專利名稱：一種同時(shí)鑒別食品中四種肉類成分的多重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用通用引物多重PCR法對(duì)食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的同時(shí)快速檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
二.
背景技術(shù)：
肉和肉制品摻雜摻假是我國食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)之一。不法企業(yè)在利益的驅(qū)使下使用相對(duì)廉價(jià)的豬肉、雞肉等肉類原料，冒充牛肉、羊肉制品進(jìn)行銷售，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益?！芭Ｈ飧唷笔录钠毓馐沟萌忸悡郊龠M(jìn)一步成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)的依靠感官與經(jīng)驗(yàn)的肉類形態(tài)學(xué)鑒別手段已遠(yuǎn)不能滿足對(duì)肉制品摻假現(xiàn)象進(jìn)行控制與監(jiān)管的需要，因此，對(duì)于我國肉制品市場(chǎng)占有率較高的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉，建立科學(xué)、準(zhǔn)確快速高通量篩選方法已十分必要。以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)已逐步成為了食品中肉類種屬鑒定的核心方法。許多學(xué)者根據(jù)不同物種基因序列的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，繼而通過電泳檢測(cè)鑒別食品中可能的物種來源。近年來， 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使得肉類含量的定量溯源成為可能。在目標(biāo)基因選擇方面，動(dòng)物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，且由于拷貝數(shù)多而在食品加工過程不完全降解，因此其多態(tài)性位點(diǎn)是設(shè)計(jì)肉類成分定性檢測(cè)的首選靶點(diǎn)。目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計(jì)物種特異性引物，所建立的PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR方法已見大量報(bào)道，且進(jìn)入了國內(nèi)權(quán)威的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)際檢測(cè)中，尤其需要對(duì)大量的食品樣本進(jìn)行肉類摻假的篩選時(shí)，提高檢測(cè)效率與通量對(duì)于及時(shí)監(jiān)管十分重要。以多重PCR為基礎(chǔ)，建立多種肉類成分同時(shí)鑒別的快速檢測(cè)技術(shù)是提高效率的有效途徑之一。然而目前，針對(duì)我國肉類摻假現(xiàn)狀，應(yīng)用多重PCR的肉類快速同時(shí)鑒別與篩選技術(shù)尚未見報(bào)道。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是根據(jù)動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點(diǎn)，利用正向引物共用、反向引物特異的策略，建立用于豬、牛、羊、雞4種肉類DNA快速檢測(cè)的通用引物多重PCR體系，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小對(duì)物種加以鑒別，可在同一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)4種肉類成分的同時(shí)檢測(cè)。首先，通過對(duì)多種常用動(dòng)物基因組DNA提取方法的比較選擇高效穩(wěn)定的肉制品中總DNA提取方法；然后，基于動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b基因的特異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)多重PCR引物；接著，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)方法優(yōu)化及特異性、靈敏度考察；最后，應(yīng)用此方法對(duì)80份食品盲樣進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證其實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明中，基于動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)5條長(zhǎng)度不同的通用引物多重PCR引物，其中雞、牛、羊、豬的產(chǎn)物片段分別為216bp、263bp、320bp和387bp，建立并優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量差異實(shí)現(xiàn)4種肉類的快速鑒別。本發(fā)明的技術(shù)方案包括1.分別使用DNeasy組織細(xì)胞DNA提取試劑盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中的總DNA，產(chǎn)物測(cè)定于260nm 和280nm處的吸光度值，計(jì)算DNA濃度和純度，比較提取效率和純度，確定提取肉類中總DNA 的方法。2.設(shè)計(jì)并合成多重PCR的引物。3.多重PCR檢測(cè)反應(yīng)條件及優(yōu)化。4.針對(duì)提取的動(dòng)物基因組總DNA進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，考察方法的特異性與靈敏度。5.對(duì)大量食品樣品進(jìn)行盲樣檢測(cè)。I.分別使用DNeasy試劑盒、經(jīng)典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取豬、 牛、羊、雞4種肉類的總DNA。表I列出了應(yīng)用3種方法對(duì)生鮮肉提取的結(jié)果。SDS-蛋白酶 K法與DNeasy試劑盒法所提取的DNA濃度處于同一個(gè)數(shù)量級(jí)，SDS-蛋白酶K法在濃度與純度方面均略優(yōu)。CTAB-蛋白酶K法由于對(duì)肌肉組織消化效果較差，因此DNA提取效率顯著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法，DNeasy試劑盒大大節(jié)省了提取時(shí)間，且無需使用苯酚、氯仿等有毒試劑，綜合考慮提取速度與效率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用DNeasy試劑盒提取食品中的總 DNA。表I 3種DNA提取方法的比較Table I Comparison of three DNA extraction methods
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)快速鑒別食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的通用引物多重PCR方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成(1)使用DNeasy組織細(xì)胞DNA提取試劑盒提取基因組總DNA；(2)基于動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點(diǎn)，采用正向引物共用、反向特異性引物的策略設(shè)計(jì)5條通用引物多重PCR引物，建立并優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量差異實(shí)現(xiàn)4種肉類的快速同時(shí)鑒別，多重PCR的反應(yīng)體系為PCR反應(yīng) 50 μ L 體系反應(yīng)緩沖液(10Χ ) 5μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4μ L, MgCl2 (2. 5mmol/L) 3μ L, Taq酶0.5 μ L，正向引物與4條反向引物(10 μ mol/L)各I μ L，模板2 μ L，反應(yīng)條件為 940C 3min，30 個(gè)循環(huán)的 94°C >30s, 52°C >30s, 72°C >45s, 72°C >7min0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述同時(shí)快速鑒別食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的通用引物多重PCR方法，其特征在于正向引物序列為5’-CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3’，反向特異性引物序列分別為雞 5’-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3’，牛 5’-CTAGAAAAGTGTAAGACC CGTAATATAA-3，，羊 5，-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-3，，豬 5，-GCTGATAGTAGATTTGTGATG ACCGTA-3’，雞、牛、羊、豬的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別為216bp、263bp、320bp和387bp。
3.權(quán)利要求I所述的同時(shí)快速檢測(cè)食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的通用引物多重 PCR方法在食品質(zhì)量控制和質(zhì)量安全檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及通過動(dòng)物基因組DNA提取、引物設(shè)計(jì)和通用引物多重PCR方法(Universalprimers-multiplexPCR，UP-M-PCR)對(duì)食品中豬、牛、羊、雞4種肉類成分進(jìn)行同時(shí)快速檢測(cè)。根據(jù)動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點(diǎn)，利用正向引物共用、反向引物特異的策略，應(yīng)用包含5條引物的通用引物多重PCR體系實(shí)現(xiàn)4種肉類成分的同時(shí)快速鑒別，結(jié)果表明，以上方法具有良好的針對(duì)該四種目標(biāo)肉類成分的特異性，檢出限可達(dá)到皮克級(jí)，且反應(yīng)體系各組分未見交叉干擾。對(duì)市場(chǎng)上肉制品隨機(jī)抽取80份食品樣檢測(cè)驗(yàn)證鑒別方法的準(zhǔn)確性?？傊?，本發(fā)明建立了特異、靈敏、實(shí)用的食品中4種常見肉類成分快速篩選的多重PCR方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605090SQ20121009965
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者何瑋玲, 周駿貴, 張馳, 楊軍 申請(qǐng)人:南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院