高臨床移植的成功率，但它不能杜絕排斥，即使移植發(fā)生在HLA相同的兄弟姐妹之間。這樣的排斥可能由次要組織相容性抗原之間的差異觸發(fā)。這些多態(tài)性抗原通常是與位于移植組織細(xì)胞上的MHC分子結(jié)合的"非我"的肽，而除非使用免疫抑制藥物，即便MHC抗原匹配，次要組織相容性抗原的差異也常會導(dǎo)致移植受者的免疫系統(tǒng)最終排斥移植物。
各有三種類型的I型HLA和II型HLA。將I型和II型HLA匹配者(一般是兄弟姐妹)稱為相關(guān)供者。存活率升高與受者和供者間I型HLA-A、HLA-B, HLA-C以及II型HLA-DRBl 和 HLA-DQBl 的匹配程度相關(guān)(Morishima 等，2002 Blood (99) :4200-6)。對于沒有相匹配的相關(guān)供者的患者而言，可通過搜索供者庫來提供具有HLA類型匹配的人。然而需要細(xì)胞或組織移植(例如HSC移植)的人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于現(xiàn)存的適合于移植的細(xì)胞和組織供應(yīng)。在這種情況下，常常不可能獲得受者M(jìn)HC蛋白和移植物的MHC蛋白之間的良好匹配便不奇怪了。所以，許多移植受者必需等待MHC匹配的移植物可獲得，或者接受MHC不匹配的移植物，忍受更大劑量的免疫抑制藥物，卻仍然要冒排斥的風(fēng)險。因此能夠產(chǎn)生和操作HSC，和/或誘導(dǎo)受者對移植物的耐受，將會大大利于人類疾病的治療和處理。根據(jù)在鳥胚胎，以及隨后在蛙和哺乳動物中的研究工作，已證明血液和內(nèi)皮的發(fā)育程序緊密相關(guān)。例如內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞同時形成，在卵黃囊血島中相距很近。所述卵黃囊血島衍生自定居于卵黃囊的中胚層細(xì)胞的聚集物。這些聚集物的中心生成胚胎造血細(xì)胞，而外周群分化為內(nèi)皮細(xì)胞，它形成圍繞內(nèi)部血細(xì)胞的血管系統(tǒng)。這些觀察結(jié)果支持內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞具有共同祖先的觀點(diǎn)。另外，在斑馬魚和小鼠胚胎中，內(nèi)皮譜系和造血譜系共享某些基因的表達(dá)，例如卩1讓1、卩1七1、！161、1162、0)34、5。1和1 11狀1(卩1的等，1990 Blood(75) :2417-2426 ；Millauer等，1993 Cell (72) :835-846 ;Yamaguchi 等，I993Development (II8) :489-498 ；Anagnostou等，1994 PNAS USA(91) :3974-3978 ;Kallianpur 等，1994 Blood(83) :1200-12081 ;Young等，1995 Blood(85) :96-105, Asahara 等，1997 Science (275) :964-967 ；Kabrun 等，1997 Development (124) :2039-2048)。同樣，某些基因突變影響內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞的發(fā)育(Shalaby 等，1995 Nature (376) :62-66 ;Robb 等，1995 PNAS USA (92) :7075-7079 ；Shivdasani 等，1995 Nature (373) :432-434, Stainier 等，1995Development (121)3141-3150 ;Bollerot 等，2005 APMIS (113) :790-803)。而且，F(xiàn)lkl 或者 Fltl 的缺失(它們兩個都是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的受體)導(dǎo)致破壞小鼠胚胎的造血和內(nèi)皮發(fā)育。已有文獻(xiàn)報導(dǎo)從小鼠胚胎干細(xì)胞體外生成小鼠成血管細(xì)胞(Choi等，1998Development 125:727-732)。而且已從人ES細(xì)胞衍生出能產(chǎn)生造血和內(nèi)皮兩種細(xì)胞的人前體細(xì)胞(Wang 等,2004 Immunity(21) :31-41 和 Wang 等,J Exp Med(201)1603-1614)，但是量少，最多數(shù)百個細(xì)胞。此外，尚無體外擴(kuò)增成血管細(xì)胞前體細(xì)胞的方法或條件。因此需要一種方法產(chǎn)生和擴(kuò)增大量人成血管細(xì)胞以及成血管細(xì)胞衍生細(xì)胞類型(即造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)，還需要所有含有所述量的成血管細(xì)胞或其衍生細(xì)胞類型的溶液/混合物。所述方法能增加細(xì)胞移植的有效性，也能用于各種其他治療，例如誘導(dǎo)免疫耐受性。另一個急需用途是用于輸血的血液。紅十字會及其他血液供應(yīng)單位報道幾乎經(jīng)常血液短缺。這種情況在血型獨(dú)特的患者，Rh+患者，或者事故或災(zāi)難導(dǎo)致的大量傷亡中尤甚。另外，戰(zhàn)時軍隊急需用于治療戰(zhàn)爭相關(guān)的創(chuàng)傷的可用血液。本發(fā)明提供用于血液庫存和輸血的分化的造血細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞和方法將更安全可靠，優(yōu)點(diǎn)在于無需傳統(tǒng)的對獻(xiàn)血者的依賴，并將有助于預(yù)防可用血液的嚴(yán)重短缺。發(fā)明概述
本發(fā)明通過提供體外產(chǎn)生和擴(kuò)增人成血管細(xì)胞或血管瘤集落形成細(xì)胞的方法來克服了上述問題。根據(jù)本文公開的新方法擴(kuò)增人成血管細(xì)胞或血管瘤集落形成細(xì)胞的能力允許產(chǎn)生可被用于各種治療用途的細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供產(chǎn)生可用于治療用途的人成血管細(xì)胞或血管瘤集落形成譜系細(xì)胞(即，造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的方法。本發(fā)明的方法還被用于產(chǎn)生大量可以商業(yè)規(guī)模應(yīng)用的人成血管細(xì)胞或血管瘤集落形成細(xì)胞以及造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，及其分化細(xì)胞。
本發(fā)明提供體外產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟(a)在存在至少一種足夠?qū)⑷伺咛パ苌?xì)胞誘導(dǎo)分化成胚狀體的量的生長因子的情況下，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含所述胚胎衍生干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物；和(b)向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，并繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，其中所述生長因子的量足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在所述胚狀體培養(yǎng)物中擴(kuò)增，其中在所述方法步驟(a)和(b)的整個過程中使所述干細(xì)胞、胚狀體和血管瘤集落形成細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明也提供體外產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟(a)在存在至少一種足夠?qū)⑷伺咛パ苌?xì)胞誘導(dǎo)分化成胚狀體的量的生長因子的情況下，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含所述胚胎衍生細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，并繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，其中所述生長因子的量足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在所述胚狀體培養(yǎng)物中擴(kuò)增，(C)將所述胚狀體解聚為單細(xì)胞；(d)向所述含所述單細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，并繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，其中所述生長因子的量足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在含所述單細(xì)胞的培養(yǎng)物中擴(kuò)增，其中在所述方法步驟(a)-(d)的整個過程中使所述干細(xì)胞、胚狀體和血管瘤集落形成細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的某些實施方案中，所述生長因子是包含同源異型盒蛋白，或功能變體，或其活性片段的蛋白。在某些實施方案中，所述同源異型盒蛋白是包括H0XB4，或其功能變體，或活性片段的蛋白。H0XB4可以是哺乳動物H0XB4，包括小鼠和人H0XB4。所述H0XB4蛋白可以是全長H0XB4蛋白。再一個實施方案中，所述H0XB4包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 4的氨基酸序列。在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的某些實施方案中，所述包括H0XB4的生長因子是包括H0XB4和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)的融合蛋白。再一個實施方案中，通過接頭連接所述PTD和H0XB4。再一個實施方案中，所述PTD是TAT蛋白，其功能變體或活性片段(包括TAT多肽)。在某些實施方案中，所述TAT蛋白包括SEQ ID NO 14的氨基酸序列。再一個實施方案中，所述PTD包括如SEQ ID NO : 14所示的TAT多肽的一個或多個拷貝。在某些實施方案中，所述PTD是SEQ ID NO: 15。
