專利名稱：諾如病毒p粒子基因pgene及表達(dá)諾如病毒p粒子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因工程領(lǐng)域人工合成的病毒基因以及在大腸桿菌中表達(dá)活性蛋白的方法，具體是根據(jù)諾如病毒VA387的P粒子的氨基酸序列合成PGENE基因以及在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法。
背景技術(shù)：
Norovirus (NVs)病毒原名為諾瓦克樣病毒，NVs是導(dǎo)致人類非細(xì)菌性急性胃、腸炎的主要病原，該病毒可以感染各年齡段人群，特別是嬰幼兒、老年人和免疫系統(tǒng)缺陷病人屬于易感人群。該病毒全年均可發(fā)生，冬季屬于高發(fā)期(Mounts A ff, et al傳染病學(xué)2000,181(2) :284-287) ；NVs的感染率非常高，感染カ僅次于輪狀病毒(Boga J A，et al微生物 診斷2004，42 (6) :2668-2674)。由于NVs屬于正義單鏈RNA病毒(Green K Y，et al傳染病學(xué)，2000，181 (2) S322-330), NVs基因組易變異，導(dǎo)致其抗原性改變，病毒株得以進(jìn)化，進(jìn)而感染易感宿主，給疫情控制上帯來相當(dāng)大的難度，并且可能出現(xiàn)交叉感染的現(xiàn)象，目前，對(duì)NVs疫苗的研究?jī)H局限于病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs),通過生產(chǎn)NVs的衣殼蛋白作為其亞基疫苗是NVs疫苗研究的ー個(gè)熱點(diǎn)。P粒子是NVs衣殼蛋白単體形成12聚體小蛋白分子，VLPs和P粒子均具有免疫原性，ロ服后，均可引起宿主免疫反應(yīng)，而通過對(duì)NVs 的 VLPs 和 P 粒子與人組織血型抗原(human Histo-Blood Group Antigen, HBGA)親合力研究發(fā)現(xiàn)，P粒子的免疫原性要強(qiáng)于VLPs，而且P粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是研制NVs疫苗更佳候選者。不同NVs毒株與人HBGA的結(jié)合存在差異，文獻(xiàn)《Hutson A M, et al.傳染病學(xué)，2002，185(9) :1335-1337》對(duì) 8 種 NVs 毒株(I 型的 NV、C59 和 VA115 ；11 型的 VA207、VA387、GrV、MxV和Μ0Η)研究發(fā)現(xiàn)，MOH不能識(shí)別O血型的HBGA，NV不能識(shí)別B血型的HBGA，而VA387可以識(shí)別腺體和ABO血型的所有HBGA。由于VA387識(shí)別HBGA的廣泛性，因此，合成VA387病毒株的衣殼蛋白的PGENE基因，并構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體pET32，從而生產(chǎn)VA387的P粒子作為NVs亞基疫苗，這對(duì)今后研制NVs ロ服亞基疫苗提供了一定的參考和借鑒價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供諾如病毒P粒子的基因PGENE，并通過構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體PET32，在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒株VA387的P粒子這ー活性蛋白分子的方法。本發(fā)明提供的P粒子的免疫原性要強(qiáng)于VLPs，而且P粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，該P(yáng)粒子作為NVs ロ服亞基疫苗，在廣泛預(yù)防Norovirus病毒感染上具有重要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種諾如病毒P粒子的PGENE基因，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。ー種質(zhì)粒載體,該載體包括SEQ ID NO. I所示的堿基序列?！N在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，該方法包括以下步驟步驟一、含目的基因(PGENE基因)表達(dá)載體的構(gòu)建(I)通過生物合成的方法，合成PGENE的核苷酸序列，并將其克隆入pUC57質(zhì)粒中，命名為 pUC57-PGENE ；(2)用Hind III和BamH I對(duì)克隆的pUC57_PGENE質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，獲得1029bp的小片段，同時(shí)用BamHI和HindIII對(duì)pET32a質(zhì)粒進(jìn)行酶切；(3)利用膠回收試劑盒分別回收所述PUC57-PGENE酶切產(chǎn)物的小片段DNA分子和所述質(zhì)粒pET32a酶切產(chǎn)物的大片段DNA分子，用T4連接酶連接所述小片段DNA分子和所述大片段DNA分子，獲得重組質(zhì)粒pET32-PGENE ； (4)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，并在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述大腸桿菌DH5 α ,然后4°C條件下8000rmp離心5min,取菌體在加有氨節(jié)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上圖板，篩選單菌落，挑取抗性單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和測(cè)序檢測(cè)；(5)將所述單菌落搖菌培養(yǎng)擴(kuò)增，并抽提其質(zhì)粒PET32-PGENE，并將該質(zhì)粒用凍融法導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，獲得包含目的基因表達(dá)載體的大腸桿菌BL21工程菌；步驟ニ、工程菌的培養(yǎng)及P粒子的誘導(dǎo)(I)取所述工程菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，再接著繼代培養(yǎng)；(2)取所述繼代培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行OD值測(cè)定，當(dāng)OD值達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，所述工程菌即可表達(dá)產(chǎn)生諾如病毒P粒子。優(yōu)選的，所述T4連接酶連接的具體條件為16°C下連接過夜。優(yōu)選的，在所述LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述大腸桿菌DH5 α的時(shí)間為3_5小時(shí)。優(yōu)選的，IPTG誘導(dǎo)的條件為1Μ的IPTG在37°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4. 5小時(shí)。優(yōu)選的，該方法還包括pET32-PGENE活性蛋白的提取，所述提取包括以下步驟取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，4°C條件下8000rmp離心，收集菌落；向所述收集的菌落中加入PBS，超聲波破碎細(xì)胞；利用NI柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，收集目的蛋白。進(jìn)ー步優(yōu)選的，所述超聲波破碎的條件為功率200W，超聲10s，間隔10s，6個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，所述LB液體培養(yǎng)基的組分以及各組分的重量體積百分比為胰化蛋白胨I %，酵母提取物O. 5 %，NaCl I %，羧芐抗生素30 μ g/mL ;所述LB液體培養(yǎng)基的pH值為
7.0，所述LB液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌25min。優(yōu)選的，所述LB固體培養(yǎng)基的組分以及各組分的重量體積百分比為胰化蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，羧芐抗生素30μ g/mL，瓊脂I. 5% ;所述LB固體培養(yǎng)基的PH值為7. 0，所述LB固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌25min。本發(fā)明提供了諾如病毒P粒子的PGENE基因以及在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法。本發(fā)明提供的P粒子的免疫原性要強(qiáng)于VLPs，而且P粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，該P(yáng)粒子作為NVs ロ服亞基疫苗，在廣泛預(yù)防Norovirus病毒感染上具有重要應(yīng)用價(jià)值。


圖I是構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)的酶切產(chǎn)物電泳圖；圖2是膠回收目的片段的電泳檢測(cè)圖；圖3是重組質(zhì)粒載體的鑒定結(jié)果圖；圖4是載體pET32-PGENE克隆載體部分測(cè)序結(jié)果圖；圖5是PCR鑒定表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的結(jié)果圖；圖6是時(shí)間梯度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果圖7是目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果圖；圖8是目的蛋白的分離純化結(jié)果圖；圖9是純化的目的蛋白的western blot檢測(cè)結(jié)果圖；圖10是ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)的比較結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如SambiOOk等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)' (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例lpET32_PGENE基因合成及載體構(gòu)建I、基因合成按諾如病毒P粒子的基因序列設(shè)計(jì)合成PGENE基因，全長(zhǎng)為1002bp (包括保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)組成的接頭)，并加入六個(gè)組氨酸序列構(gòu)成6Xhis-tag融合蛋白，具體序列如SEQID NO. I所示，其總長(zhǎng)度為1029bp，合成之后連入pUC57載體，即pUC57_PGENE ；2、酶切用Hind III和BamH I對(duì)克隆的pUC57_PGENE質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，獲得兩個(gè)片段，其中小片段為1029bp，同時(shí)用Hind III和BamH I對(duì)pET32a進(jìn)行酶切，如圖I所示，用BamH I和Hind III對(duì)pUC57_PGENE質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用BamHI和Hind