專利名稱：基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
核酸適配體(aptamer)是一類體外人工篩選出來(lái)的DNA或RNA寡核苷酸序列，可以高效、專一地識(shí)別其配體(A. D. Ellington, J. ff. Szostak, Nature 1990, 346,818-822)，在臨床診斷和疾病治療領(lǐng)域成為越來(lái)越重要的分子工具。核酸適配體是一系列單鏈核酸分子，能夠與特異靶分子相結(jié)合，特異性如同抗體一樣，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。核酸適配體與靶分子相互作用的基礎(chǔ)是空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)，在結(jié)合靶分子前后核酸適配體通常會(huì)有顯著的結(jié)構(gòu)變化這一特性廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、熒光、石英晶體微天平等信號(hào)檢測(cè)手段。近年來(lái)，基于核酸適配體的比色策略發(fā)展迅速，人們可以直 接用肉眼實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的直接檢測(cè)。核酸適配體具有易于合成、化學(xué)穩(wěn)定性高和目標(biāo)分子范圍的特點(diǎn)。分子信標(biāo)(molecular beacon)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來(lái)。分子信標(biāo)因具有靈敏度高、特異結(jié)合性好、靶分子不用標(biāo)記無(wú)需分離等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和生物分析領(lǐng)域。分子信標(biāo)中最常用的淬滅基團(tuán)是DABSYL、TMARA等有機(jī)淬滅劑，這些淬滅劑可以有效淬滅大部分的熒光素，但是對(duì)于不同的熒光素的淬滅效率差異很大，對(duì)于長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射的熒光素例如Cy5，Texas Red等的淬滅效果就很差。納米金具有高的消光系數(shù)和較寬的光譜吸收特性，它比常規(guī)有機(jī)發(fā)光團(tuán)分子的消光系數(shù)高 3 5 個(gè)數(shù)量級(jí)(Jin, R. ; ffu, G. ; Li, Z. ; Mirkin, C. A. ; Schatz, G. C·，J. Am. Chem. Soc. 2003，1643-54)。納米金作為信號(hào)傳導(dǎo)載體在生物技術(shù)和納米技術(shù)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。Fan等發(fā)現(xiàn)納米金可以淬滅聚荷陽(yáng)離子的突光，Stern-Volmer常數(shù)可達(dá)10n/M，比小分子熒光淬滅劑提高了 9-10個(gè)數(shù)量級(jí)。近年來(lái)，納米金作為淬滅基團(tuán)在納米金一熒光素復(fù)合物體系中理論模型、淬滅效率以及實(shí)際應(yīng)用的研究越來(lái)越多。將納米金應(yīng)用到分子信標(biāo)中，與常規(guī)淬滅基團(tuán)DABCYL相比，納米金可以在可見到近紅外的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，有效淬滅各種熒光染料，而且金顆粒在較低的離子強(qiáng)度條件下吸收效果較好，所以用納米金粒子代替DABSYL大大提高了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中分子信標(biāo)在檢測(cè)長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射時(shí)靈敏度和特異性降低等問題，提供一種基于納米金和適配體的小分子探針。本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種基于納米金和適配體的小分子探針的制備方法。
本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種包括基于納米金和適配體的小分子探針的試劑盒。本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種基于納米金和適配體的小分子探針的使用方法。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是基于納米金和適配體的小分子探針，包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，其特征在于，還包括一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補(bǔ)雜交。優(yōu)選的，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6_10個(gè)長(zhǎng)度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補(bǔ)雜交。 優(yōu)選的，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。優(yōu)選的，所述組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段為3種，與其互補(bǔ)雜交的適配體為3種。優(yōu)選的，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)，包括但不限為-R0X，-FAM或-Cy5。優(yōu)選的，所述納米金顆粒與核酸適配體熒光基團(tuán)的距離控制在2-3納米。巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基(-SH)修飾且在該末端有6-10個(gè)長(zhǎng)度的胸腺嘧啶T作為間隔，標(biāo)記有熒光基團(tuán)的核酸適配體與所述巰基修飾DNA片段的間隔部分之外的堿基互補(bǔ)雜交，通過(guò)間隔的堿基數(shù)目控制所述納米金顆粒與核酸適配體熒光基團(tuán)的距離。優(yōu)選的，所述小分子探針，包括至少下列一對(duì)熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補(bǔ)雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段
