專利名稱：紫貽貝c型溶菌酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶菌酶，具體涉及紫貽貝C型溶菌酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme，EC 3. 2. I. 17)是無脊椎動物體內(nèi)非常重要的固有免疫因子之一，它主要通過切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的P -1，4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，使細(xì)胞脹裂從而引起細(xì)菌裂解。溶菌酶在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中不僅能直接殺死細(xì)菌，還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌。溶菌酶按照其來源可分為六類C (chicken)型、G (goose)型、I (invertebrate)型、植物型、細(xì)菌型和T4卩遼菌體型溶菌酶。G型溶菌酶主要存在于哺乳動物、鳥類和魚類中，專利號為CN 2004100506518及2004100506522從扇貝中獲得了 G型溶菌酶，而I型溶菌酶只存在于無脊椎動物中，C型溶 菌酶大都來自于脊椎動物。由于C型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抑制和滅殺作用，在較低溫度條件下活性較高且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，因此在作為水產(chǎn)飼料添加劑和水產(chǎn)品保鮮劑方面具有很好的應(yīng)用前景。目前，針對C型溶菌酶已開展較多研究，發(fā)現(xiàn)其通常含有130個左右的氨基酸殘基，具有4對二硫鍵，三維結(jié)構(gòu)呈較緊密的橢球。研究發(fā)現(xiàn)，Glu35、Asp52及Trp62殘基是C型溶菌酶活性的必需氨基酸殘基，Asp1'Arg114Jrpici8等殘基對“底物-酶復(fù)合物”的形成也發(fā)揮著重要作用(Muraki M,et al，1997)。近期研究發(fā)現(xiàn)，鮑魚、三疣梭子蟹等無脊椎動物也存在C型溶菌酶，并且該類型的C型溶菌酶具有較強(qiáng)的抑制革蘭氏陰性菌活性。迄今為止，尚未有關(guān)于紫貽貝C型溶菌酶及其抗菌活性的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了紫貽貝C型溶菌酶及表達(dá)基因，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示，該紫貽貝C型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抗菌作用。本發(fā)明還提供了紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，該制備方法能得到純度較高的紫貽貝C型溶菌酶。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為紫貽貝C型溶菌酶，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示。表達(dá)該紫貽貝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，其步驟如下
1)總RNA提取用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于_80°C備用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進(jìn)行；
2)mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ;純化方法依據(jù)QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進(jìn)行；
3)cDNA模板制備用cDNASynthesis Kit試劑盒(購于Stratagene公司)將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說明書進(jìn)行包括雙鏈cDNA經(jīng)末端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAEX II Agarose GelExtraction Kit純化試劑盒(購于QIAGEN公司)對大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體(購于Invetrogen公司)連接,得到cDNA質(zhì)粒,用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 試劑盒(購于 Stratagene 公司)對 cDNA 質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜(DMSO)，得到含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ;具體包裝、測定和擴(kuò)增方法依試劑盒說明書進(jìn)行；測序該C型溶菌酶表達(dá)基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；
4)基因克隆以上述含C型溶菌酶基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的引物如下正向引物 5'-TTACTTGTCT TGGTACTTGT G-3'，反向引物 5'- TTTGTATGCT ATTTTATTTTG-3' ;PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收，連接入pMD18-T載體(購于大連寶生物工程有限公司)得到克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOPlOF感受態(tài)細(xì)胞(購 于大連寶生物工程有限公司)中，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，得到C型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒；其中3’端PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR buffer 2. 5 U 1,25I. 0 u 1,2. 5 mM 的dNTP 2.0 u IUO UM的上述正向引物溶液I yl、10 uM的通用引物17溶液I yl、濃度為5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U 1，所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25U I ;反應(yīng)在ABI Veriti (購于ABI公司)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5 U I,25 mM的MgCl2溶液1.0 u 1,2. 5 mM的dNTP溶液2.0 u IUOuM的上述反向引物溶液