III對(duì)pET32a進(jìn)行酶切各自獲得目的片段，其中泳道M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1，2是經(jīng)BamHI和HindIII酶切過后的pUC57_PGENE，泳道3，4是經(jīng)BamHI和HindIII酶切過后的pET32a的質(zhì)粒;3、連接利用膠回收試劑盒分別回收pUC57質(zhì)粒的小片段和pET32a中的條帶，如圖2所示，分別對(duì)目的基因小片段和質(zhì)粒pET32a大片段進(jìn)行回收后電泳檢測(cè)，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為pET32a酶切后回收的片段，泳道2為回收的PGENE基因目的片段，利用T4連接酶在16°C條件下過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pET32-PGENE ；4、轉(zhuǎn)化將連接所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)后在I. 5ml epp管37°C搖菌3-5小吋，離心后去掉上清液，取底下200mL菌體進(jìn)行LB固體培養(yǎng)基圖板，37°C過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單斑于I. 5ml的epp管中,加入液體LB培養(yǎng)基搖勻后進(jìn)行PCR檢測(cè)。實(shí)施例2陽性克隆載體的檢測(cè)和確定I、PCR 檢測(cè)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)體系 25 μ L，包括引物 PEH-F (5 ' -GGGAATTCATGCATCATCATCATCATCA-3’)和 PEH-R(5’-GGTAACCAAGCTTTCTAGATTAACAAAA-3’)各 I μ L(10 μ mol/L)，0· 3 μ LTaq DNA 聚合酶(5units/ μ L)，2· 5 μ L 的 10XPCR 緩沖液(含有 MgCl2)，2 μ L 模板(待檢菌液)，I. 5 μ L的dNTPs (2. 5mmol/L), 16. 7 μ L去離子無菌水,上層覆蓋20 μ L滅菌石臘油；PCR 條件94で 8min ；94°C 70s,58°C 40s, 72°C 80s，34 次循環(huán)；72。延伸 8min ;電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1029bp ；PC R產(chǎn)物檢測(cè)用帶有 EB(ethidium bromide)的 1.0% (w/v)瓊脂糖膠在 IXTAE電泳緩沖液中電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)紫光下檢測(cè)并拍照；如圖3所示，原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后利用PCR進(jìn)行鑒定，其中M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子參照，+ pUC57-PGENE轉(zhuǎn)化DH5a作陽性對(duì)照，1-8 :轉(zhuǎn)化DH5a后的抗性轉(zhuǎn)化子，CK :DH5 α空菌液做陰性對(duì)照，H20 :空的PCR體系(模板為水)；2、測(cè)序確定陽性克隆載體選擇PCR檢測(cè)為陽性的單菌落進(jìn)行雙向測(cè)序，其測(cè)序引物為PEH-FGi -GGGAATTCATGCATCATCATCATCATCA-3’ )和 PEH-R(5，-GGTAACCAAGCTTTCTAGATTAA CAAAA-3’)，測(cè)序結(jié)果與合成的目的基因序列進(jìn)行，對(duì)比結(jié)果完全符合的單菌落確定為陽性克隆載體，如圖4所示。實(shí)施例3P粒子誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白檢測(cè)I、載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21將測(cè)序正確的菌株搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，并在含羧芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)至單斑長(zhǎng)出后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢查，如圖5所示，其中M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量，1、2 pUC57-PGENE作陽性對(duì)照，3 10 BL21抗性轉(zhuǎn)化子，11、12 菌液BL21作陰性對(duì)照，H20 :空的PCR體系(模板為水);2、P粒子時(shí)間梯度誘導(dǎo)及western blot檢測(cè)(I)、將上述檢測(cè)正確的原核克隆載體pET32-PGENE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中表達(dá)，當(dāng)大腸桿菌BL21搖菌致OD值為O. 6-0. 8時(shí)，加入IM的IPTG在37°C條件下進(jìn)行時(shí)間梯度(Oh, I. 5h, 3. Oh, 4. 5h 和 6. Oh)誘導(dǎo)；(2)、將梯度誘導(dǎo)的菌液按照各自的梯度時(shí)間間隔，分別吸取Iml菌液，4°C條件下8000rmp離心，去掉液體培養(yǎng)基，收集菌落；(3)、SDS-PAGE 分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，I989)；上述菌落中加入I X PBS (KH2PO4 0. 