在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的某些實施方案中，所述生長因子選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、骨形態(tài)生成蛋白(BMP)、干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3L(FL)促血小板生成素(TPO)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)。再一個實施方案中，在培養(yǎng)含有hES細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的0-48小時內(nèi)將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或骨形態(tài)生成蛋白(BMP)，或兩者加入到培養(yǎng)步驟(a)。又一個實施方案中，從開始步驟(a)的48_72小時內(nèi)將所述干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3L (FL)或促血小板生成素(TPO)，或它們的任何組合加入到含有hES細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中。在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的某些實施方案中，將包含H0XB4蛋白或其功能變體或活性片段(或結(jié)構(gòu)域)的生長因子加入到步驟(S)，其中加入所述蛋白數(shù)次，例如每日一次或隔日一次。在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的某些實施方案中，從開始步驟(a)的48-72小時內(nèi)將所述包含同源異型盒蛋白的生長因子加入到步驟(b)。在本發(fā) 明的方法的某些實施方案中，從開始步驟(a)的48-72小時內(nèi)將所述H0XB4蛋白或其功能變體或活性片段加入到步驟(b)。在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法還包括向步驟(b)中加入促紅細(xì)胞生成素(EPO)的步驟。在某些實施方案中，在0016段描述的本發(fā)明的方法還包括向步驟(b)和(d)中加入促紅細(xì)胞生成素(EPO)的步驟。在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法還包括純化和/或分離人血管瘤集落形成細(xì)胞的步驟(s)?？捎脦Э笴D71抗體的免疫親和柱層析純化所述血管瘤集落形成細(xì)胞?？砂创笮『?或形態(tài)分離所述血管瘤集落形成細(xì)胞。在本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的某些實施方案中，所述包含人胚胎衍生細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物來源于人胚胎干細(xì)胞文庫，其中所述人胚胎干細(xì)胞庫包括干細(xì)胞，每個都是人群中至少一種MHC等位基因的半合子或純合子，其中所述干細(xì)胞文庫的每個成員都是相對于所述庫中其他成員有不同的一套MHC等位基因的半合子或純合子。再一個實施方案中，所述人胚胎干細(xì)胞文庫包括干細(xì)胞，所述干細(xì)胞是人群中所有MHC等位基因的半合子或純合子。這些方法產(chǎn)生人血管瘤集落形成細(xì)胞文庫，每個都是人群中至少一種MHC等位基因的半合子或純合子，其中所述干細(xì)胞文庫的每個成員豆是相對于所述庫中其他成員不同的一套MHC等位基因的半合子或純合子。再一個實施方案中，這些方法產(chǎn)生人血管瘤集落形成細(xì)胞文庫,所述人血管瘤集落形成細(xì)胞是人群中所有MHC等位基因的半合子或純合子。因此，本發(fā)明也提供通過這些方法產(chǎn)生的人血管瘤集落形成細(xì)胞文庫?？扇缦率褂盟鑫膸?。本發(fā)明提供方法處理需要治療的患者，涉及將人造血干細(xì)胞或人內(nèi)皮細(xì)胞施用給所述患者，包括步驟(a)選擇所述患者；(b)鑒定在所述患者細(xì)胞表面表達(dá)的MHC蛋白；(c)提供之前的0024段描述的人血管瘤集落形成細(xì)胞文庫；
(d)從所述文庫中篩選與所述患者細(xì)胞上的所述患者M(jìn)HC蛋白匹配的人血管瘤集落形成細(xì)胞；(e)將步驟(d)中鑒定的所述人血管瘤集落形成細(xì)胞根據(jù)需求分化成人造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或兩者；(f)將從步驟(e)中得到的所述人造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或兩者施用給所述患者?？梢栽趨^(qū)域中心實施此方法，所述區(qū)域中心例如醫(yī)院或醫(yī)療中心，或任何其他適當(dāng)機(jī)構(gòu)。在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法還包括使所述人血管瘤集落形成細(xì)胞在適于將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人造血干細(xì)胞的條件下生長的步驟。在某些實施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法還包括使所述人血管瘤集落形成細(xì)胞在適于將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人內(nèi)皮細(xì)胞 的條件下生長的步驟。再一個實施方案中，所述適于將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人內(nèi)皮細(xì)胞的條件包括讓所述人血管瘤集落形成細(xì)胞在平板接種纖維連接蛋白的培養(yǎng)平板上生長。本發(fā)明的某些實施方案中，所述產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法產(chǎn)生至少10，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少50，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少100，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞,至少500，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少I X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少2 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少3 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞，或至少4X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞。這些方法產(chǎn)生可以包含10，000到4百萬個人血管瘤集落形成細(xì)胞的細(xì)胞溶液。因此，本發(fā)明也提供包含至少10，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少50，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少100，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少500，000個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少I X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少2 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞，至少3 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞，或至少4 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞的人血管瘤集落形成細(xì)胞(可在無血清培養(yǎng)基中生長)的溶液?？蓪⑦@些溶液注射給受試者。這些溶液可適用于冷凍。這些溶液可以不含血清。這些溶液中的人血管瘤集落形成細(xì)胞至少能夠分化成造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，但也具有分化成其他細(xì)胞類型的更大的發(fā)育潛力。本發(fā)明也提供這些溶液在制備用于治療可通過施用血管瘤集落形成細(xì)胞、造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞來治療的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也提供產(chǎn)生適于注射給患者的人血管瘤集落形成細(xì)胞溶液的方法，包括分離如前所述的細(xì)胞溶液的步驟，和將所述細(xì)胞置于適合注射給患者的溶液的步驟。本發(fā)明也提供產(chǎn)生適于冷凍的人血管瘤集落形成細(xì)胞溶液的方法，包括分離如前所述的細(xì)胞溶液的步驟，和將所述細(xì)胞置于適合冷凍的溶液的步驟。本發(fā)明也提供將人造血干細(xì)胞施用給有此需要的患者的方法，包括步驟(a)選擇有此需要的患者；(b)提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞；(C)將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞分化成人造血干細(xì)胞；和(d)將所有所述人造血干細(xì)胞中的一些施用給患者。本發(fā)明也提供將人造血干細(xì)胞施用給有此需要的患者的方法，包括步驟(a)選擇有此需要的患者；(b)以至少10，000個細(xì)胞的數(shù)量提供人血管瘤集落形成細(xì)胞；(C)將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞分化成人造血干細(xì)胞；和