IPlUOii M的通用引物T3溶液I yl、濃度為5 U/ill的Taq DNA聚合酶0. 2 yl，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 U I,反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均購自Promega公司，通用引物17、通用引物T3購自上海生工科技有限公司；
5)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建對C型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)正向引物為含有Afco J酶切位點(diǎn)的下述核苷酸序列5'_ CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA _3'，反向引物為含IAo I酶切位點(diǎn)和6個His純化標(biāo)簽的下述核苷酸序5'-CTCGAGTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT-3' ;將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入pMD18_T載體中，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性亞克隆質(zhì)粒，提取陽性亞克隆質(zhì)粒，用Nco I和通o I (均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質(zhì)粒；用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，并將該片段導(dǎo)入經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-21a (+)(購于Novagen公司),構(gòu)建得到C型溶菌酶的表達(dá)質(zhì)粒；
6)表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)將上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)-plysS(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，篩選陽性克隆并測序確認(rèn)；挑取陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至0D600=0. 5-0. 7，加入異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使終濃度達(dá)到0. 6mM,繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，4°C，8000rpm離心10分鐘，收集菌液；
7)蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進(jìn)行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發(fā)明的紫貽貝C型溶菌酶；經(jīng)質(zhì)譜測序鑒定，測得序列符合該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQID NO. I 所示。
本發(fā)明的引物由上海生物工程有限公司合成 。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一種紫貽貝C型溶菌酶，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示，該紫貽貝C型溶菌酶的制備方法是通過對紫貽貝總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)和蛋白純化步驟得到該C型溶菌酶；該紫貽貝C型溶菌酶是一種新的C型溶菌酶，對多種革蘭氏陽性和陰性微生物具有較強(qiáng)的抑制活性，具有開發(fā)為食品保鮮劑和飼料添加劑等方面的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例一、用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進(jìn)行取紫貽貝仔血淋巴50 ml, 2000 g離心10分鐘，棄上清，向沉淀細(xì)胞中加入20 ml的TRIZOL(Invitrogen),用高速分散器將細(xì)胞分散，室溫下劇烈震蕩10秒；加入4 ml氯仿，劇烈震蕩30秒；4°C 10，000 g高速離心10分鐘；吸取上清液于一個新離心管中，加入冰浴過的等體積異丙醇(約15ml)，置于-20°C靜置I小時(shí)以上；4°C 10,000 g高速離心10分鐘；小心棄去上清液，用5 ml 70%的乙醇清洗沉淀；4°C10, OOOg高速離心10分鐘,小心棄去上清液；真空干燥5分鐘,用約600 V- I RNase-freewater溶解RNA，待完全溶解后儲存于-80°C備用。二、用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA,具體純化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進(jìn)行包括在37°C水浴加熱OligotexSuspension,震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB Buffer ;向500 U I總RNA溶液(RNA含量約為 2mg)中加入650 u I of OBB buffer, 135 u I of Oligotex Suspension,650U I of RNase-free water，70°C加熱體系3分鐘；取出反應(yīng)體系后，室溫下放置10分鐘，