2g/L, Na2HPO4L 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)和等體積的含SDS的2X上樣緩沖液(甘油2. 4g，pH6. 8的IM Tris-HCl lmL，溴酚蘭0.01%, H2O定容至20mL)，沸水浴7_10min后置于冰上，冷卻后上樣；4°C冰箱中在100V電壓下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部；聚丙烯酰胺凝膠，其中ー塊用于考馬斯亮蘭(w : V = 2. 5% )染色，時(shí)間梯度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，其中泳道M :蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道I 5 :含PET32-PGENE質(zhì)粒的菌體分別在誘導(dǎo)Oh、I. 5h、3. Oh、4. 5h和6. Oh的樣品，泳道6 :未轉(zhuǎn)化的BL21作陰性對(duì)照；另一塊用于Western blot分析；(4)、蛋白質(zhì)向PVDF膜上轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移之前，切取與膠相同大小的PVDF和六張相同大小濾紙先在甲醇中平衡15分鐘后，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base，0. 037 % SDS，20 %甲醇)平衡凝膠和PVDF膜30分鐘；凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙，PVDF的位置在膠的上側(cè)，靠正極的ー側(cè)，用35V電壓在4°C轉(zhuǎn)膜過夜；(5)、PVDF膜蛋白檢測(cè)將PVDF 膜用 TBS 溶液(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 8. O)和TBST (20mMTris-HCl, 150mM NaCl,0. 05% (v/v) Tween20,pH = 8. 0)溶液洗膜后浸在封閉液中，室溫緩慢搖動(dòng)、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于IOOmL的I X TBS (含O. 5g疊氮鈉));再將濾膜浸泡在TBS和TBST洗滌緩 沖液中，37°C洗滌兩次，每次15分鐘；加入第一抗體(鼠抗his-tag的抗體，由于外源基因前面插入了 6Xhis_tag標(biāo)簽構(gòu)成融合蛋白，因而利用his-tag抗體進(jìn)行檢測(cè))，室溫溫育90分鐘；洗滌三次，洗滌方法同上所述；加入第二抗體(羊抗鼠)，室溫溫育90分鐘；洗滌兩次，洗滌方法同上所述；加入底物顯色觀察蛋白條帶，目標(biāo)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，其中泳道M :蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道I 5 :含PET32-PGENE質(zhì)粒的菌體分別在誘導(dǎo)后Oh, I. 5h，3. Oh,4. 5和6. Oh的樣品檢測(cè)，泳道6 :未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21菌液。 實(shí)施例4目的蛋白的純化及檢測(cè)I、利用大容量培養(yǎng)瓶(500ml)對(duì)陽性表達(dá)載體菌液進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)OD值達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，加入IM的IPTG在37°C條件誘導(dǎo)培養(yǎng)4. 5小時(shí);2、利用50ml管子多次離心收集菌液，4°C條件下8000rmp對(duì)菌液離心，棄掉上清LB培養(yǎng)基，收集底層菌落加入I XPBS溶液2mL重懸細(xì)胞沉淀后，在冰上超聲波破碎，超聲波破碎條件功率200W，超聲10s，間隔10s，6個(gè)循環(huán)；分別對(duì)上清液和沉淀進(jìn)行蛋白可溶性分祈；3、pET32-PGENE載體中在插入基因前面設(shè)計(jì)了 6Xhis_tag標(biāo)簽與其構(gòu)成融合蛋白，通過Ni-NTA樹脂親和層析法純化獲得目的融合蛋白，純化的具體步驟為(I)裝柱懸浮50% Ni-NTA溶液，裝柱，避免產(chǎn)生氣泡，Ni-NTA用量為5_10mg蛋白/mL樹脂，等樹脂自然沉降，用5倍柱體積的dH20過柱清洗層析柱，再加入5 10倍柱體積的IXNi-NTA buffer B(8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，PH值為8. O)平衡層析柱；(2)樣品上柱用10倍柱體積的I XNi-NTA buffer B洗柱，流速為lmL/min，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；(3)用10倍柱體積的IXNi-NTAbuffer C(8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlMTris-Cl，其余為蒸餾水，pH值為6. 3)洗柱，以洗去非結(jié)合的蛋白，收集流出液，用于SDS-PAGE 檢測(cè)；(4)用5倍柱體積的I XNi-NTAbufferE (8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，