(d)將一些或所有所述人造血干細(xì)胞施用給所述患者。本發(fā)明也提供將人內(nèi)皮細(xì)胞施用給有此需要的患者的方法，包括步驟(a)選擇有此需要的患者；(b)提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞；(C)將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞分化成人內(nèi)皮細(xì)胞；和(d)將一些或所有所述人內(nèi)皮細(xì)胞施用給所述患者。本發(fā)明也提供將人內(nèi)皮細(xì)胞施用給有此需要的患者的方法，包括步驟(a)選擇有此需要的患者； (b)以至少10，000個細(xì)胞的數(shù)量提供人血管瘤集落形成細(xì)胞；(C)將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞分化成人內(nèi)皮細(xì)胞；和(d)將一些或所有所述人內(nèi)皮細(xì)胞施用給所述患者。在某些實施方案中，所述人血管瘤集落形成細(xì)胞的數(shù)量在10，000到4百萬個細(xì)胞之間。本發(fā)明也提供治療需要治療的患者的內(nèi)皮細(xì)胞紊亂的方法，包括步驟(a)選擇有此需要的患者，(b)提供由上述方法產(chǎn)生和擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞，(C)將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞分化成人內(nèi)皮細(xì)胞，和(d)將一些或所有所述人內(nèi)皮細(xì)胞施用給所述患者。本發(fā)明也提供治療需要治療的患者的內(nèi)皮細(xì)胞紊亂的方法，包括步驟(a)選擇有此需要的患者；(b)以至少10，000個細(xì)胞的數(shù)量提供人血管瘤集落形成細(xì)胞；(c)將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞分化成人內(nèi)皮細(xì)胞；和(d)將一些或所有所述人內(nèi)皮細(xì)胞施用給所述患者。在某些實施方案中，所述人血管瘤集落形成細(xì)胞的數(shù)量在10，000到4百萬個細(xì)胞之間。有待用這些方法治療的內(nèi)皮細(xì)胞紊亂包括心肌梗塞、中風(fēng)、動脈粥樣硬化和缺血。所述缺血可發(fā)生在腦、四肢、心臟、肺、皮膚和眼。本發(fā)明提供體外產(chǎn)生人造血干細(xì)胞的方法，包括步驟(a)提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞；和(b)使所述人血管瘤集落形成細(xì)胞在適于將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人造血干細(xì)胞的條件下生長。本發(fā)明提供體外產(chǎn)生人內(nèi)皮細(xì)胞的方法，包括步驟(a)提供由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞；和(b)使所述人血管瘤集落形成細(xì)胞在適于將所述人血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人內(nèi)皮細(xì)胞的條件下生長。本發(fā)明也提供擴(kuò)增血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，包括在存在足夠支持所述血管瘤集落形成細(xì)胞增殖的量的包括同源異型盒蛋白(例如H0XB4)或其功能等效物或其活性片段的蛋白的情況下，使哺乳動物血管瘤集落形成細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長。所述待擴(kuò)增的血管瘤集落形成細(xì)胞可以從臍帶血、外周血或骨髓富集、純化，或者分離。所述血管瘤集落形成細(xì)胞可以是人血管瘤集落形成細(xì)胞。所述方法可以產(chǎn)生包含10，000到4X IO6個，或者更多的人血管瘤集落形成細(xì)胞的溶液。本方法使用的H0XB4蛋白可以是適用于本發(fā)明的產(chǎn)生和擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法的任何蛋白。本發(fā)明也提供利用由本發(fā)明方法產(chǎn)生和擴(kuò)增，或擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受性的方法。篩選與同種異體移植物共享組織相容性標(biāo)記物的耐受性人血管瘤集落形成細(xì)胞，并可將所述耐受性人血管瘤集落形成細(xì)胞于同種異體移植或細(xì)胞處理(再生患者需要的細(xì)胞功能)前，或與同種異體移植或細(xì)胞處理同時施用給人受者。產(chǎn)生的免疫耐受性隨即降低對同種異體移植物或細(xì)胞治療的急性或慢性排斥的風(fēng)險。
由本文公開的方法產(chǎn)生的大量血管瘤集落形成細(xì)胞能夠除去耐受方案中的毒性預(yù)處理步驟?？稍谥踩胍浦参?，或植入與供者血管瘤集落形成細(xì)胞匹配的器官、組織或細(xì)胞前給人受者施用供者的人血管瘤集落形成細(xì)胞?？蓮耐还┱攉@得所述人血管瘤集落形成細(xì)胞和移植物。所述移植物可以來源于分化的供者人血管瘤集落形成細(xì)胞。也可從不同供者獲得所述人血管瘤集落形成細(xì)胞和移植物，其中所述供者之間相匹配?？蓪⑺鋈搜芰黾湫纬杉?xì)胞施用給人受者，以在有此需要的受者中誘導(dǎo)耐受性。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人受者對供者同種異體移植物的耐受性的方法，其中所述方法包括步驟(a)給受者施用抑制T細(xì)胞共刺激的制劑(b)將由本文描述的方法產(chǎn)生和擴(kuò)增，或擴(kuò)增的人血管瘤集落形成細(xì)胞導(dǎo)入所述受者，和(C)將所述同種異體移植物移植給受者。所述人血管瘤集落形成細(xì)胞(供者細(xì)胞)促進(jìn)所述受者接受所述同種異體移植物。在某些實施方案中，抑制T細(xì)胞共刺激的制劑是抑制或阻斷CD40配體-CD40共刺激相互作用的制劑。所述方法還可包括施用抑制CD28-B7相互作用的制劑。所述方法可包括或不包括胸腺照射和/或T細(xì)胞耗盡或滅活。上述方法也可在沒有全身照射產(chǎn)生的造血空間(hematopoietic space)的情況下產(chǎn)生混合嵌合現(xiàn)象。本發(fā)明也提供促進(jìn)人受者對供者同種異體移植物的耐受性的方法，其中所述方法包括步驟(a)在所述受者中制造胸腺空間(thymic space) ； (b)在所述受者中耗盡或滅活供者反應(yīng)性T細(xì)胞；(C)將所述供者人血管瘤集落形成細(xì)胞或與所述供者匹配的人血管瘤集落形成細(xì)胞導(dǎo)入受者；和(d)將所述同種異體移植物移植給受者，其中所述供者血管瘤集落形成細(xì)胞誘導(dǎo)對所述同種異體移植物的耐受性。在某些實施方案中，所述方法不包括制造造血空間的照射。所述方法可包括通過給受者施用至少一種選自胸腺照射、類固醇、皮質(zhì)激素、布喹那(brequinar)、或免疫抑制劑或藥物來制造胸腺空間。本發(fā)明也提供產(chǎn)生適用于輸血的細(xì)胞的方法。例如本發(fā)明提供產(chǎn)生適用于輸血的紅細(xì)胞的方法。照這樣，本發(fā)明提供溶液，以幫助緩解獻(xiàn)血量的長期不足。在某些實施方案中，本發(fā)明提供將人血管瘤集落形成細(xì)胞體外分化成造血細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟(a)提供人血管瘤集落形成細(xì)胞；和(b)將所述血管瘤集落形成細(xì)胞分化成分化的造血細(xì)胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外分化自人血管瘤集落形成細(xì)胞的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血的方法，所述方法包括步驟(a)提供人血管瘤集落形成細(xì)胞；(b)將所述血管瘤集落形成細(xì)胞分化成分化的造血細(xì)胞；和
(c)用所述分化的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血。在某些實施方案中，所述血管瘤集落形成細(xì)胞恢復(fù)自冷凍培養(yǎng)物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外分化自人血管瘤集落形成細(xì)胞的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血的方法，所述方法包括步驟(a)在存在至少一種足夠?qū)⑷伺咛パ苌?xì)胞誘導(dǎo)分化成胚狀體的量的生長因子的情況下，培養(yǎng)包含所述胚胎衍生細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，其中所述生長因子的量足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在所述胚狀體培養(yǎng)物中擴(kuò)增；(C)將所述血管瘤集落形成細(xì)胞分化成分化的造血細(xì)胞；和(d)用所述分化的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血。在某些實施方案中，在所述方法步驟(a)的整個過程中使所述胚胎衍生細(xì)胞、胚狀體和血管瘤集落形成細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長。在某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外分化自人血管瘤集落形成細(xì)胞的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血的方法，所述方法包括步驟(a)在存在至少一種足夠?qū)⑷伺咛パ苌?xì)胞誘導(dǎo)分化成胚狀體的量的生長因子的情況下，培養(yǎng)包含所述胚胎衍生細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，其中所述生長因子的量足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在所述胚狀體培養(yǎng)物中擴(kuò)增；(C)將所述血管瘤集落形成細(xì)胞分化成分化的造血細(xì)胞；和(d)用所述分化的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血。在某些實施方案中，在所述方法步驟(a)和(b)的整個過程中使所述干細(xì)胞、胚狀體和血管瘤集落形成細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在某些實施方案中，所述血管瘤集落形成細(xì)胞恢復(fù)自冷凍培養(yǎng)物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供用體外分化自人血管瘤集落形成細(xì)胞的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血的方法，所述方法包括步驟(a)在存在至少一種足夠?qū)⑷伺咛パ苌?xì)胞誘導(dǎo)分化成胚狀體的量的生長因子的情況下，培養(yǎng)包含所述胚胎衍生細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)向所述含胚狀體的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，其中所述生長因子的量足夠使血管瘤集落形成細(xì)胞在所述胚狀體培養(yǎng)物中擴(kuò)增；(C)將所述胚狀體解聚成單細(xì)胞；(d)向所述含所述單細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入至少一種生長因子，其中生長因子的量足夠使人血管瘤集落形成細(xì)胞在所述含所述單細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增；(e)將血管瘤集落形成細(xì)胞分化成分化的造血細(xì)胞；和(f)用所述分化的造血細(xì)胞進(jìn)行輸血。在某些實施方案中，在所述方法步驟(a)-(b)的整個過程中使所述干細(xì)胞、胚狀體和血管瘤集落形成細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長。 在本發(fā)明的某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
