專利名稱：一種蛋白質結晶裝置和利用該裝置進行蛋白質結晶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于生物大分子結晶的裝置和方法，特別是用于提高蛋白質結晶條件篩選成功率的裝置和方法，屬于蛋白質結晶領域。
背景技術：
后基因組時代的到來，為治療許多難以治愈的疾病帶來了契機?；蚪M工程以治療人類疾病為新目標，通常不是基因本身而是由基因編碼的蛋白質作為潛在的藥物設計靶點。為了依據(jù)蛋白質結構設計藥物，首先必須獲得這些蛋白質的三維分子結構，可見蛋白質的結構對基于結構的理性藥物設計至關重要。當前世界范圍的結構基因組計劃已宣布將測定基因組中所有蛋白質的結構，但迄今為止，僅有部分的蛋白質結構被解析出來。根據(jù)公開的蛋白質三維結構數(shù)據(jù)庫G3DB, www.pdb.org)中的數(shù)據(jù)可知，X射線單晶衍射技術解析了88%以上的蛋白質結構，在所有生物大分子結構解析技術中占據(jù)著最重要的地位。對該技術而言，蛋白質晶體是其必不可少的衍射樣品，然而從純度很高的蛋白質到生長出具備衍射質量蛋白質晶體的成功率不足20%。因此,蛋白質晶體的制備一直以來都是蛋白質結構解析的瓶頸問題之一。在蛋白質結構解析中，蛋白質晶體的制備通常是通過大量的商業(yè)篩選試劑盒分別與蛋白質溶液混合，嘗試尋找出可使蛋白質結晶的條件，再基于此進行結晶條件的優(yōu)化以獲得衍射質量的晶體。因此蛋白質結晶條件篩選是晶體制備的必經(jīng)階段。而結晶板及不同的結晶方法對蛋白質結晶條件篩選有很大的影響，因此研發(fā)新的蛋白質結晶裝置以及新的結晶方法對于蛋白質結晶條件的篩選是非常必要的。蛋白質結晶條件的篩選一般采用氣相擴散法。氣相擴散法的原理是在一個封閉體系內，由于不含蛋白質大分子的池液中結晶劑的濃度高于蛋白質大分子結晶液滴中結晶劑的濃度，導致溶劑不斷從低濃度的蛋白質結晶溶液向高濃度的池液擴散，從而使結晶溶液中蛋白質和結晶劑的濃度不斷增加，直到結晶溶液與池液的蒸汽壓達到平衡。在此過程中蛋白質大分子結晶溶液逐漸達到過飽和，從而形成晶體。氣相擴散法主要包括坐滴法(如圖I)和懸滴法(如圖2)。在氣相擴散的密封體系中，主要包含有體積大且濃度較高、含有沉淀劑的池液，及體積小且濃度較低的蛋白質結晶溶液，一般是較低濃度的結晶溶液與較高濃度的池液通過氣相擴散達到濃度平衡。由于在擴散過程中結晶溶液中蛋白質和沉淀劑的濃度都升高，使蛋白質的溶解度降低且達到一定的過飽和從而發(fā)生晶體的形核與生長。一般結晶溶液中的沉淀劑濃度是池液中沉淀劑濃度的1/2，這種情況下，結晶溶液的沉淀劑濃度最大只能擴展到與池液相同的濃度。但是在傳統(tǒng)的氣相擴散法中，雖然結晶溶液濃度不斷濃縮直至與池液平衡，如果池液的濃度不足以使蛋白質結晶溶液濃縮至蛋白質大分子形核的過飽和度，則即使所使用的篩選試劑能在更高濃度下獲得晶體，但在實際篩選時卻得不到晶體。在蛋白質結晶中，獲得高純度蛋白質比較困難，因此蛋白質是非常珍貴的。在目前高通量的蛋白質結晶條件篩選中，結晶液滴的用量可達到0. 05 4 i! L，結晶溶液的用量很、少，非常容易揮發(fā)，因此一般實驗室都采用自動化的加樣系統(tǒng)及觀測系統(tǒng)。在蛋白質結晶條件篩選中，通常采用的是符合國際標準的結晶板，符合此標準的結晶板都可實現(xiàn)自動化的加樣以及晶體圖像的采集。生物大分子結晶條件篩選成功率一般定義為成功結晶的條件數(shù)與總的結晶條件數(shù)的比值。Chen-Yan Zhang 和 Da-Chuan Yin 等人米用 Hampton Research 公司貨號為HR2-134的IndexTM 96結晶條件篩選試劑盒對多種蛋白質的結晶條件進行了篩選(Cycling Temperature Strategy A Method to Improve the Efficiency ofCrystallization Condition Screening of Proteins. Crystal Growth&Design，2008，8(12) :4227-4232)。該文獻報 道的方法中，蛋白質的初始濃度全部為20mg/ml，蛋白質晶體的生長周期為2天。在傳統(tǒng)氣相擴散法-懸滴法下這些蛋白質的結晶條件篩選成功率依次是溶菌酶結晶條件篩選成功率為29. 2 %，過氧化氫酶的結晶條件篩選成功率為15. 6%，糜蛋白酶原A II的結晶條件篩選成功率為26%，刀豆球蛋白A VI的結晶條件篩選成功率為4. 2%，蛋白酶K的結晶條件篩選成功率為58. 3%，索馬甜蛋白的結晶條件篩選成功率為3.1%，核糖核酸酶A VII的結晶條件篩選成功率為I%，枯草桿菌蛋白酶A VII的結晶條件篩選成功率為O。傳統(tǒng)方法篩選蛋白質結晶條件過程中每個蛋白質結晶溶液相互獨立，結晶溶液之間不發(fā)生相互擴散，每個蛋白質結晶溶液只是與其對應的池液發(fā)生氣相擴散。因此在傳統(tǒng)氣相擴散法的蛋白質結晶條件篩選中，結晶溶液的濃度只能擴展到與池液相同的程度，濃度擴展的范圍比較窄。同時會出現(xiàn)一些澄清的蛋白質結晶溶液與產生沉淀的蛋白質結晶溶液，即一些蛋白質結晶溶液沒有得到足夠的濃縮，而另一些蛋白質結晶溶液出現(xiàn)過分的濃縮。因此，通常由于濃度擴展區(qū)間的不足而使一些本來可以結晶的條件被遺漏，從而導致蛋白質結晶條件篩選的成功率變差。而且商業(yè)上使用的結晶板一般都比較昂貴且不能夠重復使用，使結晶的成本很高。