O.OlMTris-Cl，其余為蒸餾水，pH值為4. 5)洗柱，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，分別用2mL的EP管收集洗脫液，保存于_20°C或直接對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE膠分離檢測(cè)和western blot檢測(cè)，并測(cè)定濃度，目的蛋白的分離純化結(jié)果如圖8所示，其中泳道M :蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道ck:未轉(zhuǎn)化的BL21菌液，泳道I :非特異結(jié)合的蛋白子，泳道2 :流出液，泳道3 7 :分離純化出來的目的蛋白；純化的目的蛋白的western blot檢測(cè)結(jié)果如圖9所示,其中泳道M :蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道I 5 :含pET32-PGENE質(zhì)粒的菌體分別在誘導(dǎo)后0h，I. 5h，3. Oh, 4. 5和6. Oh的樣品檢測(cè)，泳道6 :未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21菌液。實(shí)施例5目的蛋白濃度測(cè)定I、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備吸取lmg/mL的綠色熒光蛋白(含有6Xhis標(biāo)簽)標(biāo)準(zhǔn)母液，用IXPBS稀釋成Ing/yL，再倍比稀釋成以下的濃度梯度(ng/yL) 1,0. 5,0. 25,0. 125，
0.0625,0. 03125,0. 015625ng/μ L，并用 IXPBS 作為空白對(duì)照；2、包被(I)標(biāo)準(zhǔn)品的包被在96孔酶標(biāo)板上，每個(gè)復(fù)孔加入陽性蛋白50 μ L，重復(fù)三次，每個(gè)復(fù)孔加包被液150 μ L ;(2)目的蛋白將純化出來的蛋白作稀釋后，在酶標(biāo)板的每個(gè)復(fù)孔中加入50yL， 每個(gè)樣品重復(fù)三次，每個(gè)復(fù)孔加包被液150 μ L ;(3)用保鮮膜將板包好，置于37°C溫箱中過夜；3、洗板包被結(jié)束后，傾倒出各孔內(nèi)的液體，用37°C預(yù)熱的PBST緩沖液(1XPBS+0. 05%Tween-20) 150 μ L洗漆3次,姆次5min,最后一次拍干孔內(nèi)的液體；4、封閉每個(gè)復(fù)孔加封閉液(PBST緩沖液+5%脫脂奶粉)100 μ L，37°C溫浴l_2h ；5、洗滌用PBST緩沖液150 μ L洗板3次，每次3min，最后一次拍干孔內(nèi)液體；6、與一抗反應(yīng)每個(gè)復(fù)孔分別加入10(^し的第ー抗體(鼠抗6父把8ィ38抗體，1 10000稀釋)，37°C溫浴 I. 5-2h ；7、洗滌用PBST緩沖液150 μ L洗板3次，每次3min，最后一次拍干孔內(nèi)液體；8、與ニ抗反應(yīng)每個(gè)復(fù)孔加入100 μ L第二抗體(AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，I 5000稀釋)，37°C溫浴
1.5-2h ；9、洗滌用PBST緩沖液200 μ L洗板3次，每次3min，最后一次拍干孔內(nèi)液體；10、顯色每個(gè)復(fù)孔加入顯色劑BCIP/NBT (TAKARA公司)100μ L，37°C溫浴IOmin ；11、測(cè)定 OD41。值用酶標(biāo)儀(ΒΙ0-ΤΕΚ公司)測(cè)定410nm處的吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品中目標(biāo)蛋白的含量。實(shí)施例6目的蛋白的免疫活性檢測(cè)I、將上述獲得的純化的PET32-PGENE表達(dá)的目的蛋白經(jīng)過免疫佐劑偶聯(lián)后用于免疫小鼠，制備抗血清；2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組小鼠12只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組。A組利用His蛋白免疫組；B組用純化的原核蛋白免疫組；C組(對(duì)照組):用IXPBS免疫作為陰性對(duì)照組；
3、免疫方案初次免疫將融合蛋白抗原與等體積的完全福氏佐劑充分混勻腹腔注射(50 μ g/只)，加強(qiáng)免疫采用等量抗原與不完全福氏佐劑等體積混勻，同樣皮內(nèi)多點(diǎn)注射同劑量抗原；4、免疫程序采用0w、2w、4w免疫程序，即初次免疫后2w，進(jìn)行第I次加強(qiáng)免疫，再隔Iw進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫，分別于初次免疫后第5w，通過摘除眼球采血收集于50mL離心管中，4°C過夜，4000rpm離心IO rnin,收集上清,獲得兔免疫血清；5、通過ELISA的方法用合成的短肽作為抗原對(duì)融合蛋白誘導(dǎo)小鼠免疫血清抗體效價(jià)的特異性進(jìn)行檢測(cè)(檢測(cè)前探測(cè)抗原和抗體工作濃度)，其中用His蛋白作為陰性對(duì)照，利用PBS作為空白對(duì)照，結(jié)果如圖10所示，樣品組免疫制備的抗體效價(jià)較His蛋白組和PBS組對(duì)照組的抗體效價(jià)都高。綜上所述，利用原核表達(dá)載體表達(dá)的諾如病毒P粒子亞單位疫苗具有顯著的免疫作用，并具有表達(dá)迅速，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種諾如病毒P粒子的PGENE基因，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。
2.ー種質(zhì)粒載體，其特征在于，該載體包括SEQ ID NO. I所示的堿基序列。