在某些實施方案中，所述生長因子是包括同源異型盒蛋白，或其功能變體，或其活性片段的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，所述同源異型盒蛋白包括H0XB4蛋白，或其功能變體，或其活性變體。在某些實施方案中，所述分化的造血細(xì)胞以單個細(xì)胞類型產(chǎn)生。在某些實施方案中，所述單個細(xì)胞類型選自紅細(xì)胞、血小板或吞噬細(xì)胞。在某些實施方案中，所述吞噬細(xì)胞選自粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞。在某些實施方案中，其中所述紅細(xì)胞表達(dá)血紅蛋白F。在某些實施方案中，以約等于見于血液中的分化的細(xì)胞類型的比例混合所述單個細(xì)胞類型，其中所述見于血液中的分化的細(xì)胞類型的比例是96%的紅細(xì)胞、I %的血小板和3%的吞噬細(xì)胞。在某些實施方案中，在同一步驟中產(chǎn)生多種分化的造血細(xì)胞類型。在某些實施方案中，所述多種分化的造血細(xì)胞類型選自紅細(xì)胞、血小板或吞噬細(xì)胞。在某些實施方案中，所述吞噬細(xì)胞選自粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞。在某些實施方案中，紅細(xì)胞表達(dá)血紅蛋白F。在某些實施方案中，產(chǎn)生的以約等于 見于血液中的分化的造血細(xì)胞類型的比例產(chǎn)生所述多種分化的造血細(xì)胞類型，其中所述見于血液中的分化的細(xì)胞類型的比例是96 %的紅造血造血細(xì)胞、I %的血小板和3 %的吞噬細(xì)胞。在某些實施方案中，在輸血前向所述分化的造血細(xì)胞中加入血漿。在某些實施方案中，所述血管瘤集落形成細(xì)胞與患者匹配，以保證能產(chǎn)生患者自身血型的分化的造血細(xì)胞。在某些實施方案中，所述血管瘤集落形成細(xì)胞對抗原因子A、B、Rh或它們的任意組合呈陰性。在某些實施方案中，所述分化的造血細(xì)胞是紅細(xì)胞，且其中分化所述紅細(xì)胞的步驟包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)。本發(fā)明也提供人血管瘤集落形成細(xì)胞，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞與其他人血管瘤集落形成細(xì)胞松散粘連。在某些實施方案中，本發(fā)明也提供人血管瘤集落形成細(xì)胞，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞與其他人血管瘤集落形成細(xì)胞松散粘連。在某些實施方案中，本發(fā)明提供人血管瘤集落形成細(xì)胞，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞與其他人血管瘤集落形成細(xì)胞松散粘連，且其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞不表達(dá)⑶34蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明提供人血管瘤集落形成細(xì)胞，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞不表達(dá)下列任何一種蛋白CD34、CD31、KDR 和 CD 133。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含人血管瘤集落形成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞相互松散粘連。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含人血管瘤集落形成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞相互松散粘連。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含基本純化的人血管瘤集落形成細(xì)胞群的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞相互松散粘連，并且其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞不表達(dá)⑶34蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含分化自胚胎衍生細(xì)胞的人血管瘤集落形成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞相互松散粘連。在某些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含至少I X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含至少5 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞系。在某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞選自胚胎、卵裂球、胚泡或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含人血管瘤集落形成細(xì)胞的藥物制劑，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞相互松散粘連。 在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含人血管瘤集落形成細(xì)胞的藥物制劑，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述人血管瘤集落形成細(xì)胞相互松散粘連。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含人血管瘤集落形成細(xì)胞的藥物制劑，所述細(xì)胞至少能分化產(chǎn)生造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞類型，其中所述血管瘤集落形成細(xì)胞不表達(dá)下列任何一種蛋白CD34、CD31、KDR 和 CD 133。在某些實施方案中，所述藥物制劑包含至少I X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實施方案中，所述制劑包含至少5 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實施方案中，所述包含血管瘤集落形成細(xì)胞的藥物制劑分化自胚胎衍生細(xì)胞。在某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞選自胚胎、卵裂球、胚泡或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供之前任何一段所述血管瘤集落形成細(xì)胞的冷藏制劑。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含至少IXlO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞的冷藏制齊U，其中所述血管瘤集落形成細(xì)胞不表達(dá)下列任何一種蛋白⑶34、⑶31、KDR和⑶133。在某些實施方案中，所述冷藏制劑包含至少5 X IO6個人血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實施方案中，所述含有人血管瘤集落形成細(xì)胞的冷藏制劑不表達(dá)CD34蛋白。在某些實施方案中，所述含有人血管瘤集落形成細(xì)胞的冷藏制劑不表達(dá)CD34、CD31、CD133和KDR蛋白。在某些實施方案中，所述含有人血管瘤集落形成細(xì)胞的冷藏制劑表達(dá)LM02 和 GATA2 蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含有分化自前述血管瘤集落形成細(xì)胞的造血細(xì)胞的培養(yǎng)物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含有分化自前述血管瘤集落形成細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含有分化自前述血管瘤集落形成細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含有分化自前述血管瘤集落形成細(xì)胞的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)物。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供上述人血管瘤集落形成細(xì)胞在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。在某些實施方案中，本發(fā)明提供上述細(xì)胞培養(yǎng)物在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。在某些實施方案中，本發(fā)明提供上述藥物制劑在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。本發(fā)明涵蓋前述本發(fā)明的任何方面和實施方案的組合。附圖簡述圖I顯示衍生自成血管細(xì)胞的造血CFU，所述成血管細(xì)胞產(chǎn)生自Hl-GFP ES細(xì)胞。圖2顯示培養(yǎng)于無血清(干細(xì)胞系)培養(yǎng)基中的紅細(xì)胞系集落形成單位(CFU-E)的細(xì)胞形態(tài)。