15,000g離心2分鐘,小心吸走上清液,用600 V- I 0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀,劇烈震蕩。然后將懸池液移入放在I. 5 ml離心管中的spin column內(nèi)，15，000 g離心I分鐘,將spin column轉(zhuǎn)移到一個新的I. 5 ml離心管中，加入600 u I 0W2,15, 000 g離心I分鐘，將spin column轉(zhuǎn)移到新I. 5 ml離心管中；向spin column中加入50 U I預(yù)熱到70°C的OEB buffer,輕輕混勻，15，000 g 離心 I 分鐘；向 spin column 再加入 50 u I OEB buffer,混勻后15，000 g離心I分鐘；回收離心管中的mRNA溶液約100 u I0三、用cDNA Synthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體操作依試劑盒說明書進(jìn)行包括雙鏈cDNA末端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質(zhì)粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質(zhì)粒進(jìn)行卩遼菌體包裝、滴度測定和噬菌體文庫擴(kuò)增，具體方法參照說明書進(jìn)行，擴(kuò)增后的文庫加入終濃度為7%的DMSO溶液，得到含有核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C備用。具體逆轉(zhuǎn)錄方法包括一鏈cDNA合成在RNase-free的200 U I離心管中依次加入試劑混勻，然后加入30 u I poly(A)引物+ RNA (5 U g)，混勻，室溫下放置10分鐘后，向體系中加入I. 5 ill的一鏈合成酶StrataScript RT (50 U/yl)，終體積達(dá)到50 u I,輕輕混勻反應(yīng)體系,離心數(shù)秒,42°C溫育I小時(shí)。二鏈合成在冰上依次向含有一鏈cDNA的離心管中加入需用反應(yīng)物反應(yīng)，再向反應(yīng)體系中加入2 u I RNase H(l. 5 U/U I),Ilul DNA polymerase 1(9.0 U/ii I),輕輕混勻反應(yīng)體系,離心數(shù)秒，16 V放置2. 5小時(shí)后立即將反應(yīng)體系置于冰上。補(bǔ)平cDNA末端向二鏈合成體系中加入需用反應(yīng)物，快速震蕩反應(yīng)體系離心后，于72°C反應(yīng)30分鐘；加入200 u I酚一氯仿[1:1 (v/v)]，震蕩混勻體系，室溫下高速離心2分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下高速離心2分鐘，然后轉(zhuǎn)移上清至新管中；加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系20 u I 3M sodium acetate,400 u I 100% (v/v) ethanol, - 2CTC沉淀過夜；4°C高速離心60分鐘，小心棄去上清，保留沉淀；加入500 u I的70%乙醇輕輕洗滌沉淀，室溫高速離心2分鐘；輕輕吸去乙醇，在真空離心機(jī)中干燥沉淀；用9 U I含有EcoR I adapters的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分鐘。EcoR I接頭的連接向體系中加入下列成分1 U I10 X ligase buffer, I u I IOmM rATP, I u I T4 DNA ligase (4 U/u I),離心后 8°C放置過夜；70°C 30分鐘滅活連接酶。磷酸化EcoR I末端離心反應(yīng)物2秒，室溫放置5分鐘冷卻，加入下列反應(yīng)物用于磷酸化接頭1 V- I IOX ligase buffer, 2 u I IOmM rATP, 5 u Isterile water, 2 u I T4 polynucleotide kinase (5 U/u I), 37°C溫育 30 分鐘，7CTC 30分鐘滅活激酶，離心2秒后室溫放置5分鐘冷卻。Xho I內(nèi)切酶酶切向體系中加入下列成分28 u I Xho I buffer supplement, 3 u I Xho I (40 U/u I), 37°C溫育 I. 5 小時(shí)，加入125 u I的100% (v/v)乙醇，_20°C放置過夜，4°C離心60分鐘，棄去上清，完全干燥沉淀，用 50 u I ddH20 溶解沉淀。cDNA 與載體(Uni-ZAP XR vector, Invetrogen)連接在干凈的 200 u I 離心管中依次加入下列試劑2. 5 u I resuspended cDNA (>100 ng), 0. 5 U I10 X ligase buffer, 0. 5 u I 10 mM rATP (pH7. 5), I. 0 u I Uni-ZAP XR vector (I Hg)，
0.5 u I T4 DNA ligase (4 U/u 1)0 12°C放置過夜。噬菌體文庫的包裝從_ 80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4 Ul重組cDNA，用微量移液器吸頭混勻體系(不要產(chǎn)生氣泡)，離心5秒，室溫(22°C)溫育2小時(shí)，加入500 u I的SM buff er和20 U I氯仿，輕輕混勻反應(yīng)體系?？焖匐x心數(shù)秒，沉淀蛋白碎片，轉(zhuǎn)移上清至新管中。包裝反應(yīng)的滴度測定在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉10 g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，瓊脂粉15 g，pH7. 5)上將菌株XLl-Blue MRF’劃線培養(yǎng)，37 °C過夜培養(yǎng)；用LB液體培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，pH7. 5)培養(yǎng)單克隆菌落，30 °C, 200 rpm搖床培養(yǎng)過夜；4°C，1000 g下離心10分鐘沉淀細(xì)菌。用25 ml 10 mM MgS04 重懸細(xì)菌；用 10 mM MgSO4 重懸 XLl-Blue MRF’ 細(xì)胞，使?jié)舛冗_(dá)到 OD6tltl=0. 5 ;將包裝產(chǎn)物按下列比例與宿主菌混合(I) I u I包裝產(chǎn)物+ 200 u I XLl-BlueMRF，(OD600 = 0 . 5) ; (2) 0. I U I 包裝產(chǎn)物 + 200 u I XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5);將混合體系置于37 °C溫育15分鐘使噬菌體充分附著在宿主細(xì)胞表面；加入3 ml融化狀態(tài)下約48 1的NYZ上層培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉5 g，MgSO4 7H20 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g，瓊脂糖7 g，pH7. 