與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示AA:5’ -AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 PA: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’
與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示AK:5’ --TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的 DNA 片段如 SEQ ID No. 5 所示 PK: 5’ -CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’
與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示AC:5’一AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補(bǔ)的DNA片段如SEQ ID No. 6 所示 PC: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3，；
上述的三種適配體的5’端連接有-R0X，-FAM或-Cy5熒光基因中的一種，且各個(gè)適配體的熒光基因各不相同。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了基于納米金和核酸適配體的小分子探針的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟
(1)準(zhǔn)備與核酸適配體互補(bǔ)的巰基修飾的DNA片段及納米金顆粒，還加入了為核酸適配體I. 5-2. 5倍摩爾濃度的10個(gè)胸腺嘧啶T，通過(guò)金硫鍵將DNA片段組裝到納米金表面得到納米金-DNA片段；
(2)準(zhǔn)備熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體，將等摩爾量的核酸適配體與步驟(I)制備的納米金-DNA片段混合得到所述基于納米金和核酸適配體的小分子探針。優(yōu)選的，在第二個(gè)方面的制備方法，所述步驟(I)為將一定量的巰基修飾的DNA和納米金混合，得到納米金-DNA片段，過(guò)夜后加入一定濃度的PBS，離心去掉未組裝到納米金表面的DNA片段。優(yōu)選的，在第二個(gè)方面的制備方法，步驟(2)加入的胸腺嘧啶T為核酸適配體2倍摩爾濃度的胸腺嘧啶。優(yōu)選的，在第二個(gè)方面的制備方法，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。優(yōu)選的，在第二個(gè)方面的制備方法，在最終的納米金-DNA片段混合溶液中，巰基修飾的DNA : 10個(gè)胸腺嘧啶T :納米金的濃度為1:2: 10000。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包括基于納米金和適配體的小分子探針的試劑 盒，所述試劑盒，包括納米金顆粒，還包括組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補(bǔ)雜交。優(yōu)選的，在第三個(gè)方面的試劑盒，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6-10個(gè)長(zhǎng)度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補(bǔ)雜交。優(yōu)選的，在第三個(gè)方面的試劑盒，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。優(yōu)選的，在第三個(gè)方面的試劑盒，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)，包括但不限為-R0X，-FAM或-Cy5。優(yōu)選的，在第三個(gè)方面的試劑盒，包括至少下列一對(duì)熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補(bǔ)雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段
與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示Aa:5’ -R0X-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 Pa: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’
與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示Ak: 5’-FAM-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的DNA片段如SEQ IDNo. 5 所示 Pk: 5，-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’
與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示Ae:5’ _Cy5_AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補(bǔ)的DNA片段如 SEQ ID No. 6 所示 Pc: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了基于納米金和適配體的小分子探針的使用方法，其特征在于，將所述小分子探針加入待測(cè)溶液，室溫放置1-24小時(shí)然后測(cè)量熒光信號(hào)的變化。優(yōu)選的，在第四個(gè)方面的使用方法，所述待測(cè)溶液還加入了待測(cè)小分子類似物。為了驗(yàn)證該方法的特異性，即該探針能夠特異性檢測(cè)靶分子，而其類似物分子不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入了小分子的類似物，比如腺苷A的類似物，腺苷G，T，C。鉀離子K+的類似物L(fēng)i+，Na+。可卡因的類似物芽子堿甲酯(ΕΜΕ)、苯甲酸(BE)。