專利名稱：采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于正己酸、正丁酸制備領(lǐng)域，特別涉及一種采用復(fù)合菌種發(fā)酵生產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法。
背景技術(shù)：
正丁酸(C4H8O2)、正己酸(C6H12O2)及其衍生物既是重要的有機(jī)化工原料，又是重要的精細(xì)化學(xué)品，廣泛用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、日用品、環(huán)保、化工、能源等領(lǐng)域。現(xiàn)在正丁酸、正己酸的工業(yè)化生產(chǎn)均為化學(xué)合成法。正丁酸的生產(chǎn)方法主要有正丁醛氧化法和正戊醇硝酸氧化法；所述正丁醛氧化法以正丁醛為原料，氧氣或空氣作為氧化劑，有無催化劑均可完成反應(yīng)生成正丁酸；所述正戊醇硝酸氧化法以正戊醇為原料，在沸騰的濃硝酸中先發(fā)生消除反應(yīng)，失去一分子水而生成烯烴，烯烴再進(jìn)一步被硝酸氧化而失去一個碳原子，生成正丁酸。正己酸的生產(chǎn)方法主要有仲辛醇氧化法、正己醇氧化法、己腈水解法和正己醛氧化法；所述仲辛醇氧化法是將仲辛醇滴入工業(yè)硝酸中，在50 55°C進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完后用水洗滌，得粗己酸，然后常壓脫水，再減壓蒸餾脫水，收取158°C (SKPa)餾分，即獲正己酸；所述正己醇氧化法是將正己醇經(jīng)空氣或氧氣氧化生成正己酸；所述己腈水解法是將己腈水解生成正己酸；所述正己醛氧化法是將正己醛氧化生成正己酸。上述生產(chǎn)方法存在以下不足1、由于所用原料為石化產(chǎn)品，而石油是不可再生資源，呈現(xiàn)日益枯竭的狀況，勢必面臨原料日益短缺，成本日益增加的局面；2、通過化學(xué)方法合成的正己酸、正丁酸產(chǎn)品不能被食品添加劑行業(yè)所接受，因而使其在食品及食品相關(guān)行業(yè)的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，此種方法不僅原料易于獲取，生產(chǎn)成本降低，而且所制備的正己酸、正丁酸能滿足食品及食品相關(guān)行業(yè)的安全性要求。本發(fā)明技術(shù)方案將干酵母活化液、丁酸菌種子液、己酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，然后將發(fā)酵液過濾并將過濾所得發(fā)酵液清液進(jìn)行減壓濃縮，所獲濃縮液用精餾塔精餾分離，即可分段分別收集正丁酸、正己酸。本發(fā)明中，復(fù)合發(fā)酵所用己酸菌、丁酸菌從酒窖窖泥中篩選出原始出發(fā)株，再通過紫外線照射(參考“紫外線誘變菌種方法”，《發(fā)酵科技通訊》2009年第2期，p46)及硫酸二乙酯處理(參考“硫酸二乙酯(DES)誘變育種方法”，《發(fā)酵科技通訊》2009年第I期，p37)誘變后篩選得到。所述己酸菌、丁酸菌已送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；己酸菌的分類梭菌Clostyiclium sp.,保藏編號CGMCC No. 5784 ;丁酸菌的分類丁酸梭菌 Clostyiclium butyricum,保藏編號CGMCC No. 5785 ;保藏日期2012 年 2 月 21 日。本發(fā)明所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，工藝步驟如下
(I)干酵母活化液的制備將質(zhì)量濃度2 5%的葡萄糖水溶液在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35 40°C，然后加入活性干酵母在35 40°C保溫15 20分鐘，再降溫至30 33°C保溫I 2小時(shí)，即獲干酵母活化液，所述活性干酵母的加入量為每升葡萄糖水溶液I 2g ;(2) 丁酸菌種子液的制備將丁酸菌種子培養(yǎng) 基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)2 3天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入I 2環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(3)己酸菌種子液的制備將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的I. 5 2%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)2 3天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入I 2環(huán)所述己酸菌斜面種子；⑷復(fù)合發(fā)酵將干酵母活化液、丁酸菌種子液、己酸菌種子液按體積比3 5 4 8 8 10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中形成復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)，所述復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)中，干酵母活化液、丁酸菌種子液和己酸菌種子液的總體積百分?jǐn)?shù)為10 20%，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分?jǐn)?shù)為80 90%，在常壓、30 37°C靜置發(fā)酵10 12天,獲成熟發(fā)酵液；(5)過濾與濃縮將步驟(4)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的10 20% ；(6)精餾將步驟(5)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，分段分別收集正丁酸、正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 05 O. IlMpa,初始精餾塔頂溫控制在80 90°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在90 99 °C。上述方法中，丁酸菌種子培養(yǎng)基的配方是每升蒸餾水中加入胰蛋白胨15 20g、牛肉浸膏10 15g、酵母膏5 6g、葡萄糖3 4g、磷酸氫二鉀2 3g、磷酸二氫鉀I 2g、硫酸鎂O. 4 O. 6g、氯化I丐O. 2 O. 3g、硫酸亞鐵O. I O. 2g、鹽酸半胱氨酸O. 5 O. 6g。上述方法中，己酸菌種子培養(yǎng)基的配方是每升蒸餾水中加入乙酸鈉5 8g、酵母膏5 10g、硫酸銨O. 2 O. 5g、磷酸氫二鉀4 5g、碳酸 丐8 10g。上述方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下葡萄糖6 10%
酵母膏0.1 1.2%
硫酸銨O. I 1.0%
磷酸氫二鉀 O. I 1.0%