圖3顯示培養(yǎng)于無血清(干細(xì)胞系)培養(yǎng)基中的多能集落形成單位(CFU-GEMM/Mix)的細(xì)胞形態(tài)。圖4顯示培養(yǎng)于無血清(干細(xì)胞系)培養(yǎng)基中的多能集落形成單位(CFU-GEMM/Mix)的細(xì)胞形態(tài)。圖5顯示培養(yǎng)于無血清(干細(xì)胞系)培養(yǎng)基中的粒細(xì)胞集落形成單位(CFU-G)和巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-M)的細(xì)胞形態(tài)。圖6顯示培養(yǎng)于無血清(干細(xì)胞系)培養(yǎng)基中的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)和巨核細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-Mk)的細(xì)胞形態(tài)。圖7顯示通過將衍生自(a)H9 ES細(xì)胞和(b)ACT30 ES細(xì)胞的成血管細(xì)胞重接種于基于基質(zhì)膠的培養(yǎng)基中而形成管-索結(jié)構(gòu)。圖8顯示由如實施例2所述培養(yǎng)于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中的EGM-2培養(yǎng)基中后，再培養(yǎng)于基質(zhì)膠培養(yǎng)基中的Hl-GFP ES細(xì)胞產(chǎn)生的成血管細(xì)胞管-索結(jié)構(gòu)。圖8也顯示當(dāng)如實施例2所述將細(xì)胞與Alexa fluor標(biāo)記的Ac-LDL溫育時對Ac-LDL的吸收。中圖上和右圖上顯不相差圖。圖9顯示由如實施例2所述培養(yǎng)于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中的EGM-2培養(yǎng)基中的Hl-GFP ES細(xì)胞產(chǎn)生的成血管細(xì)胞中von Willebrand因子(vWF)(淺灰色染色)的表達(dá)。

圖10顯示如實施例4所述注射到SCID小鼠中的經(jīng)蘇木精和曙紅(H&E)染色的基質(zhì)膠填料橫切片中的血管形成。圖11顯示如實施例4所述針對人特異核抗體的陽性染色(淺灰色染色)表明，基質(zhì)膠填料橫切片中的血管是衍生自人成血管細(xì)胞的細(xì)胞。圖 12 顯示人 H0XB4(登錄號 NM_024015. 4 ;GI :85376187) (SEQ ID NO :2)的 mRNA序列。圖13 顯示人 H0XB4(登錄號 NP_076920. I ；GI :13273315) (SEQ ID NO :1)的氨基
酸序列。圖14 顯示人 H0XB4(登錄號 BC049204. I ；GI :29351567) (SEQ ID NO :4)的 mRNA 序列。圖15 顯示人 H0XB4(登錄號 AAH49204. I ；GI :29351568) (SEQ ID NO :3)的氨基酸、序列。圖16顯示如實施例I和2所述衍生自人ES細(xì)胞的成血管細(xì)胞(BL-CFC)的表型特征(a)成血管細(xì)胞集落 或胚細(xì)胞集落(BL-CFC或BC，X 400) ； (b)次級EB (X 400) ； (c)經(jīng)賴-吉染色的胚細(xì)胞(hES-BC細(xì)胞)(X1000) ； (d-f) =GATA-I染色；(d)用GATA-1染色的胚細(xì)胞(X600)和(e)用GATA-I和DAPI染色的胚細(xì)胞；(f)用GATA-1和DAPI染色的BM細(xì)胞(X400)。(g-i) LM02染色；(g)用LM02染色的胚細(xì)胞(X600)和(h)用LM02和DAPI染色的胚細(xì)胞(X600)；⑴用LM02和DAPI染色的K562細(xì)胞(X1000) ； (j-m) :CD71染色(亮灰色或淺灰色)；(j)用CD71染色的胚細(xì)胞(X600)和(k)用CD71和DAPI染色的胚細(xì)胞(X600) ； (m)用CD71和DAPI染色的BM細(xì)胞(X1000) ； (n-p) CXCR-4染色(亮灰色或淺灰色)；(n)用CXCR-4染色的胚細(xì)胞(X600)和(o)用CXCR-和DAPI染色的胚細(xì)胞(X600) ;(p)用CXCR-4和DAPI染色的BM細(xì)胞(X600) ; (q_s)Epo受體染色(中灰色)；(q)用Epo受體染色的胚細(xì)胞(X600)和(r)用Epo受體和DAPI染色的胚細(xì)胞(X600)；(s)用Epo受體和DAPI染色的BM細(xì)胞(X 600) ; (t_v) Tpo受體染色(中灰色)；⑴用Tpo受體染色的胚細(xì)胞(X600)和(U)用Tpo受體和DAPI染色的胚細(xì)胞(X600) ； (v)用Tpo受體和DAPI染色的BM細(xì)胞(X 1000)。注意將本圖(d)和(n)中的hES_BC(成血管細(xì)胞)細(xì)胞用GATA-I和CXCR-4抗體進(jìn)行雙重染色，但分別呈現(xiàn)；也將本圖(q)和⑴中的hES-BC (成血管細(xì)胞)細(xì)胞用Epo-受體和Tpo-受體抗體進(jìn)行雙重染色，并分別呈現(xiàn)。圖17顯示體外衍生自人ES細(xì)胞的成血管細(xì)胞(BL-CFC或胚細(xì)胞)的功能特征(a-d)衍生自經(jīng)純化的成血管細(xì)胞的造血CFU (a) CFU-紅細(xì)胞系(X 100) ； (b) CFU-粒細(xì)胞(XlOO) ; (c)CFU-巨噬細(xì)胞；和(d)CFU-多譜系(混合，X 100) ; (e_h)CFU-細(xì)胞的Wright-Giemsa 染色(e)紅細(xì)胞系(XlOOO) ； (f)粒細(xì)胞(XlOOO) ； (g)巨噬細(xì)胞(X400)和(h)，混合(X 1000)。(i-k) :CFU細(xì)胞的免疫染色(i)用CD235a染色的CFU-紅細(xì)胞(箭標(biāo)，X 1000) ； (j)用CD13染色的CFU-粒細(xì)胞(箭標(biāo)，X 1000)和(k)用CD45染色的CFU-混合細(xì)胞(箭標(biāo)，X 1000)。(m-p和v-y)混合的CFU細(xì)胞的FACS分析(m)小鼠IgG同種型對照；(n) CD45 ； (O) CD13 和(p) CD235 ； (v)小鼠 IgG 同種型對照；(w) CD45 和 CD235a ； (x) CD13和⑶45 ;和(y)⑶13和⑶235a。(q_u和z-cc)衍生自經(jīng)純化的成血管細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞，或胚細(xì)胞或hES-BC細(xì)胞(q)將衍生自成血管細(xì)胞的粘連細(xì)胞平板接種后在基質(zhì)膠上形成的毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)(X100) ;(r)衍生自成血管細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞的Ac-LDL吸收(灰色)(X200)；(s)衍生自成血管細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞的vWF表達(dá)(箭標(biāo))，用DAPI染色核(X600) ； (t)在衍生自成血管細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞中定位PEC AMI (亮色染色)，用DAPI染色核(圖中的圓形)(X200) ；(u)在衍生自成血管細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞中定位VE-該粘蛋白(箭標(biāo))，用DAPI染色核(圓形)(X200)。(z)最新的Ac-LDL(箭頭)和vWF表達(dá)(箭標(biāo)，X600) ;aa) Ac-LDL吸收(箭頭)和VE該粘蛋白的表達(dá)(箭標(biāo)，X 600) ； (bb) vWF (箭標(biāo))和CD31 (箭頭，X 600)的表達(dá)；(Cc)VE-該粘蛋白(箭標(biāo))和⑶31 (箭頭，X 600)的表達(dá)。見實施例2。圖18顯示衍生自hES細(xì)胞的胚細(xì)胞集落的集落生成。(a-c):胚細(xì)胞集落的集落生成，(a)和(b)，在WAOl-GFP和MAOl EB的混合物中形成的兩個胚細(xì)胞集落，它們證明了所述胚細(xì)胞集落的克隆起源；(a)相位圖象(X 100) ； (b)GFP圖像(X 100) ； (c)從單個細(xì)胞形成的胚細(xì)胞集落(X400)。(d)和(e):在液體培養(yǎng)中擴(kuò)增單個胚細(xì)胞集落，觀察造血和內(nèi)皮兩種譜系(X200)。(d)，X 200(e), X400 ；(f-h):衍生自單個BC的內(nèi)皮細(xì)胞(f)在基質(zhì)膠上平板接種衍生自單個BC的粘附細(xì)胞后形成的毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)(XlOO) ；(g)衍生自單個BC的內(nèi)皮細(xì)胞對Ac-LDL的吸收(箭標(biāo))，用DAPI染色核(X400) ； (h)在單個BC衍生內(nèi)皮細(xì)胞中vWF的表達(dá)(箭標(biāo))，用DAPI染色核(X400)。(i-m):衍生自單個BC的造血 CFU: (i) CFU-紅細(xì)胞系(X100) ;(j) CFU-粒細(xì)胞(X100) ;(k)CFU_ 巨噬細(xì)胞(X100)；和(m) CFU-多譜系(混合，X 100)。凝膠電泳圖顯示對衍生自WAOl-GFP+和MAOl-GFP細(xì)胞的平板接種混合物的GFP+和GFP-hES-BC (成血管細(xì)胞)中GFP序列的PCR分析。泳道WA01-GFP+，親本 WAOl/GFP+hES 細(xì)胞；MA01 GFP,親本 MAOl hES 細(xì)胞；H20，水陰性對照；BC-GFP+,來自細(xì)胞混合接種物的GFP陽性BC ； 1-10,來自細(xì)胞混合接種物的GFP陰性BC。將肌形成蛋白基因用作PCR反應(yīng)對照。見實施例2。圖19提供tPTD-H0XB4融合蛋白的特征。( A)融合了 6xHis的tPTD_H0XB4重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，用鎳ProBand樹脂對其進(jìn)行純化。通過SDS-PAGE凝膠電泳檢驗兩批(命名為(I)和(2))經(jīng)脫鹽的tPTD-H0XB4蛋白的純度和濃度。(B) tPTD_H0XB4蛋白在含5% FBS的培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，但是(C)在含活ES細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中保持完整(N =僅StemlineII培養(yǎng)基；h =小時)。