5);迅速鋪在干燥預(yù)熱過的NYZ瓊脂培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基、含有氯化鈉5 g，MgSO4 7H20 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉15 g，pH7. 5)上，靜置10分鐘后，倒置于37°C過夜培養(yǎng)；8小時(shí)后可見噬菌斑；分別計(jì)數(shù)兩個平板的噬菌斑數(shù)目，計(jì)算其滴度(每毫升生長的噬菌斑數(shù)目，pfu/ml)。30°C 200 rpm條件下，用LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)XLl-Blue MRF’細(xì)胞50 ml ； IOOOg離心宿主細(xì)胞10分鐘；用25 ml 10 mMMgSO4重懸細(xì)胞，測定600納米可見光下菌液吸光度，然后用10 mM MgSO4將菌液稀釋至濃度為OD6tltl = 0. 5 ;將含有大約5 X IO4 pfu噬菌體顆粒的懸濁液與600 U I濃度為OD6tltl =
0.5的XLl-Blue MRF’細(xì)胞混合，置于Falcon2059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15分鐘，使噬菌體充分附著在宿主菌表面；將混合液加入約48°C的6. 5 ml液態(tài)NZY上層培養(yǎng)基中，混勻后倒入新鮮的150 mm NZY瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，靜置平板十分鐘，倒轉(zhuǎn)平板置于37°C約8小時(shí)(噬菌斑直徑不超過2 mm);在每塊平板上倒入大約10 ml SM緩沖液(I升緩沖液中含有 5. 8 g NaCl, 2. 0 g MgSO4.7H20，50. 0 ml IM Tris-HC l [pH 7. 5]，5. 0 ml 2%[w/v]白明膠)，4°C放置過夜；將所有平板上的SM緩沖液回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用2ml SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入終濃度為5% (v/v)的氯仿，室溫下放置15分鐘，混勻，500 g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新聚丙烯管中，并重復(fù)步驟8、9至上清液澄清，加入終濃度為7% (v/v) DMS0，儲存于-80°C。測定擴(kuò)增文庫滴度(方法同前)。cDNA模板溶液中溶菌酶基因的確認(rèn)用Exassist Helper Phage和SOLR菌株(均購于Stratagene公司)從Uni-ZAPXR Vector上體外切割，pBluescript卩遼菌粒進(jìn)行體外切割；然后質(zhì)粒cDNA的大規(guī)模提取和測序分析獲得目的EST序列，對上述EST測序結(jié)果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根據(jù)相似性分析結(jié)果尋找出如序列表SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的溶菌酶基因片段。 四、對上述含溶菌酶基因的cDNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增的正向引物序列5' - TTACTTGTCTTGGTACTTGTG - 3'，反向引物的核苷酸序列為5' -TTTGTATGCTATTTTATTTTG - 3', PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，與pMD18_T載體連接獲得克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，得到溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒；3'端PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR buffer 2.5ii 1、25 mM 的 MgCl2 I. 0 y 1、2. 5 mM 的 dNTP 2. 0 u 1,10 U M 的正向引物 I y I、IOy M 的通用引物 T7 I ii I、濃度為 5 U/ ii I 的 Taq DNA polymerase 0. 2 U I, cDNA 模板(文庫)
Iyl，用PCR水定容到25 u I ;反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCRbuffer 溶液 2.5 U 1,25 mM 的 MgCl2 溶液 I. 0 u 1,2. 5 mM 的 dNTP 溶液 2.0 u 1,10 u M的反向引物溶液1.0 u IUO PM的通用引物T3溶液I Pi、濃度為I U/ill的Taq DNApolymerase 0. 2 yl，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 U I,反應(yīng)在ABIVeritiTMPCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘；
五、對C型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)正向引物為含有Afco I酶切位點(diǎn)的核苷酸序列5' - CCATGGCTACAAAMCGAAGTGCCA -3'，反向引物為含ZAo I酶切位點(diǎn)和 6 個 His 純化標(biāo)簽的核苷酸序列 5'- CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACATGTGCTGTAATCGT -3' ;將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入PMD18-T載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性亞克隆質(zhì)粒，提取陽性亞克隆質(zhì)粒，用Afco I和ZAo I (均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質(zhì)粒；用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，并將該片段導(dǎo)入經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET_21a (+)(購于Novagen公司)，構(gòu)建C型溶菌酶基因的表達(dá)質(zhì)粒；測序該C型溶菌酶的表達(dá)質(zhì)粒確認(rèn)；