自來水87 93% ,將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至110 125°C保溫30 60分鐘，然后冷卻到33 37 °C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明具有以下有益效果I、本發(fā)明所述方法利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)正己酸、正丁酸，其生產(chǎn)方式天然、綠色，所得產(chǎn)品滿足食品行業(yè)的要求，安全可靠。2、本發(fā)明所述方法通過多菌種協(xié)同發(fā)酵，獲得了較高的產(chǎn)酸水平，己酸、丁酸總量達(dá)到41g/L，提制總收得率大于80%。3、本發(fā)明所述方法擯棄了對不可再生資源(石油)的依賴，節(jié)約了資源，符合低碳經(jīng)濟(jì)及可持續(xù)發(fā)展的方向。4、本發(fā)明所述方法與化學(xué)合成法相比，降低了正己酸、正丁酸的生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法作進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中，活性干酵母、配制丁酸菌種子培養(yǎng)基的原料、配制己酸菌種子培養(yǎng)基的原料、配制發(fā)酵培養(yǎng)基的原料均為市售商品。板框過濾機(jī)的型號320型，購自禹州市強(qiáng)國化工設(shè)備有限公司；精餾塔的規(guī)格Φ40X1X800，購自成都?？茩C(jī)械設(shè)備制造有限公司；濃縮設(shè)備為HZ-TNG-50，購自上海輝展實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。實(shí)施例I本實(shí)施例所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其工藝步驟如下(I)干酵母活化液的制備
將質(zhì)量濃度2%的葡萄糖水溶液在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入活性干酵母在35°C保溫20分鐘，再降溫至30°C保溫2小時(shí)，即獲干酵母活化液，所述活性干酵母的加入量為每升葡萄糖水溶液Ig ;(2) 丁酸菌種子液的制備丁酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入胰蛋白胨15g、牛肉浸膏15g、酵母膏5g、葡萄糖4g、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀lg、硫酸鎂O. 4g、氯化鈣O. 3g、硫酸亞鐵O. 2g、鹽酸半胱氨酸O. 5g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成丁酸菌種子培養(yǎng)基；將所配制的丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)2天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入一環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(3)己酸菌種子液的制備
己酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入乙酸鈉5g、酵母膏10g、硫酸銨O. 5g、磷酸氫二鉀4g、碳酸鈣Sg，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成己酸菌種子培養(yǎng)基;將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的1.5%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)3天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入一環(huán)所述己酸菌斜面種子； ⑷復(fù)合發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至110°C保溫60分鐘，然后冷卻到37°C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖6.7%、酵母膏O. 1%、硫酸銨O. 1%、磷酸氫二鉀O. 1%、自來水93% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，按干酵母活化液體積丁酸菌種子液體積己酸菌種子液體積=3 4 8將它們接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中形成復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)，所述復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)中，干酵母活化液、丁酸菌種子液和己酸菌種子液的總體積為5L(總體積百分?jǐn)?shù)為10% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為45L(體積百分?jǐn)?shù)為90% )，在常壓、30°C靜置發(fā)酵12天，獲成熟發(fā)酵液；(5)過濾與濃縮將步驟(4)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的10% ；(6)精餾將步驟(5)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，分段分別收集正丁酸、正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 05Mpa，初始精餾塔頂溫控制80°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在90。。。本實(shí)施例中，正己酸產(chǎn)量為18. 2g/L，正丁酸產(chǎn)量為17. 5g/L。實(shí)施例2本實(shí)施例所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其工藝步驟如下(I)干酵母活化液的制備將質(zhì)量濃度5%的葡萄糖水溶液在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后加入活性干酵母在37°C保溫18分鐘，再降溫至33°C保溫I小時(shí)，即獲干酵母活化液，所述活性干酵母的加入量為每升葡萄糖水溶液2g ；(2) 丁酸菌種子液的制備丁酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入胰蛋白胨20g、牛肉浸膏10g、酵母膏6g、葡萄糖3g、磷酸氫二鉀2g、磷酸二氫鉀I. 5g、硫酸鎂O. 5g、氯化鈣O. 2g、硫酸亞鐵O. lg、鹽酸半胱氨酸O. 6g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成丁酸菌種子培養(yǎng)基；將所配制的丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)3天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入一環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(3)己酸菌種子液的制備己酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入乙酸鈉6g、酵母膏7g、硫酸銨O. 2g、磷酸氫二鉀5g、碳酸鈣9g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成己酸菌種子培養(yǎng)基；將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的2%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)2天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入兩環(huán)所述己酸菌斜面種子；