發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種蛋白質結晶裝置，結構簡單，使用方便，適用于市場上現(xiàn)有的所有高通量完全自動化的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)，能夠明顯的降低蛋白質分子結晶操作的費用，提高結晶效率，顯著提高蛋白質結晶條件篩選成功率，得到的蛋白質晶體的分辨率聞，結晶蛋白質的晶體質量提聞。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是一種蛋白質結晶裝置，包括結晶本體和密封部件，在結晶本體上設有凹槽，用于放置待結晶的蛋白質溶液，密封部件覆蓋在結晶本體上，密封所述的凹槽，形成密封的蛋白質結晶空間。所述的凹槽也可以分別設置在結晶本體的兩個相對的側面上。其中，所述結晶本體上的凹槽的形狀與市場上現(xiàn)有的所有高通量完全自動化的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相一致。使其能夠與現(xiàn)有的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相配合使用。所述的密封部件選擇透明膠帶、結晶封板膜、結晶專用密封膠帶或透明的密封膜中的一種。所述結晶本體選擇透明材質的材料制成，包括有機玻璃、鋼化玻璃、塑料、石英玻璃、高硅氧玻璃、普通平板玻璃、鉛硅酸鹽玻璃、鋁硅酸鹽玻璃、硼硅酸鹽玻璃、或鈉鈣玻璃中的一種。在所述凹槽的底部還設有若干相互分離的儲液槽，用于放置蛋白質結晶溶液，并且使得放置于儲液槽內的蛋白質結晶溶液相互分離，不會相互混合或聚集。所述儲液槽的個數(shù)為24、48、96、192、288或384。本發(fā)明還提供一種利用上述蛋白質結晶裝置進行蛋白質結晶的方法，包括如下順序進行的步驟I)制備蛋白質溶液
將蛋白質加入到緩沖溶液中，溶解，然后通過過濾去除雜質，制成蛋白質溶液；2)制備蛋白質結晶溶液將蛋白質結晶篩選試劑盒中的結晶劑轉移到上述蛋白質結晶裝置的同一個凹槽內，結晶劑之間相互分離，彼此不接觸，然后將蛋白質溶液轉移到蛋白質結晶裝置的凹槽內與蛋白質結晶劑混合制得不同結晶條件的蛋白質結晶溶液；3)蛋白質結晶用密封部件密封蛋白質結晶裝置的凹槽，于恒溫條件下靜置，結晶。步驟I)中所述蛋白質溶液的濃度> 0,并且< 50mg/ml,優(yōu)選為2 50mg/ml,進一步優(yōu)選為20mg/ml。步驟2)中蛋白質結晶試劑與蛋白質溶液的體積之比為0. 1_10 I,優(yōu)選為0.5-2 1，進一步優(yōu)選為I : I。步驟3)中所述的恒溫優(yōu)選自0-60°C溫度范圍中的任何一種溫度；所述靜置時間優(yōu)選為24 240小時。步驟I)中所述溶解蛋白的緩沖溶液選擇醋酸-醋酸鈉緩沖液、HEPES-Na緩沖液、磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液；步驟2)中分裝于結晶裝置凹槽內的各蛋白質結晶溶液的體積為0. 05 4 u L,優(yōu)選為2 u L。所述溶解蛋白質的緩沖液的pH為3. 0-10. 5。所述的蛋白質包括溶菌酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶原A II、刀豆球蛋白、蛋白酶K、葡萄糖異構酶、索馬甜蛋白、核糖核酸酶A VII或枯草桿菌蛋白酶AVII。本發(fā)明雖然僅以溶菌酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶原AU、刀豆球蛋白、蛋白酶K、葡萄糖異構酶、索馬甜蛋白、核糖核酸酶A VII和枯草桿菌蛋白酶A VII為對象進行了實驗，但本發(fā)明方法能夠適用于各種蛋白質的結晶。