本專利申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“適配體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，指的是能夠與特定的靶分子結(jié)合的單鏈核酸，包括DNA或RNA。本發(fā)明使用的核酸適配體5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)。本發(fā)明中，三條適配體aptamer鏈用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，與納米金表面組裝的互補(bǔ)DNA雜交，一起構(gòu)成納米金多色探針。未檢測(cè)反應(yīng)前，由于適配體熒光基團(tuán)靠近納米金表面，其熒光被納米金淬滅，信號(hào)水平很低。當(dāng)存在其中可與其中一種適配體特異性結(jié)合的小分子時(shí)，適配體就與小分子結(jié)合，并離開納米金表面，因此，納米金的淬滅作用不發(fā)揮作用，該適配體釋放強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。本專利申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“熒光基團(tuán)”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，能夠標(biāo)記到DNA上的熒光基團(tuán)都可以，但是三種不同的熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射峰位置需要相差50 nm以上，避免發(fā)射光譜的疊加。修飾好的熒光基團(tuán)的核酸適配體可以從生物公司購(gòu)買，但在熒光基團(tuán)的選擇上要求各個(gè)核酸適配體熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不能有重疊。因此也不宜采用磷
光基團(tuán)。本專利申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“巰基修飾DNA片段”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，就是在實(shí)驗(yàn)采用的DNA片段的末端標(biāo)記有巰基。本發(fā)明中的探針設(shè)計(jì)，先將幾種不同序列巰基修飾的DNA片段(單鏈)組裝在納米金顆粒上，這幾條DNA片段單鏈可以分別與其特定需要的適配體(aptamer)互補(bǔ)雜交。且適配體鏈用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，與納米金表面組裝的互補(bǔ)DNA雜交，一起構(gòu)成納米金多色探針。由于熒光基團(tuán)靠近納米金表面，其信號(hào)很低，只要存在其中一種小分子時(shí)，aptamer遠(yuǎn)離納米金表面，釋放強(qiáng)烈熒光信號(hào)
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
I.本發(fā)明的小分子探針具有相對(duì)較高的檢測(cè)靈敏度，納米金具有極高的淬滅能力，而且金顆粒在較低的離子強(qiáng)度條件下吸收效果較好，所以用納米金粒子代替DABSYL大大提高了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性。特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高，有效減少了假陽(yáng)性結(jié)果。由于本發(fā)明采用適配體技術(shù)，因而能保持結(jié)果的正確，大大降低了假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的幾率，使得本發(fā)明適宜實(shí)際推廣。本發(fā)明的方法可以利用未經(jīng)精度提純的待測(cè)樣品直接檢測(cè)而仍舊能保持實(shí)用的靈敏度和特異性，不會(huì)出現(xiàn)適配體與靶分子(MAM mRNA)和其他非特異核酸序列互相干擾的情況。操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短。由于本發(fā)明小分子探針的檢測(cè)方法實(shí)際上只需要將小分子探針和帶檢測(cè)的樣品簡(jiǎn)單混合放置后，然后測(cè)量熒光信號(hào)的變化。除去檢測(cè)步驟，其他步驟操作簡(jiǎn)單、方便，耗時(shí)短，無(wú)需復(fù)雜儀器及特別技巧，尤其是該方法可以利用未經(jīng)精度提純的待測(cè)樣品直接檢測(cè)這樣極大地方便了檢測(cè)操作，節(jié)省了試劑使用并加快了檢測(cè)進(jìn)程，可以推廣進(jìn)行實(shí)際的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。檢測(cè)分子種類多，本發(fā)明的納米金(AuNPs)探針，探針結(jié)合適配體技術(shù)，該探針將熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及其巰基修飾的互補(bǔ)序列共組裝到納米金表面，可以在均相體系中檢測(cè)多種小分子，該策略為快速檢測(cè)多種小分子提供一種潛在的方法。產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，儲(chǔ)存條件要求不高。適配體比蛋白抗體更穩(wěn)定,不易變性,容易長(zhǎng)時(shí)間保存，這造成產(chǎn)品的有效期將大大延長(zhǎng)。



下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
圖I為基于納米金和適配體的小分子探針的設(shè)計(jì)以及檢測(cè)原理示意圖。
圖2A為本發(fā)明小分子探針對(duì)腺苷A檢測(cè)結(jié)果及空白對(duì)照；圖2B為本發(fā)明小分子探針對(duì)腺苷A及類似物腺苷(T，G, C)檢測(cè)的信號(hào)對(duì)比。圖3A為本發(fā)明小分子探針對(duì)鉀離子K+檢測(cè)結(jié)果及空白對(duì)照；圖38為本發(fā)明小分子探針對(duì)鉀離子K+及類似物離子(Li，Na)檢測(cè)的信號(hào)對(duì)比。