⑷復(fù)合發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至120°C保溫40分鐘，然后冷卻到33°C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖8%、酵母膏I. 2%、硫酸銨O. 5%、磷酸氫二鉀O. 3%、自來水90% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，按干酵母活化液體積丁酸菌種子液體積己酸菌種子液體積=5 7 10將它們接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中形成復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)，所述復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)中，干酵母活化液、丁酸菌種子液和己酸菌種子液的總體積為IOL (總體積百分?jǐn)?shù)為20% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為40L(體積百分?jǐn)?shù)為80% )，在常壓、35°C靜置發(fā)酵11天，獲成熟發(fā)酵液；(5)過濾與濃縮將步驟(4)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的15% ；(6)精餾將步驟(5)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，分段分別收集正丁酸、正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 08Mpa，初始精餾塔頂溫控制85°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在95。。。本實(shí)施例中，正己酸產(chǎn)量為20. 5g/L，正丁酸產(chǎn)量為18. 8g/L。實(shí)施例3本實(shí)施例所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其工藝步驟如下(I)干酵母活化液的制備將質(zhì)量濃度3%的葡萄糖水溶液在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至40°C，然后加入活性干酵母在40°C保溫15分鐘，再降溫至32°C保溫I. 5小時(shí)，即獲干酵母活化液，所述活性干酵母的加入量為每升葡萄糖水溶液I. 5g ；(2) 丁酸菌種子液的制備丁酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入胰蛋白胨18g、牛肉浸膏13g、酵母膏4g、葡萄糖3. 5g、磷酸氫二鉀2. 5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂O. 6g、氯化鈣O. 3g、硫酸亞鐵O. 2g、鹽酸半胱氨酸O. 5g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成丁酸菌種子培養(yǎng)基；將所配制的丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)2天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入兩環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(3)己酸菌種子液的制備己酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入乙酸鈉Sg、酵母膏5g、硫酸銨O. 3g、磷酸氫二鉀4. 5g、碳酸鈣10g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成己酸菌種子培養(yǎng)基；將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成 含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的2%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)3天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入兩環(huán)所述己酸菌斜面種子；⑷復(fù)合發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至125°C保溫30分鐘，然后冷卻到35°C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖10%、酵母膏1%、硫酸銨1%、磷酸氫二鉀1%、自來水87% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，按干酵母活化液體積丁酸菌種子液體積己酸菌種子液體積=4 8 9將它們接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中形成復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)，所述復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)中，干酵母活化液、丁酸菌種子液和己酸菌種子液的總體積為7. 5L(總體積百分?jǐn)?shù)為15% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為42. 5L(體積百分?jǐn)?shù)為85% )，在常壓、37°C靜置發(fā)酵10天，獲成熟發(fā)酵液；(5)過濾與濃縮將步驟(4)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的20% ；(6)精餾將步驟(5)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，分段分別收集正丁酸、正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. llMpa，初始精餾塔頂溫控制90°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在99。。。本實(shí)施例中，正己酸產(chǎn)量為23. 6g/L，正丁酸產(chǎn)量為17. 5g/L。