本發(fā)明的有益效果是I、本發(fā)明的蛋白質結晶裝置結構簡單，待結晶處理的不同濃度的蛋白質結晶溶液放置于同一凹槽內，彼此之間相互連通，不同濃度的結晶溶液發(fā)生交互氣相擴散。2、本發(fā)明的結晶裝置的形狀、大小與市場上現(xiàn)有的所有高通量完全自動化的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相匹配，適于自動加樣和圖像采集、分析。3、利用本發(fā)明的蛋白質結晶裝置的蛋白質結晶方法，在蛋白質結晶過程中，不同濃度的蛋白質結晶溶液之間發(fā)生交互氣相擴散，使得高濃度的蛋白質結晶溶液濃度逐漸降低，避免了沉淀的生成，即對于高濃度易沉淀的結晶條件在經(jīng)過一定時間后易形成晶體；低濃度的蛋白質結晶溶液經(jīng)過交互氣相擴散后濃度逐漸升高，提高了獲得晶體的機會，易形成晶體。蛋白質結晶溶液的濃度同時向正反兩個方向進行，其共同作用的結果是擴寬了結晶溶液的濃度擴展范圍，比傳統(tǒng)氣相擴散的濃度擴展范圍寬，顯著提高了蛋白質結晶條件篩選的成功率。4、本發(fā)明的蛋白質結晶方法的結晶條件篩選成功率現(xiàn)在高于傳統(tǒng)氣相擴散法，置于同一蛋白質結晶裝置中的不同濃度的蛋白質結晶溶液相互發(fā)生氣相擴散，結晶溶液之間存在的濃度差異使得彼此之間交互氣相擴散，擴大了結晶溶液的濃度擴展區(qū)間，顯著提高了蛋白質結晶篩選的成功率，與常規(guī)的懸滴法進行蛋白質結晶條件篩選相比，采用本發(fā)明方法進行溶菌酶結晶條件篩選，成功率提高了 2. 03倍；過氧化氫酶結晶條件篩選成功率提高了 2. 74倍；糜蛋白酶原A II結晶條件篩選成功率提高了 3. 13倍；刀豆球蛋白結晶條件篩選成功率提高了 12. I倍；蛋白酶K結晶條件篩選成功率提高了 I. I倍；索馬甜蛋白結晶條件篩選成功率提高了 2. 68倍；核糖核酸酶A VII結晶條件篩選成功率提高了 6. 3倍；而枯草桿菌蛋白酶A VII采用常規(guī)的蛋白質結晶方法不能獲得結晶。5、本發(fā)明方法中不需要使用大量的池液即含有沉淀劑的儲槽溶液，減少了對蛋白質結晶篩選試劑盒的消耗，大幅度降低了實驗的成本?？朔F(xiàn)有的用于生物大分子結晶板 價格昂貴、不便于重復利用以及結晶條件篩選成功率低的不足。6、本發(fā)明方法操作簡單，結晶效率高，耗能低，環(huán)保，操作工藝條件容易控制，可重復性高，蛋白質結晶晶體質量可控性強，結晶成本低。7、本發(fā)明的蛋白質結晶裝置結構簡單，制作成本低，大大降低了蛋白質結晶的成本。


圖I為常規(guī)的坐滴法結晶板放大示意圖；圖2為常規(guī)的懸滴法結晶板放大示意圖；圖3為本發(fā)明實施例1-5蛋白質結晶裝置立體結構示意圖；圖4為本發(fā)明的蛋白質結晶裝置的俯視圖；圖5為圖3中沿A-A線的剖面圖；圖6為本發(fā)明實施例6-9蛋白質結晶裝置結構剖視示意圖；圖7為本發(fā)明蛋白質結晶裝置兩個相對的側面上分別設有用于放置待結晶的蛋白質溶液的凹槽的剖視示意圖。圖中1-結晶本體；2_密封部件；3_凹槽；4_儲液槽；5_蛋白質結晶溶液。
具體實施例方式下面參照附圖，詳細描述實施本發(fā)明的蛋白質結晶裝置和利用該裝置進行蛋白質結晶條件篩選的方法的具體實施例。如圖3所示，本發(fā)明的提高蛋白質結晶條件篩選成功率的裝置由結晶本體I和密封部件2組成，其中在結晶本體I上設有凹槽3，用于放置蛋白質結晶溶液5，密封部件2覆蓋在結晶本體I上，密封所述的凹槽3，形成密封的蛋白質結晶空間。與圖2所示的傳統(tǒng)懸滴法相比，傳統(tǒng)懸滴法中有池液，池液的用量一般是很大的，本發(fā)明所述的蛋白質結晶裝置沒有池液。傳統(tǒng)的懸滴法只是與其對應的池液發(fā)生氣相擴散，而此蛋白質結晶裝置中由于所有結晶液滴之間是相通的，在結晶篩選過程中，由于結晶條件濃度差的存在使得所有結晶液滴之間可發(fā)生交互氣相擴散，即高濃度的結晶液滴濃度會降低，低濃度的結晶液滴濃度會升高。密封部件2選擇透明膠帶、結晶封板膜、結晶專用密封膠帶或透明的密封膜中的一種。本發(fā)明實施例中密封部件2選用透明膠帶覆蓋在結晶本體I上，封閉凹槽3。如圖7所示，本發(fā)明提高蛋白質結晶條件篩選成功率的裝置，在其結晶本體I的兩個相對的側面上分別設有用于放置待結晶的蛋白質溶液的凹槽3。參照圖3、4、5，蛋白質結晶裝置的結晶本體I采用有機玻璃、鋼化玻璃、塑料、石英玻璃、高硅氧玻璃、普通平板玻璃、鉛硅酸鹽玻璃、鋁硅酸鹽玻璃、硼硅酸鹽玻璃或鈉鈣玻璃中的一種制成，整體呈長方體形，其內部的凹槽3呈長方體形，凹槽3的底部平坦，待結晶處理的蛋白質結晶溶液均勻分布在凹槽3的底部，蛋白質結晶溶液5之間彼此分離，不相互接觸。
結晶本體I上的凹槽3的形狀、尺寸大小與市場上現(xiàn)有的所有高通量完全自動化的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相一致。使其能夠與現(xiàn)有的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相配合使用。參照圖6，蛋白質結晶裝置的凹槽3的底部設有若干相互分離的儲液槽4，用于放置蛋白質結晶溶液，并且使得放置于儲液槽4內的蛋白質結晶溶液相互分離，不會相互混合或聚集。本發(fā)明中結晶本體I上的凹槽3底部的儲液槽4之間的距離與市場上現(xiàn)有的所有高通量完全自動化的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相一致。