圖20顯示全身注射hES-衍生成血管細(xì)胞后缺血視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的穩(wěn)健修復(fù)。通過對小鼠眼前房施加2小時流體靜壓來誘導(dǎo)視網(wǎng)膜缺血。七天后玻璃體內(nèi)或者靜脈內(nèi)注射經(jīng)熒光標(biāo)記的(GFP+)成血管細(xì)胞。一天后對動物實施安樂死。將眼摘出、解剖，并將視網(wǎng)膜展平，用激光掃描共聚焦顯微術(shù)成像，或進(jìn)行切片用于成像，(a)來自典型對照(未受傷害的)眼的拼接圖象，顯示典型的視網(wǎng)膜血管解剖學(xué)沒有綠色熒光背景；也各自顯示了 GFP+通道(下插圖)和GFP-通道(上插圖)；(b)來自同一動物的經(jīng)處理的眼的拼接圖象，顯示經(jīng)熒光標(biāo)記的(GFP+)成血管細(xì)胞衍生細(xì)胞(血管系統(tǒng)的明亮區(qū)域)摻入缺血的血管系統(tǒng)；也各自顯示了綠色細(xì)胞(GFP+成血管細(xì)胞，下插圖)和未標(biāo)記細(xì)胞(上插圖)，如實施例5所述。(c)未受損傷的對照的拼接圖象(沒有GFP熒光(亮灰或淺灰))，(d)和(e)是全身注射成血管細(xì)胞2天后(d)和7天后(e)缺血眼的拼接圖象(GFP+細(xì)胞顯示亮灰或淺灰)。(f，X 600，共聚焦)，熒光免疫細(xì)胞化學(xué)共定位成血管細(xì)胞(hES-BC)細(xì)胞-衍生的內(nèi)皮細(xì)胞存在于經(jīng)歷了 I/R損傷的小鼠眼橫切片的受損傷的血管系統(tǒng)中；相鄰內(nèi)界膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中的血管腔的高倍放大視圖顯示所述血管腔被內(nèi)皮細(xì)胞(箭頭，CD31)和衍生自成血管細(xì)胞(hES-BC)的成熟內(nèi)皮細(xì)胞圍繞(箭標(biāo),人核抗原)。上插圖和中插圖各自是用來制造合成圖象的人核抗原和⑶31通道。下插圖是同一區(qū)域的低倍放大視圖，其中方框顯示全圖(all panels)描繪的區(qū)域。V =玻璃體；IPL =內(nèi)叢狀層；RPE =視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層；Ch =脈絡(luò)膜。見實施例5。圖21顯示成血管細(xì)胞、或胚細(xì)胞或hES-BC細(xì)胞摻入糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。(a)和(b)顯示向玻璃體內(nèi)施用成血管細(xì)胞2天后，糖尿病大鼠的融合的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)圖像，顯示成血管細(xì)胞大范圍摻入大小血管(明亮區(qū)域或淺灰色區(qū)域)；(C)，施用成血管細(xì)胞2天后，對照大鼠(非糖尿病大鼠)的融合，顯示成血管細(xì)胞(或成血管細(xì)胞衍生細(xì)胞)并為摻入血管系統(tǒng)而形成位于視網(wǎng)膜頂部的層(淺灰色層)。(d，X 100)，向非糖尿病對照大鼠玻璃體內(nèi)注射胚細(xì)胞2天后得到的切片，它對人核抗原染色呈陰性，但對內(nèi)皮明顯呈陽性(⑶31，箭標(biāo))。(e, X 100)和(f，X600，共聚焦)是向糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射成血管細(xì)胞2天后得到的大鼠眼切片，并用CD31和人核抗原抗體進(jìn)行染色，清楚地顯示用CD31和人核抗原的染色共定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的血管腔中內(nèi)襯的細(xì)胞中，剛好位于將神經(jīng)視網(wǎng)膜從玻璃體中分離的內(nèi)界膜后(箭標(biāo)表示明亮區(qū)域)。見實施例6。圖22顯示注射成血管細(xì)胞后缺血后肢肌肉和梗塞心臟中的內(nèi)皮分化。a、b、h和i :梗塞心臟中成血管細(xì)胞或hES-BC細(xì)胞的分化。(a(200X))，用人特異性vWF抗體免疫染色的對照小鼠的梗塞心肌切片，顯示沒有人vWF著色；(b，200X)和(i，X600共聚焦)，注射成血管細(xì)胞4周后的用人特異性vWF抗體免疫染色((b)和(i)的淺灰色或明亮區(qū)域)的梗塞心肌切片；(h)經(jīng)假手術(shù)(sham operation)、對照培養(yǎng)基和成血管細(xì)胞處理的小鼠的存活曲線。c-g :在缺血后肢肌肉中的成血管細(xì)胞分化，(c，50X)，用人特異性vWF抗體免疫染色的對照小鼠的后肢肌肉切片，顯示沒有人vWF著色；(d，50X)和(e，600X，共聚焦)，注射成血管細(xì)胞4周后的用人特異性vWF抗體免疫染色(淺灰色)的缺血后肢肌肉切片；
(f)通過手術(shù)誘導(dǎo)的缺血四肢中的血流恢復(fù)。將接受6 X IO5個成血管細(xì)胞的小鼠和僅僅接 受培養(yǎng)基的小鼠結(jié)扎后的3-30天連續(xù)監(jiān)控后肢血流。通過缺血肢和非缺血肢之間的流量比計算血流；(g)，激光多普勒血流圖像。對照(培養(yǎng)基)圖像和注射BC細(xì)胞的缺血動物圖像(每組n = 6)。見實施例7和8。圖23顯示GFP (最淺或最亮的區(qū)域)和cTnl (中灰)在心肌梗塞(MI)小鼠的心臟組織切片上的免疫染色(放大200X)。見實施例8。箭標(biāo)指出衍生自注射的成血管細(xì)胞(hES-BC)的雙陽性著色細(xì)胞。圖24顯示成血管細(xì)胞(hES-BC)分化成平滑肌細(xì)胞。對分離自成血管細(xì)胞(hES-BC)的RNA進(jìn)行PCR測定得知，成血管細(xì)胞表達(dá)平滑肌特異基因。成血管細(xì)胞(hES-BC)也體外分化成平滑肌細(xì)胞。鈣調(diào)理蛋白(calponin)和a-SMA的免疫染色顯示分化的細(xì)胞表達(dá)這兩種平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物。發(fā)明的詳細(xì)說明為有助于完全理解本發(fā)明，提供以下詳細(xì)說明。除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的一致。盡管可將與本文描述類似或等同的方法和材料用于本發(fā)明或測試本發(fā)明，下面描述適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧稀H將這些材料、方法和實施例用于說明，而非意在限制本發(fā)明的范圍。將本文提到的所有出版物、專利、專利公開和申請及其他文獻(xiàn)通過引用整體并入本文?？蓪⒄f明書中通篇使用的術(shù)語“包含”理解為包含一定的整數(shù)或整數(shù)群的意思，但并不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)群。為了進(jìn)一步定義本發(fā)明，提供下列術(shù)語和定義。本文使用的術(shù)語"人胚胎干細(xì)胞"(hES細(xì)胞)與本領(lǐng)域使用的一樣。所述術(shù)語包括衍生自人胚泡或桑椹胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的可以作為細(xì)胞系連續(xù)傳代的細(xì)胞。所述hES細(xì)胞可源于卵細(xì)胞與精子或DNA的受精，核移植，單性生殖，或通過使HLA區(qū)域純合的方法產(chǎn)生hES細(xì)胞。人ES細(xì)胞也源于合子，卵裂球，或胚泡階段的哺乳動物胚胎，可通過精子和卵細(xì)胞融合，核移植，單性生殖，或染色質(zhì)重編程及隨后將所述重編程的染色質(zhì)融合到質(zhì)膜而產(chǎn)生細(xì)胞來產(chǎn)生所述人ES細(xì)胞。本發(fā)明的人胚胎干細(xì)胞可以包括但不限于ACT-4、No. 3、H1、H7、H9、H14和ACT30胚胎干細(xì)胞。
術(shù)語“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域”(“PTD”)指可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，或者可協(xié)調(diào)或增加例如有PTD附著的另一個分子(例如蛋白結(jié)構(gòu)域)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的速度的任何氨基酸序列。所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域可以是天然存在的大蛋白的一部分(例如病毒蛋白(例如HIV TAT)的PTD)的結(jié)構(gòu)域或序列，或者是合成或人造的氨基酸序列。概述本發(fā)明提供產(chǎn)生和擴(kuò)增源自人胚胎衍生細(xì)胞的人血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，含人血管瘤集落形成細(xì)胞的制劑和組合物，產(chǎn)生從血管瘤集落形成細(xì)胞部分或終端分化的多種細(xì)胞類型的方法，治療性應(yīng)用血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，和治療性應(yīng)用從血管瘤集落形成細(xì)胞部分或終端分化的多種細(xì)胞類型的方法。術(shù)語“成血管細(xì)胞”和“血管瘤集落形成細(xì)胞”在本申請中可互換使用。這些細(xì)胞 可以基于多種結(jié)構(gòu)和功能特征進(jìn)行描述，包括但不限于，一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)(RNA或蛋白)或不表達(dá)(RNA或蛋白)。血管瘤集落形成細(xì)胞至少能夠分化成造血細(xì)胞類型或內(nèi)皮細(xì)胞類型。血管瘤集落形成細(xì)胞優(yōu)選有雙重潛能，至少能夠分化成造血細(xì)胞類型和內(nèi)皮細(xì)胞類型。同樣地，本發(fā)明的血管瘤集落形成細(xì)胞至少有一種潛能，優(yōu)選有雙重潛能。然而此夕卜，血管瘤集落形成細(xì)胞可具有更大程度的發(fā)育潛力，并在某些實施方案中，可分化形成其他譜系的細(xì)胞類型。在某些實施方案中，所述血管瘤集落形成細(xì)胞能夠分化形成其他中胚層衍生物，如心臟細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞)和/或平滑肌細(xì)胞。本發(fā)明也提供擴(kuò)增從任何來源或通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法獲得的哺乳動物血管瘤集落形成細(xì)胞的方法，所述任何來源的哺乳動物血管瘤集落形成細(xì)胞包括ES細(xì)胞，胚泡或卵裂球，胎盤或臍帶組織的臍帶血，外周血，骨髓，或其他組織。