六、將上述的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3) plysS中，篩選陽性克隆并經(jīng)測序確認(rèn)，挑取陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，220 rpm，37°C培養(yǎng)至0D_=0. 5-0. 7，加入IPTG使終濃度達(dá)到 0. 6 mM，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，4°C，8000 rpm離心10分鐘，收集菌液；
七、對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進(jìn)行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化；最后對重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發(fā)明的紫貽貝C型溶菌酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示。具體方法為在收集的菌體沉淀中，加入適量的菌體裂解液(0. 5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl,0. 5% Triton X-IOO pH
8.5)重懸沉淀，超聲波處理?xiàng)l件為300 W，處理200次，每次5秒，間隔10秒；菌體裂解液在41下100，00 rpm離心20分鐘收集包涵體；包涵體沉淀分別用洗液I (0.5 M NaCl,10 mM Tris-HCl,0. 5% Triton X-100,2 M 尿素 pH 8.5 )和洗液 II (0.5 M NaCl, 10 mMTris-HCl,0. 5% Triton X-100，2% 脫氧膽酸鈉 pH 8. 5)洗滌一次，用 8 M 尿素溶液(20 mMPBS,0. 5 M NaCl,8 M尿素，20 mM咪唑pH 7. 4)溶解；經(jīng)鎳柱親和層析純化后的重組蛋白采用逐漸降低尿素濃度的方法進(jìn)行透析復(fù)性，透析緩沖液成分如下100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，I mM EDTA, 2 mM還原型谷胱甘肽，0.02 mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，1%甘氨酸，尿素(6 M，4 M，3 M，2 M，0 M)，pH 9.0。透析緩沖液依次降低尿素的濃度，每次于4°C透析12小時(shí)，最后在TBS緩沖液(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl,pH 9.0)中透析兩次。重組蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物公司)。具體操作依試劑盒說明書進(jìn)行根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加I體積BCA試劑B (50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 ill用PBS稀釋至100 u 1，使終濃度為0. 5mg/ml ;將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,8,12，16，20 U I加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，用PBS溶液補(bǔ)足到20 ill ;加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中并用PBS補(bǔ)足到20 u I ;各孔加入200U I BCA工作液，37°C放置30分鐘；測定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。應(yīng)用例
將紫貽貝C型溶菌酶加入試管中制成濃度為0. 42 mg/mL作用液，分別接種產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌以及鰻弧菌各5 u 1，使每管最終菌液濃度約為5X IO5 CFU/ml，培養(yǎng)24小時(shí)后，利用酶標(biāo)儀測定600 nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表I所示的結(jié)果。表I :紫貽貝C型溶菌酶的抗菌譜
硬i式菌株|MIC值(UM)~
備黃色葡萄球f 6. 95-13. 89 gl微球菌I. 74-3. 47 —
^!弧菌3. 47-6. 95
惡頁假單胞菌 I. 74-3. 47 —
奇異變形桿菌 1 47-6.95 '
尹氣腸桿菌 |3. 47-6. 95
從表I中可以看出，紫貽貝C型溶菌酶對上述革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑制活性，說明本發(fā)明的紫貽貝C型溶菌酶具有廣譜抗菌活性，且效果較好。其中產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌、藤黃微球菌以及金黃色葡萄球菌37°C培養(yǎng)；惡臭假單胞菌以及鰻弧菌28°C培養(yǎng)；具體步驟調(diào)節(jié)各菌至OD6tltl為I后，稀釋1000倍備用；在96孔板中每孔中加入100Ul LB液體培養(yǎng)基，再在每一行第一個孔中加入100 Ul C型溶菌酶，混勻后從第一個孔中吸出100 U I加到第二個孔中，混勻后吸出100 U I加到第三個孔中，依此類推,第10個 孔中吸出的100 u I不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接種稀釋好的相應(yīng)菌種5 u I,第12孔為只含培養(yǎng)基的對照。培養(yǎng)24h以上，測定吸光值并計(jì)算相應(yīng)的MIC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫貽貝C型溶菌酶對各供試菌株均表現(xiàn)出一定的抑制作用，其中對藤黃微球菌和惡臭假單胞菌的抑制效果最為顯著，最小抑菌濃度均為I. 74-3. 47 u moL/L。
權(quán)利要求