使其能夠與現(xiàn)有的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)和自動化的圖像采集系統(tǒng)相配合使用。凹槽底部的儲液槽的個數(shù)為24、48、96、192、288或384。本發(fā)明實施例中的凹槽3設置在結晶本體I的一個側面上，凹槽3還可以設置在結晶本體I的兩個相對的側面上。本發(fā)明實施例1-5中的結晶本體I采用有機玻璃制備而成，整體呈長方體型，其大小與96孔坐滴蛋白質結晶板(Hampton research公司)相同,其他形狀、大小均適用于本發(fā)明；本發(fā)明實施例6-9中的的結晶本體I采用鋼化玻璃制備而成，整體呈長方體型，其大小與96孔坐滴蛋白結晶板相同，其他形狀、大小均適用于本發(fā)明，結晶本體I的凹槽3的底部均勻設有彼此相互分離的儲液槽4，儲液槽4的個數(shù)、儲液槽4之間的間隔、相互位置與96孔坐滴蛋白結晶板中的結晶坐滴孔相對應，便于高通量完全自動化的蛋白質結晶條件篩選加樣系統(tǒng)加樣。本發(fā)明采用Index 96結晶條件篩選試劑盒(Hampton公司，貨號為HR2-134)及可發(fā)生交互氣相擴散的結晶裝置對溶菌酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶原A II、刀豆球蛋白、蛋白酶K、葡萄糖異構酶、索馬甜蛋白、核糖核酸酶A VII和枯草桿菌蛋白酶AVII的結晶條件進行了篩選。除了 Hampton公司貨號為HR2-134的IndexTM96篩選試劑盒之外，其他蛋白質結晶條件篩選試劑盒均適用于本發(fā)明。除了溶菌酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶原A II、刀豆球蛋白、蛋白酶K、葡萄糖異構酶、索馬甜蛋白、核糖核酸酶A VII、枯草桿菌蛋白酶A VII之外，其他蛋白質均適用于本發(fā)明。本發(fā)明中不同濃度蛋白質結晶溶液的制備是通過蛋白質結晶機器人來實現(xiàn)的，在此結晶過程中，蛋白質溶液是相同的，但結晶劑是各不相同的，結晶篩選試劑盒為多孔狀的，一般其中會有24個、48個、96個、或192個、288個或384個不同條件的結晶劑，這些結晶劑的濃度以及所用的試劑是各不相同的，當其與蛋白質溶液混合后可制得24個、48個、96個、或192個、288個或384個不同結晶條件的蛋白質結晶溶液。結晶劑和蛋白質溶液混合的過程是通過蛋白質結晶機器人實現(xiàn)的，分別有分配蛋白質溶液的針和分配結晶劑的針，如我們用的蛋白質結晶機器人有8跟分配蛋白質的針和96跟分配結晶劑的針，96跟分配結晶劑的針可同時分配96個結晶條件。凹槽內可以設計儲液槽，也可以不設計儲液槽，當不設計儲液槽時，結晶劑和蛋白質溶液可直接分配在凹槽上進行混合，制得的結晶液滴是相互分離的。
實施例I溶菌酶結晶條件的篩選I、制備溶菌酶溶液將溶菌酶(HEWL，日本Seikagaku公司；貨號為100940，六次重結晶)溶于pH為
4.6，IOOmM的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，然后用0. 22 ii m的濾膜過濾，去除雜質，制得初始濃度為20mg/ml的溶菌酶溶液。2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人(Screenmaker 96+8TM)將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(I u L)轉移到結晶裝置的凹槽3的底部，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將溶菌酶溶液(20mg/ml，liiL)轉移到結晶裝置的凹槽3中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 y L的溶菌酶結晶溶液。96結晶條件篩選試劑盒有96個孔，其中裝有96種完全不同的蛋白質結晶試劑，各個結晶試劑的濃度是各不相同的。蛋白質結晶機器人有專門分配蛋白質溶液的針和96根分配蛋白質結晶試劑的針，其分配溶液完全是均勻。96根分配蛋白質結晶試劑的針可同時分配96個結晶劑液滴，分配蛋白溶液只需要I個針，吸取足夠的溶液量，可在28s內以s型均勻分配96個液滴與結晶劑混合。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行溶菌酶結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對溶菌酶結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量。統(tǒng)計結果如表I所示。