人血管瘤集落形成細(xì)胞還可以產(chǎn)生自人胚胎衍生細(xì)胞。人胚胎衍生細(xì)胞可以是基本上同質(zhì)種群的細(xì)胞，異質(zhì)種群細(xì)胞，或胚胎組織的全部或部分。作為可用于本發(fā)明方法的胚胎衍生細(xì)胞的例子的人血管瘤集落形成細(xì)胞可以產(chǎn)生自人胚胎干細(xì)胞。這樣的胚胎干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞，來源于或利用如無論是否由受精、體細(xì)胞核移植(SCNT)、單性生殖、雄核發(fā)育、或其他有性或無性方法產(chǎn)生的胚泡，平板培養(yǎng)的ICMs，一個或多個卵裂球，或其他前移植階段的胚胎或胚胎樣結(jié)構(gòu)部分。在某些實施方案中，成血管細(xì)胞還可分化成造血細(xì)胞，包括但不限于血小板和紅細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可用于輸血。能夠產(chǎn)生大量用于輸血的細(xì)胞將緩解全國血庫和醫(yī)院的血液長期存儲不足。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法使產(chǎn)生用于輸血的通用細(xì)胞。具體可容易得到0型和Rh-型紅細(xì)胞，并可以將它們作為輸血的通用血液來源。本發(fā)明的方法使體外大量擴(kuò)增成血管細(xì)胞，用于各種商業(yè)和臨床應(yīng)用。成血管細(xì)胞的體外擴(kuò)增指成血管細(xì)胞的增殖。當(dāng)本發(fā)明的方法能將人成血管細(xì)胞細(xì)胞擴(kuò)增到商業(yè)上有用的數(shù)量時，本發(fā)明也涉及大量的成血管細(xì)胞和包含大量人成血管細(xì)胞(例如至少10，000、100，000或500，000個細(xì)胞)的細(xì)胞制劑。在某些實施方案中，所述細(xì)胞制劑包含至少I X IO6個細(xì)胞。在其他實施方案中，所述細(xì)胞制劑包含至少2 X IO6個人成血管細(xì)胞，再一個實施方案中至少3 X IO6個人成血管細(xì)胞。仍在其他的實施方案中，所述細(xì)胞制劑包含至少4X IO6個人成血管細(xì)胞。本發(fā)明涉及包含10,000到4百萬或更多哺乳動物(例如人)成血管細(xì)胞的溶液，制劑，以及組合物。在所述溶液、制劑和組合物中的成血管細(xì)胞數(shù)目可以是10，000到4百萬，或以上中的任意值。所述數(shù)目可以是，例如20，000、50，000、100，000、500，000、1百萬
坐坐寸寸O類似地，本發(fā)明涉及人成血管細(xì)胞后代細(xì)胞(例如人造血細(xì)胞，包括人造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的制劑。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生、貯存和分配成血管細(xì)胞和/或成血管細(xì)胞譜系細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供適于給人或動物患者輸血的方法和溶液。在特定實施方案中，本發(fā)明提供制備紅細(xì)胞和/或血小板，和/或其他用于輸血的造血細(xì)胞類型的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明適用于向血庫和醫(yī)院提供用于在外傷或在血液相關(guān)疾病和病癥的治療中輸血的血液。在某些實施方案中，本發(fā)明提供通用供血細(xì)胞紅細(xì)胞。在某些實施方案中，所述紅細(xì)胞在輸血之前有功能，且表達(dá)血紅蛋白F。
本發(fā)明也提供人血管瘤集落形成細(xì)胞，含基本上純化的人血管瘤集落形成細(xì)胞群的細(xì)胞培養(yǎng)物，含人血管瘤集落形成細(xì)胞的藥物制劑和所述血管瘤集落形成細(xì)胞的冷藏制齊U。在某些實施方案中，本發(fā)明提供所述人血管瘤集落形成細(xì)胞在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。此外，本發(fā)明也提供所述細(xì)胞培養(yǎng)物在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途。本發(fā)明也提供所述藥物制劑在制備用于治療有此需要的患者病況的藥物中的用途?？梢愿鶕?jù)所述血管瘤集落形成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特性對其進(jìn)行識別和表征。在某些實施方案中，這些細(xì)胞具體是獨(dú)特的，因為它們相互之間松散粘連(與其他的血管瘤集落形成細(xì)胞松散粘連)。因為這些細(xì)胞僅僅相互松散粘連，可以只利用機(jī)械解離技術(shù)(而無需酶解技術(shù))即可將血管瘤集落形成細(xì)胞的培養(yǎng)物或集落解離成單細(xì)胞。這些細(xì)胞相互粘連足夠松散，僅僅只需要機(jī)械解離(而非酶解或者機(jī)械和酶解結(jié)合)就足以將培養(yǎng)物或集落解聚，基本上無損于細(xì)胞活力。換句話說，相比用酶解細(xì)胞團(tuán)塊后觀察到的實質(zhì)損傷和死亡，機(jī)械解離不需要可導(dǎo)致細(xì)胞實質(zhì)損傷和死亡的力度。此外，可以通過一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)或不表達(dá)(在基因或蛋白水平上估計)識別或表征血管瘤集落形成細(xì)胞。例如在某些實施方案中，可以根據(jù)一種或多種下列細(xì)胞表面標(biāo)記物的不表達(dá)(例如可以根據(jù)至少一種，至少兩種，至少三種或四種下列標(biāo)記物不表達(dá)來表征所述細(xì)胞)來識別或表征血管瘤集落形成細(xì)胞⑶34、KDR、⑶133或⑶31。此夕卜，也可以根據(jù)GATA2和/或LM02的表達(dá)來識別或表征血管瘤集落形成細(xì)胞。此外，也可以通過一種或多種標(biāo)記物(分析于表2)的表達(dá)或不表達(dá)來識別或表征(在基因或蛋白水平上估計)血管瘤集落形成細(xì)胞。可以根據(jù)這些結(jié)構(gòu)或功能特點(diǎn)中的一點(diǎn)或任意組合識別或表征本發(fā)明的血管瘤集落形成細(xì)胞。需知，雖然這些細(xì)胞可以有任意種來源，例如胚胎組織、產(chǎn)前組織、圍產(chǎn)期組織，所述術(shù)語"血管瘤集落形成細(xì)胞"適用于至少能夠分化形成造血細(xì)胞類型和/或內(nèi)皮細(xì)胞類型，并且具有一種或多種前述結(jié)構(gòu)或功能特點(diǎn)的無論任何的來源的細(xì)胞。體外分化人胚胎干細(xì)胞以獲得胚狀體和成血管細(xì)胞本發(fā)明提供產(chǎn)生和擴(kuò)增衍生自人胚胎干細(xì)胞，或人胚泡或卵裂球的人成血管細(xì)胞的方法。可純化和/或分離如此產(chǎn)生的所述成血管細(xì)胞。人血管瘤集落形成細(xì)胞還可以產(chǎn)生自人胚胎衍生細(xì)胞。人胚胎衍生細(xì)胞可以是基本上同質(zhì)種群的細(xì)胞，異質(zhì)種群細(xì)胞，或胚胎組織的全部或部分。作為可用于本發(fā)明方法的胚胎衍生細(xì)胞的例子的人血管瘤集落形成細(xì)胞可以產(chǎn)生自人胚胎干細(xì)胞。這樣的胚胎干細(xì)胞包括衍生自或利用無論是否由受精、體細(xì)胞核移植(SCNT)、單性生殖、雄核發(fā)育、或其他有性或無性方法產(chǎn)生的如胚泡，培養(yǎng)ICMs，一個或多個卵裂球，或其他前移植階段的胚胎或胚胎樣結(jié)構(gòu)部分的胚胎干細(xì)胞。此外，血管瘤集落形成細(xì)胞還可以產(chǎn)生自其他胚胎衍生細(xì)胞。例如，血管瘤集落形成細(xì)胞可以產(chǎn)生自(無需經(jīng)歷胚胎干細(xì)胞衍化步驟)或利用無論是否由受精、體細(xì)胞核移植(SCNT)、單性生殖、雄核發(fā)育、或其他有性或無性方法產(chǎn)生的平板培養(yǎng)的胚胎，ICMs，胚泡，滋養(yǎng)層/滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，一個或多個卵裂球，滋養(yǎng)層干細(xì)胞，胚胎生殖細(xì)胞，或移植前階段的胚胎或胚胎樣結(jié)構(gòu)的其他部分。血管瘤集落形成細(xì)胞還可以類似利用部分分化自胚胎衍生細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系產(chǎn)生。例如如果將人胚胎干細(xì)胞系用于產(chǎn)生比血管瘤集落形成細(xì)胞處于更早發(fā)育階段的的細(xì)胞，根據(jù)發(fā)展?jié)摿涂伤苄裕瑒t可將這樣的胚胎衍生細(xì)胞用于產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞。 此外，血管瘤集落形成細(xì)胞也可產(chǎn)生自其他產(chǎn)前或出生前后來源，包括但不限于臍帶、臍帶血、羊水、羊膜干細(xì)胞和胎盤。注意，當(dāng)血管瘤集落形成細(xì)胞產(chǎn)生自人胚胎組織時，可能需要形成胚狀體的步驟。然而，假設(shè)胚狀體的形成至少部分有助于重演發(fā)育早期胚層的三維空間相互作用，當(dāng)胚胎衍生細(xì)胞已經(jīng)具有實現(xiàn)與胚狀體形成步驟實質(zhì)上相同目的的結(jié)構(gòu)或組織時，這一步驟不是必需的。舉例來說，當(dāng)血管瘤集落形成細(xì)胞產(chǎn)生自平板培養(yǎng)的胚泡時，所述胚泡的細(xì)胞中間已經(jīng)存在三維空間組織水平。同樣地，無需胚狀體形成步驟來提供細(xì)胞間的信號，誘導(dǎo)的線索，或三維結(jié)構(gòu)。可將本發(fā)明的方法和用途用于產(chǎn)生源于胚胎衍生細(xì)胞的血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在某些其他實施方案中，所述胚胎衍生細(xì)胞是平板培養(yǎng)的胚胎，ICMs，胚泡，滋養(yǎng)層/滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，一個或多個卵裂球，滋養(yǎng)層干細(xì)胞，或早期移植前胚胎的其他部分。對于任何前述事項，所述胚胎衍生細(xì)胞可以來自由受精，體細(xì)胞核移植(SCNT)，單性生殖，雄核發(fā)育，或其他有性或無性方式產(chǎn)生的胚胎。在本申請中，當(dāng)描述具體涉及從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞的方法時，本發(fā)明類似預(yù)期產(chǎn)生來自或使用其他胚胎細(xì)胞的血管瘤集落形成細(xì)胞，，以及利用產(chǎn)生的細(xì)胞實施任何相同的治療用途。在本發(fā)明的某些方面，所述人胚胎干細(xì)胞可以是本方法的起始材料。