1.紫貽貝C型溶菌酶，其特征在于該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述的紫貽貝C型溶菌酶，其特征在于表達(dá)所述的紫貽貝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.權(quán)利要求I所述的紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，其特征在于其步驟如下 1)紫貽貝總RNA的提取用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于-80 °C備用； 2)紫貽貝mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ； 3)紫貽貝cDNA模板制備用cDNASynthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于100 bp的酶切片段進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質(zhì)粒，用ZAP-cDNAGigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜，得到含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ； 4)基因克隆對上述含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的引物如下正向引物序列TTACTTGTCT TGGTACTTGT G，反向引物序列TTTGTATGCT ATTTTATTTTG，3’端PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR buffer 2.5 U 1,25 mM的MgCl2溶液1.0 iil、2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 u IUO U M的上述正向引物溶液I iU、10 y M的通用引物17溶液I ii I、濃度為5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U 1，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 u 1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5 u 1,25 mM的MgCl2溶液1.0iil、2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 yl、10 y M的上述反向引物溶液I ylUOiiM的通用引物T3溶液I ii I、濃度為5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U I,所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25 u 1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性45秒，60 V退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化，與PMD18-T載體連接得到克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，得到C型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒； 5)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以上述C型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)的正向引物為含有Afco I酶切位點(diǎn)的核苷酸序列CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA,反向引物為含通0 I酶切位點(diǎn)和6個His純化標(biāo)簽的核苷酸序列CTCGAGTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT ;將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入pMD18_T載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性亞克隆質(zhì)粒，提取陽性亞克隆質(zhì)粒，用Afco I和ZAo I雙酶切亞克隆質(zhì)粒；用膠回收純化試劑盒對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收,并將該片段導(dǎo)入經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-21a (+)中，構(gòu)建得到C型溶菌酶的表達(dá)質(zhì)粒； 6)表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)將上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3) plysS，篩選陽性克隆并經(jīng)測序確認(rèn)，將陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至0D_=0. 5-0. 7，加入異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷，使其終濃度達(dá)到0. 6 mM,繼續(xù)培養(yǎng)5 h，然后8000rpm離心10分鐘收集菌體；7)蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進(jìn)行洗滌和溶解，然后采用鎳柱親和層析純化，最后對純化產(chǎn)物進(jìn)行透析、復(fù)性得到氨基酸序列如序列表SEQID NO. I所示的紫貽貝C型溶菌酶
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫貽貝C型溶菌酶及制備方法，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，該紫貽貝C型溶菌酶的制備方法是通過對紫貽貝總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)和蛋白純化步驟得到該C型溶菌酶；該紫貽貝C型溶菌酶是一種新的C型溶菌酶，對多種革蘭氏陽性和陰性微生物具有較強(qiáng)的抑制活性，具有開發(fā)為食品保鮮劑和飼料添加劑等方面的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12R1/19GK102643787SQ20121010010
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者宋微微, 李榮華, 母昌考, 王春琳, 王春艷 申請人:寧波大學(xué)