圖4A為本發(fā)明小分子探針對(duì)可卡因cocaine檢測(cè)結(jié)果及空白對(duì)照；圖4B為本發(fā)明小分子探針對(duì)可卡因及類似物芽子堿甲酯(ΕΜΕ)、苯甲酸(BE)檢測(cè)的信號(hào)對(duì)比。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。以下將以舉例形式進(jìn)行說(shuō)明，如有未詳盡之處，可以參見常用的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》以及所用試劑和儀器的廠商說(shuō)明書。其中，所有化學(xué)試劑均采用分析級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Milli-XQ過(guò)濾，各試劑均和材料可以商用渠道獲得，腺嘌呤(Α)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)購(gòu)自sigma公司，熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體以及互補(bǔ)DNA片段購(gòu)自大連TKARA公司，各種金屬離子購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，納米金由本實(shí)驗(yàn)室合成。
實(shí)施例實(shí)施例I納米金-DNA片段的制備
1.I準(zhǔn)備納米金顆粒
納米金的合成，高濃度納米金為檸檬酸還原法制備后用離心法濃縮制得(Hurst, S.J. ; Lytton-Jean, A. K. ; Mirkin, C. A. , Anal Chem 2006, 8313-8. )。4 保存，使用時(shí)根據(jù)具體需要進(jìn)行稀釋或濃縮，合成的納米金為13納米。準(zhǔn)備三條分別與腺苷、鉀離子以及可卡因適配體互補(bǔ)的巰基修飾的DNA片段，直接從商業(yè)渠道獲得。通過(guò)金硫鍵將DNA片段組裝到納米金表面得到納米金-DNA片段
將三條分別與腺苷、鉀離子以及可卡因的適配體互補(bǔ)的巰基修飾的DNA以及有利于DNA雜交的巰基修飾的10個(gè)T構(gòu)成的DNA (SH-TlO)和10 nM的納米金混合，核酸體DNA終濃度為I μ M，而SH-TlO的終濃度為2 μ Μ。過(guò)夜后加入濃度為O. I M的PBS，pH值為7. 4，采用12000 rpm速度，在4度下離心3次，每次用O. I M的PBS懸浮，去掉未組裝到納米金表面的DNA。實(shí)施例2熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體及納米金和核酸適配體的小分子探針的制備
2.I準(zhǔn)備熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺苷、鉀離子以及可卡因適配體，直接從商業(yè)渠道獲得。能夠標(biāo)記到DNA上的熒光基團(tuán)都可以，但是三種不同的熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射峰位置需要相差50 nm以上，避免發(fā)射光譜的疊加。將熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺苷、鉀離子以及可卡因的適配體按等摩爾量與實(shí)施例I中組裝好DNA片段的納米金溶液混合，在室溫下放置一夜。適配體與上述DNA片段雜交。離心去掉多余的適配體，得到需要的小分子探針。實(shí)施例3使用本發(fā)明的基于納米金和適配體的小分子探針的檢測(cè)取實(shí)施例2中制備好的小分子探針，同時(shí)加入10 mM的A、100 mM KCl和I mM可卡因，室溫放置I小時(shí)，空白對(duì)照是等量的去離子水，然后用相應(yīng)波長(zhǎng)激發(fā)測(cè)量其熒光信號(hào)。為了考察該探針的特異性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)加入各種檢測(cè)物的類似物，例如腺苷A的類似物T、C、G，K+的類似物L(fēng)i+、Na+以及可卡因的類似物芽子堿甲酯(ΕΜΕ)、苯甲酸(BE)，各自濃度與其類似物相同，如圖2- 4所示，可以看到，該探針的選擇性非常好。上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求
1.基于納米金和適配體的小分子探針，包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，其特征在于，還包括一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補(bǔ)雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6-10個(gè)長(zhǎng)度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補(bǔ)雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述納米金顆粒與核酸適配體熒光基團(tuán)的距離控制在2-3納米。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有各不相同的熒光基團(tuán)，為-ROX，-FAM或 _Cy5。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段為3種，與其互補(bǔ)雜交的適配體為3種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基于納米金和適配體的小分子探針，其特征在于，所述小分子探針，包括至少下列一對(duì)熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補(bǔ)雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段 與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示Aa:5’ - AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 Pa: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’ 與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示Ακ:5’ -TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的 DNA 片段如 SEQ ID No. 5 所示 Pk: 5’ -CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’ 與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示A。: 5’- AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補(bǔ)的DNA片段如 SEQ ID No. 6 所示 Pc: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’ ； 上述的三種適配體的5’端連接有-ROX，-FAM或-Cy5熒光基因中的一種，且各個(gè)適配體的熒光基因各不相同。