可以用本領(lǐng)域已知的任何方法培養(yǎng)所述胚胎干細(xì)胞，例如在有無飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下。胚胎干細(xì)胞可以在含血清培養(yǎng)基中形成懸浮的胚狀體("EB" ) (Wang等，2005J Exp Med(201) :1603-1614 ；ffang 等，2004 Immunity(21) :31-41 ;Chadwick 等，2003Blood (102) :906-915)。然而血清的加入引入一些挑戰(zhàn)，包括實驗的可變性，成本，潛在感染物和有限的供應(yīng)。進(jìn)一步，對于臨床和某些商業(yè)應(yīng)用，血清的使用需要額外遵照美國政府和國際社會的關(guān)于生物制品的規(guī)定。本發(fā)明提供不使用血清從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生和擴(kuò)增人成血管細(xì)胞的方法。相對于需要血清的條件，所述無血清條件更有助于在好的生產(chǎn)工藝(GMP)指導(dǎo)下進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。此外，無血清條件延長加入到培養(yǎng)基的某些因子的半衰期(例如無血清培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)(包括生長因子、細(xì)胞因子和H0XB4)的半衰期增加)。在某些實施方案中，在本發(fā)明的所有方法中使用無血清培養(yǎng)基產(chǎn)生和擴(kuò)增人成血管細(xì)胞。產(chǎn)生和擴(kuò)增人成血管細(xì)胞的方法的第一步中，使人干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長，并將其誘導(dǎo)分化成胚狀體。為了誘導(dǎo)胚狀體形成，可將胚胎干細(xì)胞沉淀并重懸浮在無血清培養(yǎng)基(例如，在Stemline I或II培養(yǎng)基(Sigma )，培養(yǎng)基中補(bǔ)充有一種或多種形態(tài)因子和細(xì)胞因子，然后平板接種于附著性差(例如附著性超差)的培養(yǎng)皿上。形態(tài)因子和細(xì)胞因子可以包括但不限于，骨形態(tài)生成蛋白(例如BMP2、BMP-4、BMP-7，但非BMP-3)和VEGF、SCF和FL?？蓪⒐切螒B(tài)生成蛋白和VEGF單獨(dú)使用，或與其他因子聯(lián)合使用。可在細(xì)胞培養(yǎng)的0-48小時內(nèi)將形態(tài)因子和細(xì)胞因子加入到培養(yǎng)基。于這些條件下在存在早期造血擴(kuò)增細(xì)胞因子(包括但不限于促血小板生成素(TPO)、Flt-3配體和干細(xì)胞因子(SCF))的情況下進(jìn)行溫育，使所述平板培養(yǎng)的ES細(xì)胞形成EB。除TPO、Flt-3配體和SCF外，還可將VEGF、BMP-4和HoxB4加入到培養(yǎng)基。在一個實施方案中，使人ES細(xì)胞首先在BMP-4和VEGF165 (例 如25-100ng/ml)存在的條件下生長，然后在BMP-4、VEGF16S、SCF、TPO和FLT3配體(例如10-50ng/ml)和HoxB4(例如1.5_5iig/ml的本文公開的三重蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域_HoxB4融合蛋白)存在的條件下生長。可以在平板接種后48-72小時時加入所述額外因子。在本發(fā)明的方法中，人成血管細(xì)胞分離自早期胚狀體(“EB”)。從早期EB分離成血管細(xì)胞支持這些細(xì)胞的體外擴(kuò)增。對于人細(xì)胞，可以從生長短于10天的EB中獲得成血管細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實施方案中，成血管細(xì)胞細(xì)胞出現(xiàn)在生長2-6天的人EB中。根據(jù)一個實施方案，可從生長4-6天的人EB中鑒定和分離成血管細(xì)胞。在其他的實施方案中，使人EB生長2-5天，然后分離成血管細(xì)胞。在某些實施方案中，使人EB生長3-4. 5天，然后分離成血管細(xì)胞。在某些實施方案中，洗脫并解離早期EB (例如，使用胰蛋白酶/EDTA或膠原酶B)。將選定數(shù)量的細(xì)胞(例如2-5 X IO5個細(xì)胞)隨后與優(yōu)化成適于成血管細(xì)胞生長的無血清甲基纖維素培養(yǎng)基(例如BL-CFU培養(yǎng)基，如干細(xì)胞技術(shù)目錄H4436，或成血管細(xì)胞細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(HGM)，或含1.0%甲基纖維素于MDM，1-2%牛血清白蛋白，0. ImM 2-巰基乙醇，10 y g/ml rh_ 膜島素,200 u g/ml 飽和鐵人轉(zhuǎn)鐵蛋白，20ng/ml rh-GM-CSF, 20ng/ml rh-IL-3,20ng/ml rh-IL-6,20ng/ml rh-G_CSF(" rh"代表"重組的人 ")的任何培養(yǎng)基)混合?？上蛩雠囵B(yǎng)基補(bǔ)充早期細(xì)胞因子(包括但不限于，EPO、TPO、SCF、FL、FLt_3、VEGF、BMP (例如BMP2、BMP4和BMP7，但不是BMP3))和H0XB4 (或另一個同源異型盒蛋白)。在某些實施方案中，將促紅細(xì)胞生成素(EPO)加入到培養(yǎng)基。再一個實施方案中，將EPO、SCF、VEGF, BMP-4和HoxB4加入到培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，使所述細(xì)胞在EPO、TPO和FL存在的條件下生長。在某些H9是起始人ES細(xì)胞系的實施方案中，將EP0、TP0和FL加入到培養(yǎng)基。除EPO、TPO和FL外，源于H9或其他ES細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基還可包含VEGF、BMP-4和 HoxB4。將通過所述方法獲得的細(xì)胞(細(xì)胞可能在BL-CFU培養(yǎng)基中)(包括成血管細(xì)胞)平板接種于附著性超差的培養(yǎng)皿上，并在CO2恒溫箱中溫育直到長出成血管細(xì)胞集落。一些細(xì)胞可能形成次級EB。大約3-6天(且在一些情況下是3-4. 5天)后觀察到成血管細(xì)胞集落?？筛鶕?jù)成血管細(xì)胞集落特殊的葡萄狀形態(tài)和/或小尺寸將其與其他細(xì)胞如(如次級EB)區(qū)分開。另外，可通過某些標(biāo)記物的表達(dá)(例如，早期造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá))，以及至少能分化成造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力(見下文，衍生成成血管細(xì)胞譜系細(xì)胞)鑒定成血管細(xì)胞。例如當(dāng)成血管細(xì)胞缺乏成熟內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞的某些特征時，可通過某些標(biāo)記物的存在(例如CD71+)和其他標(biāo)記物的不存在(例如CD34-)鑒定這些細(xì)胞。成血管細(xì)胞也可表達(dá)GATA-I和GATA-2蛋白，CXCR-4和TPO和EPO受體。另外，成血管細(xì)胞可通過其他標(biāo)記物(例如⑶31、⑶34、KDR或其他粘附分子)不表達(dá)或低表達(dá)來表征。而且，成血管細(xì)胞的可通過某些基因(例如與成血管細(xì)胞和早期成紅血細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因(如SCL、LM02、FLT-1、胚胎胎兒球蛋白基因、NF-E2、GATA-U EKLF, ICAM-4、血型糖蛋白(glycophoriuns)和EPO受體)的表達(dá)進(jìn)行表征。因此，成血管細(xì)胞可按大小分離(小于其他細(xì)胞)或用抗⑶71+抗體純化，例如通過免疫親合柱層析。
成血管細(xì)胞細(xì)胞可以按大小和/或形態(tài)分離，過程如下。生長6到7天后，細(xì)胞混合物包含EB (圓形且呈多細(xì)胞團(tuán))盒成血管細(xì)胞(葡萄狀，小于EB，且是單細(xì)胞)。因此，成血管細(xì)胞可根據(jù)它們的形態(tài)和大小進(jìn)行分離。成血管細(xì)胞可以人工挑選，例如當(dāng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞混合物的時候。所述細(xì)胞接著可以生長成集落，每個集落具有100-150個細(xì)胞?？商暨x如上所述衍生的人成血管細(xì)胞集落，并重平板接種于甲基纖維素CFU培養(yǎng)基上，以形成造血CFU。在某些實施方案中，CFU培養(yǎng)基包括StemCell Technologies H4436。再一個實施方案中，將成血管細(xì)胞平板接種于補(bǔ)充有細(xì)胞因子及其他因子的Stemline II培養(yǎng)基上。例如可以人工挑選單個BL-CFC集落，并將其轉(zhuǎn)移到平板接種有纖維連接蛋白的含 Stemline II 和重組人 SCF(例如 20ng/ml)、TP0(例如 20ng/ml)、FL(例如 20ng/ml)、IL-3(例如 20ng/ml)、VEGF (例如 20ng/ml)、G_CSF (例如 20ng/ml)、BMP_4(例如 15ng/ml)、IL-6(例如10ng/ml)、IGF-1 (例如lOng/ml)、內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充因子(ECGS，例如100 u g/ml)、Epo (例如3U/ml)的培養(yǎng)皿上。體外生長一周后,可通過溫和移液移走非粘連的造血細(xì)胞，并直接用于造血CFU試驗。移去非粘附細(xì)胞后，可使粘附的細(xì)胞群在EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Cambrex )中再生長一周,然后檢驗vWF的表達(dá)。成血管細(xì)胞的體外擴(kuò)增本發(fā)明的某些方面涉及成血管細(xì)胞的體外擴(kuò)增。在某些實施方案中，如上所述，通過本發(fā)明方法擴(kuò)增的成血管細(xì)胞獲自源于人胚胎干細(xì)胞的早期胚狀體。除了來自人胚胎干細(xì)胞(hES細(xì)胞)的衍生成血管細(xì)胞以外，待擴(kuò)增的成血管細(xì)胞液可以分離自其他哺乳動物來源，例如哺乳動物胚胎(Ogawa等，2001 Int RevImmunol (20) :21_44，美國專利
發(fā)明者R·蘭扎, 盧世江 申請人:先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司