3.—種在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，該方法包括以下步驟 步驟ー、合成PGENE基因，并將其連入pUC57質(zhì)粒中形成質(zhì)粒載體pUC57_PGENE，用HindIII和BamH I對(duì)所述質(zhì)粒載體pUC57_PGENE進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用BamH I和Hind III對(duì)質(zhì)粒pET32a進(jìn)行酶切，利用膠回收試劑盒分別回收所述pUC57-PGENE酶切產(chǎn)物的小片段DNA分子和所述質(zhì)粒pET32a酶切產(chǎn)物的大片段DNA分子，用T4連接酶連接所述小片段DNA分子和所述大片段DNA分子，獲得重組質(zhì)粒pET32-PGENE ； 步驟ニ、將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述大腸桿菌DH5ci，然后取該菌體在加有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上圖板，篩選單菌落； 步驟三、將所述單菌落搖菌培養(yǎng)擴(kuò)增，并抽提其質(zhì)粒PET32-PGENE，并將該質(zhì)粒用凍融法導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，獲得包含目的基因表達(dá)載體的大腸桿菌BL21工程菌； 步驟四、將所述工程菌在LB液體培養(yǎng)基中先37°C過夜培養(yǎng)，再接著繼代培養(yǎng)； 步驟五、取所述繼代培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行OD值測(cè)定，當(dāng)其OD值達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，所述工程菌即可表達(dá)產(chǎn)生諾如病毒P粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述T4連接酶連接的具體條件為16°C下連接過夜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，在所述步驟ニ中，在所述LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述大腸桿菌DH5 α的時(shí)間為3_5小吋。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，在所述步驟五中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的條件為1Μ的IPTG在37°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4. 5小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，該方法還包括PET32-PGENE活性蛋白的提取，所述提取包括以下步驟取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，4°C條件下8000rmp離心，收集菌落；向所述收集的菌落中加入PBS，超聲波破碎細(xì)胞；利用NI柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，收集目的蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，所述超聲波破碎的條件為功率200W，超聲10s，間隔10s，6個(gè)循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基的組分以及各組分的重量體積百分比為胰化蛋白胨1%，酵母提取物O. 5 %，NaCl I %，羧芐抗生素30 μ g/mL ;所述LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，所述LB液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌25min。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)所述的在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，其特征在于，所述LB固體培養(yǎng)基的組分以及各組分的重量體積百分比為胰化蛋白胨1%，酵母提取物O. 5%，NaCl I %，羧芐抗生素30 μ g/mL,瓊脂1.5% ;所述LB固體培養(yǎng)基的pH值為.7. 0，所述LB固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌25min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的諾如病毒P粒子基因PGENE以及在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法，該基因序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并添加六個(gè)組氨酸(6×his)標(biāo)簽，在大腸桿菌中表達(dá)諾如病毒P粒子的方法包括構(gòu)建含pET32-PGENE基因的表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌；pET32-PGENE活性蛋白的提取。本發(fā)明提供的P粒子的免疫原性要強(qiáng)于VLPs，而且P粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，該P(yáng)粒子作為NVs口服亞基疫苗，在廣泛預(yù)防Norovirus病毒感染上具有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/40GK102643836SQ201210118389
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者李善爽, 楊桂華, 王曉磊, 趙凌俠, 趙攀峰, 高美鳳, 高蕾 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)