對比例I :用己酸菌發(fā)酵生產(chǎn)正己酸，其工藝步驟如下(I)己酸菌種子液的制備己酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入乙酸鈉5g、酵母膏10g、硫酸銨O. 5g、磷酸氫二鉀4g、碳酸鈣Sg，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成己酸菌種子培養(yǎng)基;將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的1.5%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)3天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入一環(huán)所述己酸菌斜面種子；(2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將乙酸鈉、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至110°c保溫60分鐘，然后冷卻到37°C，加入乙醇，即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為乙酸鈉1%、酵母膏I. 2%、硫酸銨O. 5%、磷酸氫二鉀O. 3%,乙醇3%、自來水94% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，將己酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，己酸菌種子液的體積為5L(總體積百分?jǐn)?shù)為10% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為45L(體積百分?jǐn)?shù)為90% )，在常壓、30°C靜置發(fā)酵12天,獲成熟發(fā)酵液；(3)過濾與濃縮將步驟(2)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾 機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的10% ；(4)精餾將步驟(3)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，收集正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 05Mpa,初始精餾塔頂溫控制80°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在90°C。本實(shí)施例中，正己酸產(chǎn)量為16. 2g/L。對比例2 :用己酸菌發(fā)酵生產(chǎn)正己酸，其工藝步驟如下(I)己酸菌種子液的制備己酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入乙酸鈉6g、酵母膏7g、硫酸銨O. 2g、磷酸氫二鉀5g、碳酸鈣9g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成己酸菌種子培養(yǎng)基；將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的2%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)2天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入兩環(huán)所述己酸菌斜面種子；(2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將乙酸鈉、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至120°C保溫40分鐘，然后冷卻到33°C，加入乙醇，即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為乙酸鈉0.8%、酵母膏1%、硫酸銨O. 1%、磷酸氫二鉀O. 1%,乙醇3%、自來水95% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，將己酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，己酸菌種子液的體積為IOL (總體積百分?jǐn)?shù)為20% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為40L(體積百分?jǐn)?shù)為80% )，在常壓、35 °C靜置發(fā)酵11天，獲成熟發(fā)酵液；(3)過濾與濃縮將步驟(2)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的15% ；(4)精餾將步驟(3)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，收集正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 08Mpa,初始精餾塔頂溫控制85°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在95°C。本實(shí)施例中，正己酸產(chǎn)量為17. 2g/L。對比例3 :用己酸菌發(fā)酵生產(chǎn)正己酸，其工藝步驟如下(I)己酸菌種子液的制備
己酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入乙酸鈉Sg、酵母膏5g、硫酸銨O. 3g、磷酸氫二鉀4. 5g、碳酸鈣10g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成己酸菌種子培養(yǎng)基；將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的2%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)3天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入兩環(huán)所述己酸菌斜面種子；
(2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將乙酸鈉、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至125°C保溫30分鐘，然后冷卻到35°C，加入乙醇，即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為乙酸鈉1%、酵母膏1%、硫酸銨1%、磷酸氫二鉀1%、乙醇3%、自來水93% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，將己酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，己酸菌種子液的體積為7. 5L (總體積百分?jǐn)?shù)為15% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為42. 