結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于20°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對溶菌酶結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時溶菌酶晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的平均衍射分辨率為1.2A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例2 :過氧化氫酶結晶條件的篩選I、制備過氧化氫酶溶液將過氧化氫酶(美國Sigma公司，貨號為C40)溶于pH為7. 00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 iim的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為5mg/ml的過氧化氫酶溶液。2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3的底部，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將過氧化氫酶溶液(Smg/miayL)轉移到結晶裝置的凹槽3中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 y L的過氧化氫酶結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行過氧化氫酶結晶處理，結晶溫度為0°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對過氧化氫酶結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所
/Jn o結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于0°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、 10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對過氧化氫酶結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時過氧化氫酶晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的過氧化氫酶晶體的平均衍射分辨率為1.9A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例3 :糜蛋白酶原A II結晶條件篩選I、制備糜蛋白酶原A II溶液將糜蛋白酶原A 11(美國Sigma公司，貨號為C4879)溶于pH為7.00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 y m的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為10mg/ml的糜蛋白酶原A II溶液。2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3的底部，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將糜蛋白酶原A II溶液(10mg/ml，liiL)轉移到結晶裝置的凹槽3中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 ii L的糜蛋白酶原A II結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行糜蛋白酶原A II結晶處理，結晶溫度為60°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對糜蛋白酶原A II結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于60°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對糜蛋白酶原A II結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時糜蛋白酶原A II晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的糜蛋白酶原A II晶體的平均衍射分辨率為2.2A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例4刀豆球蛋白結晶條件篩選I、制備刀豆球蛋白溶液將刀豆球蛋白(美國Sigma公司，貨號為L7647)溶于pH為7. 00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 iim的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為10mg/ml的刀豆球蛋白溶液。