8.制備權(quán)利要求1-7所述的基于納米金和核酸適配體的小分子探針的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)準(zhǔn)備與核酸適配體互補(bǔ)的巰基修飾的DNA片段及納米金顆粒，還加入了為核酸適配體I. 5-2. 5倍摩爾濃度的10個(gè)胸腺嘧啶T，通過(guò)金硫鍵將DNA片段組裝到納米金表面得到納米金-DNA片段； (2)準(zhǔn)備熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體，將等摩爾量的核酸適配體與步驟(I)制備的納米金-DNA片段混合得到所述基于納米金和核酸適配體的小分子探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)為將一定量的巰基修飾的DNA和納米金混合，得到納米金-DNA片段，過(guò)夜后加入一定濃度的PBS，離心去掉未組裝到納米金表面的DNA片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)加入的胸腺嘧啶T為核酸適配體2倍摩爾濃度的胸腺嘧啶。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在最終的納米金-DNA片段混合溶液中，巰基修飾的DNA : 10個(gè)胸腺嘧啶T :納米金的濃度為1:2: 10000。
13.一種基于納米金和適配體的小分子探針的試劑盒，所述試劑盒，包括納米金顆粒，還包括組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補(bǔ)雜交。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述巰基修飾DNA片段，其3’端為巰基-SH修飾且在該末端有6-10個(gè)長(zhǎng)度的胸腺嘧啶T作為間隔，其5’端的部分堿基與所述的突光基團(tuán)標(biāo)記的適配體能夠互補(bǔ)雜交。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金的粒徑為13納米-15納米。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，其5’端修飾有不同的熒光基團(tuán)，為-ROX，-FAM或-Cy5。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，包括至少下列一對(duì)熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及與其互補(bǔ)雜交的組裝在納米金顆粒上的巰基修飾DNA片段 與腺苷A特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. I所示Aa:5’ -ROX-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，巰基修飾的與腺苷A特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的DNA 片段如 SEQ ID No. 4 所示 Pa: 5’ -CCC AGG TTC TCT TTTTTTTTTT-SH-3’ 與鉀離子K+特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 2所示Ak: 5’-FAM-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，巰基修飾的與鉀離子K+特異性結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)的DNA片段如SEQ IDNo. 5 所示 Pk: 5，-CTA ACC CGT AGA TTTTTTTTTT-SH-3’ 與可卡因特異結(jié)合的適配體如SEQ ID No. 3所示Ae:5’ _Cy5_AAGTGGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’，巰基修飾的與可卡因特異性結(jié)合的核酸適體互補(bǔ)的DNA片段如 SEQ ID No. 6 所示 Pc: 5，-TTG TCT CCC CAC TTTTTTTTTTTT-SH-3’。
18.基于納米金和適配體的小分子探針的使用方法，其特征在于，將所述小分子探針加入待測(cè)溶液，室溫放置1-24小時(shí)然后測(cè)量熒光信號(hào)的變化。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法，本發(fā)明的小分子探針包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，還包括一種以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體，且所述一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補(bǔ)雜交。本發(fā)明的小分子探針檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高，有效減少了假陽(yáng)性結(jié)果。由于本發(fā)明采用適配體技術(shù)，具有相對(duì)較高的檢測(cè)靈敏度，而且能同時(shí)檢測(cè)多種分子。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102676508SQ20121011811
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者宋世平, 樊春海, 黃慶 申請(qǐng)人:華森新科(蘇州)納米技術(shù)有限公司