5L(體積百分?jǐn)?shù)為85% )，在常壓、37°C靜置發(fā)酵10天,獲成熟發(fā)酵液；(3)過濾與濃縮將步驟(2)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的20% ；(4)精餾將步驟(3)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，收集正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. llMpa，初始精餾塔頂溫控制90°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在99°C。本實(shí)施例中，正己酸產(chǎn)量為16. 9g/L。對比例4 :用丁酸菌發(fā)酵生產(chǎn)正丁酸，其工藝步驟如下(I) 丁酸菌種子液的制備丁酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入胰蛋白胨15g、牛肉浸膏15g、酵母膏5g、葡萄糖4g、磷酸氫二鉀3g、磷酸二氫鉀lg、硫酸鎂O. 4g、氯化鈣O. 3g、硫酸亞鐵O. 2g、鹽酸半胱氨酸O. 5g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成丁酸菌種子培養(yǎng)基；將所配制的丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)2天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入一環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至110°c保溫60分鐘，然后冷卻到37°C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖6.7%、酵母膏O. 1%、硫酸銨O. 1%、磷酸氫二鉀O. 1%、自來水93% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，將丁酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，丁酸菌種子液的體積為5L (總體積百分?jǐn)?shù)為10% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為45 (體積百分?jǐn)?shù)為90% )，在常壓、30°C靜置發(fā)酵12天，獲成熟發(fā)酵液；
(3)過濾與濃縮將步驟(2)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的10% ；(4)精餾將步驟(3)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，收集正丁酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 05Mpa,初始精餾塔頂溫控制80°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在90°C。本實(shí)施例中，正丁酸產(chǎn)量為12. 5g/L對比例5 :用丁酸菌發(fā)酵生產(chǎn)正丁酸，其工藝步驟如下(I) 丁酸菌種子液的制備丁酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入胰蛋白胨20g、牛肉浸膏10g、酵母膏6g、葡萄糖3g、磷酸氫二鉀2g、磷酸二氫鉀I. 5g、硫酸鎂O. 5g、氯化鈣O. 2g、硫酸亞鐵
O.lg、鹽酸半胱氨酸O. 6g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成丁酸菌種子培養(yǎng)基；將所配制的丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)3天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入一環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至120°C保溫40分鐘，然后冷卻到33°C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖4%、酵母膏I. 2%、硫酸銨O. 5%、磷酸氫二鉀O. 3%、自來水94% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，將丁酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，丁酸菌種子液的體積為IOL (總體積百分?jǐn)?shù)為20% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為40L(體積百分?jǐn)?shù)為80% )，在常壓、35 °C靜置發(fā)酵11天，獲成熟發(fā)酵液；(3)過濾與濃縮將步驟(2)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的15% ；(4)精餾將步驟(3)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，收集正丁酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 08Mpa,初始精餾塔頂溫控制85°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在95°C。本實(shí)施例中，正丁酸產(chǎn)量為11. 5g/L。對比例6 :用丁酸菌發(fā)酵生產(chǎn)正丁酸，其工藝步驟如下(I) 丁酸菌種子液的制備丁酸菌種子培養(yǎng)基的配制每升蒸餾水中加入胰蛋白胨18g、牛肉浸膏13g、酵母膏4g、葡萄糖3. 5g、磷酸氫二鉀2. 5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂O. 6g、氯化鈣O. 3g、硫酸亞鐵
O.2g、鹽酸半胱氨酸O. 5g，在攪拌下各組分溶解并混合均勻即形成丁酸菌種子培養(yǎng)基；將所配制的丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)2天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入兩環(huán)所述丁酸菌斜面種子；(2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至125°C保溫30分鐘，然后冷卻到35°C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖6%、酵母膏1%、硫酸銨1%、磷酸氫二鉀1%、自來水91% ；將發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐，將丁酸菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，丁酸菌種子液的體積為7. 5L (總體積百分?jǐn)?shù)為15% )，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為42. 5L(體積百分?jǐn)?shù)為85% )，在常壓、37°C靜置發(fā)酵10天,獲成熟發(fā) 酵液；(3)過濾與濃縮將步驟(2)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)板框過濾機(jī)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液用濃縮設(shè)備進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的20% ；(4)精餾將步驟(3)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，收集正丁酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. llMpa，初始精餾塔頂溫控制90°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在99°C。本實(shí)施例中，正丁酸產(chǎn)量為12. 4g/L。