2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3的底部，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將刀豆球蛋白溶液(lOmg/miayL)轉移到結晶裝置的凹槽3中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 ii L的刀豆球蛋白結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行溶菌酶結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對刀豆球蛋白結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。 結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于20°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對刀豆球蛋白結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時刀豆球蛋白晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的刀豆球蛋白晶體的平均衍射分辨率為2.2A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例5 :蛋白酶K結晶條件篩選I、制備蛋白酶K溶液將蛋白酶K(美國Sigma公司，貨號為P6556)溶于pH為7. 00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 iim的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為50mg/ml的蛋白酶K溶液。2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3的底部，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將蛋白酶K溶液(50mg/ml，liiL)轉移到結晶裝置的凹槽3中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 y L的蛋白酶K結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行蛋白酶K結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對蛋白酶K結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于20°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對蛋白酶K結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時蛋白酶K晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的蛋白酶K晶體的平均衍射分辨率為1.2A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例6葡萄糖異構酶結晶條件篩選I、制備葡萄糖異構酶溶液將葡萄糖異構酶(美國Sigma公司，貨號為15500)溶于溶于pH為7. 00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 y m的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為10mg/ml的葡萄糖異構酶溶液。
2制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3底部的儲液槽4中，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將葡萄糖異構酶溶液(lOmg/miayL)轉移到結晶裝置的凹槽3的儲液槽4中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 y L的葡萄糖異構酶結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行葡萄糖異構酶結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對葡萄糖異構酶 結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于20°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對葡萄糖異構酶結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時葡萄糖異構酶晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的葡萄糖異構酶晶體的平均衍射分辨率為2.3A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例7索馬甜蛋白結晶條件篩選I、制備索馬甜蛋白溶液將索馬甜蛋白(美國Sigma公司，貨號為17638)溶于pH為7.00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 iim的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為20mg/ml的索馬甜蛋白溶液。2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3底部的儲液槽4中，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將索馬甜蛋白溶液(20mg/ml, I y L)轉移到結晶裝置的凹槽3的儲液槽4中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 y L的索馬甜蛋白結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行溶菌酶結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對索馬甜蛋白結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于20°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對索馬甜蛋白結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時索馬甜蛋白晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的索馬甜蛋白晶體的平均衍射分辨率為1.3A。統(tǒng)計結果如表2所示。實施例8核糖核酸酶A VII結晶條件篩選I、制備核糖核酸酶A VII溶液
將核糖核酸酶A VII(美國Sigma公司，貨號為R5500)溶于pH為7.00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 y m的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為20mg/ml的核糖核酸酶A VII溶液。
2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3底部的儲液槽4中，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將核糖核酸酶A VII溶液(20mg/ml，liiL)轉移到結晶裝置的凹槽3的儲液槽4中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 u L的核糖核酸酶AVII結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行核糖核酸酶A VII結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對核糖核酸酶A VII結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。結晶裝置中未結晶溶液繼續(xù)于20°C下恒溫靜置，進行結晶處理，分別于6天、8天、10天后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對核糖核酸酶A VII結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，回收第6天時核糖核酸酶A VII晶體，用X射線單晶衍射法測定獲得的核糖核酸酶A VII晶體的平均衍射分辨率為2.2A。統(tǒng)計結果如表2所
/Jn o實施例9枯草桿菌蛋白酶A VII結晶條件篩選I、制備枯草桿菌蛋白酶A VII溶液將枯草桿菌蛋白酶A VII (美國Sigma公司，貨號為P5380)溶于pH為7. 00，25mM的HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 y m的濾膜過濾雜質，制得初始濃度為20mg/ml的枯草桿菌蛋白酶A VII溶液。2、制備結晶溶液用蛋白質結晶機器人將Hampton公司貨號為HR2-134的Index 96結晶條件篩選試劑盒中的蛋白質結晶試劑(IuL)轉移到結晶裝置的凹槽3底部的儲液槽4中，結晶試劑均勻分布在凹槽3的底部，結晶試劑之間相互分離，彼此不接觸，但共同處于同一個結晶本體的凹槽內，然后用蛋白質結晶機器人將枯草桿菌蛋白酶A VII溶液(20mg/ml，liiL)轉移到結晶裝置的凹槽3的儲液槽4中與蛋白質結晶劑混合，制得體積分別為2 y L的枯草桿菌蛋白酶A VII結晶溶液。3、孵育、結晶由透明膠帶制成的密封部件2將結晶本體I密封，使凹槽3與密封部件2組成的空間成為密閉的蛋白質結晶空間，將密封后的結晶裝置放置于控溫箱內恒溫靜置，進行枯草桿菌蛋白酶A VII結晶處理，結晶溫度為20°C，48小時后使用自動化圖像采集系統(tǒng)對枯草桿菌蛋白酶A VII結晶溶液進行拍照，然后統(tǒng)計出獲得晶體的結晶條件以及獲得晶體的數(shù)量，統(tǒng)計結果如表I所示。
表I蛋白質結晶條件篩選成功率、獲得晶體的數(shù)量統(tǒng)計表
權利要求
1.一種蛋白質結晶裝置，包括結晶本體和密封部件，其特征在于在結晶本體上設有凹槽，用于放置待結晶的蛋白質溶液，密封部件覆蓋在結晶本體上，密封所述的凹槽，形成密封的蛋白質結晶空間。
2.根據(jù)權利要求I所述的蛋白質結晶裝置，其特征在于所述的凹槽分別設置在結晶本體的兩個相對的側面上。
3.根據(jù)權利要求I所述的蛋白質結晶裝置，其特征在于所述的密封部件選擇透明膠帶、結晶封板膜、結晶專用密封膠帶或透明的密封膜中的一種。
4.根據(jù)權利要求I所述的蛋白質結晶裝置，其特征在于所述的結晶本體選擇透明材質的材料制成，包括有機玻璃、鋼化玻璃、塑料、石英玻璃、高硅氧玻璃、普通平板玻璃、鉛硅酸鹽玻璃、鋁硅酸鹽玻璃、硼硅酸鹽玻璃或鈉鈣玻璃。
5.根據(jù)權利要求I所述的蛋白質結晶裝置，其特征在于所述的凹槽的底部還設有若干相互分離的儲液槽，用于放置蛋白質結晶溶液，并且使得放置于儲液槽內的蛋白質結晶溶液相互分離，不會相互混合或聚集。
6.一種利用權利要求I所述裝置進行蛋白質結晶的方法，其特征在于包括下述步驟 1)將蛋白質加入到緩沖溶液中，溶解，然后通過過濾去除雜質，制成蛋白質溶液； 2)將蛋白質結晶篩選試劑盒中的結晶劑轉移到蛋白質結晶裝置的同一個凹槽內，結晶劑之間相互分離，彼此不接觸，然后將蛋白質溶液轉移到蛋白質結晶裝置的凹槽內與蛋白質結晶劑混合制得不同結晶條件的蛋白質結晶溶液； 3)用密封部件密封蛋白質結晶裝置的凹槽，于恒溫條件下靜置，結晶。
7.根據(jù)權利要求6所述的蛋白質結晶的方法，其特征在于所述的步驟I)中蛋白質包括溶菌酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶原A II、刀豆球蛋白、蛋白酶K、葡萄糖異構酶、索馬甜蛋白、核糖核酸酶A VII或枯草桿菌蛋白酶A VII ;緩沖溶液選擇醋酸-醋酸鈉緩沖液、HEPES-Na緩沖液、磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液；蛋白質溶液的濃度> O，并且彡50mg/m
8.根據(jù)權利要求6所述的蛋白質結晶的方法，其特征在于所述的步驟2)中蛋白質結晶試劑與蛋白質溶液的體積之比為0.1-10 I ;分裝于結晶裝置凹槽內的各蛋白質結晶溶液的體積為0. 05 4 ii L。
9.根據(jù)權利要求6所述的蛋白質結晶的方法，其特征在于所述的步驟3)中恒溫選自0-60°C溫度范圍中的任何一種溫度；靜置時間為24 240小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質結晶裝置和利用該裝置進行蛋白質結晶的方法，裝置包括結晶本體和密封部件，結晶本體上設有凹槽，放置待結晶蛋白質溶液，密封部件密封所述的凹槽，形成密封的蛋白質結晶空間。將蛋白質加入到緩沖溶液中，溶解制成蛋白質溶液后與不同的蛋白質結晶試劑混合，制得蛋白質結晶溶液，然后將蛋白質結晶溶液同時置于同一結晶裝置的凹槽內，不同蛋白質結晶溶液彼此分離，相互不接觸，在同一密閉容器內相互連通，不同濃度的結晶溶液發(fā)生交互氣相擴散，拓寬了蛋白質結晶溶液的濃度擴展范圍，顯著提高了蛋白質結晶條件篩選的成功率，同時減少了對蛋白質結晶篩選試劑盒的消耗，大幅度降低了蛋白質結晶的成本。
文檔編號C12N9/22GK102659916SQ20121013316
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權日2012年5月3日
發(fā)明者何進, 劉永明, 商澎, 尹大川, 陳瑞卿, 馬曉亮, 鹿芹芹 申請人:西北工業(yè)大學