權(quán)利要求
1.一種采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其特征在于工藝步驟如下 (1)干酵母活化液的制備 將質(zhì)量濃度2 5%的葡萄糖水溶液在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35 40°C，然后加入活性干酵母在35 40°C保溫15 20分鐘，再降溫至30 33°C保溫I 2小時(shí)，即獲干酵母活化液，所述活性干酵母的加入量為每升葡萄糖水溶液I 2g ; (2)丁酸菌種子液的制備 將丁酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至37°C，然后將丁酸菌CGMCC 5785斜面種子接種于丁酸菌種子培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)2 3天，即形成丁酸菌種子液，丁酸菌CGMCC 5785斜面種子的接種量為每500ml 丁酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入I 2環(huán)所述丁酸菌斜面種子； (3)己酸菌種子液的制備 將己酸菌種子培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘，滅菌時(shí)間屆滿后冷卻至35°C，然后加入酒精并振蕩使其均勻形成含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基，所述酒精的加入量為己酸菌種子培養(yǎng)基體積的I. 5 2%，繼后將己酸菌CGMCC 5784斜面種子接種于所述含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中，在35°C靜置培養(yǎng)2 3天，即形成己酸菌種子液，己酸菌CGMCC 5784斜面種子的接種量為每500ml含酒精的己酸菌種子培養(yǎng)基中用接種針挑入I 2環(huán)所述己酸菌斜面種子； (4)復(fù)合發(fā)酵 將干酵母活化液、丁酸菌種子液、己酸菌種子液按體積比3 5 4 8 8 10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中形成復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)，所述復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)中，干酵母活化液、丁酸菌種子液和己酸菌種子液的總體積百分?jǐn)?shù)為10 20%，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分?jǐn)?shù)為80 90%，在常壓、30 37°C靜置發(fā)酵10 12天,獲成熟發(fā)酵液； (5)過濾與濃縮 將步驟(4)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液的體積為發(fā)酵液清液體積的10 20% ； (6)精餾 將步驟(5)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，分段分別收集正丁酸、正己酸，精餾塔內(nèi)的真空度控在O. 05 O. IlMpa,初始精餾塔頂溫控制在80 90°C，調(diào)整控制回流時(shí)塔內(nèi)溫度控制在90 99°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其特征在于所述丁酸菌種子培養(yǎng)基的配方是每升蒸餾水中加入胰蛋白胨15 20g、牛肉浸膏10 15g、酵母膏5 6g、葡萄糖3 4g、磷酸氫二鉀2 3g、磷酸二氫鉀I 2g、硫酸鎂O. 4 O. 6g、氯化I丐O. 2 O. 3g、硫酸亞鐵O. I O. 2g、鹽酸半胱氨酸O. 5 O. 6g。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其特征在于所述己酸菌種子培養(yǎng)基的配方是每升蒸餾水中加入乙酸鈉5 Sg、酵母膏5 10g、硫酸銨O. 2 O. 5g、磷酸氫二鉀4 5g、碳酸 丐8 10g。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下葡萄糖6 10% 酵母膏0.1 1.2% 硫酸銨O. I 1.0%磷酸氫二鉀 O. I 1.0% 自來水87 93% , 將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至110 125°C保溫30 60分鐘，然后冷卻到33 37 °C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下 葡萄糖6 10% 酵母膏0.1 1.2% 硫酸銨O. I 1.0%磷酸氫二鉀 O. I 1.0% 自來水87 93% , 將葡萄糖、酵母膏、硫酸銨、磷酸氫二鉀加入自來水中，在攪拌下加熱至110 125°C保溫30 60分鐘，然后冷卻到33 37 °C即獲發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
一種所述采用復(fù)合菌種發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)正己酸、正丁酸的方法，工藝步驟如下(1)干酵母活化液的制備；(2)丁酸菌種子液的制備；(3)己酸菌種子液的制備；(4)將干酵母活化液、丁酸菌種子液、己酸菌種子液按體積比3～5∶4～8∶8～10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中形成復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)，所述復(fù)合發(fā)酵系統(tǒng)中，干酵母活化液、丁酸菌種子液和己酸菌種子液的總體積百分?jǐn)?shù)為10～20％，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分?jǐn)?shù)為80～90％，在常壓、30～37℃靜置發(fā)酵10～12天，獲成熟發(fā)酵液；(5)將步驟(4)得到的成熟發(fā)酵液經(jīng)過濾除去菌絲體，然后將過濾所得發(fā)酵液清液進(jìn)行減壓濃縮；(6)將步驟(5)得到的濃縮液用精餾塔精餾分離，分段分別收集正己酸、正丁酸。
文檔編號C12R1/145GK102618617SQ201210100119
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者劉波, 尹昌樹 申請人:四川省申聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司