專利名稱：一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于大豆多肽提取加工領(lǐng)域，主要涉及一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法。
背景技術(shù)：
大豆肽具有良好的溶解性，在高濃度下黏度低，對熱穩(wěn)定，在酸性條件下不產(chǎn)生沉淀，具有良好的吸濕性與保濕性，具有促進(jìn)微生物生長代謝等特點(diǎn)，因此可用于生產(chǎn)酸性飲料、營養(yǎng)飲品、高蛋白食品、焙烤食品中，具有軟化食品、改善風(fēng)味、提高產(chǎn)品品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。采用蛋白酶直接在體外進(jìn)行酶解反應(yīng)制備肽產(chǎn)品是常用的制肽方法。優(yōu)點(diǎn)主要是其最佳的溫度和pH溫和，反應(yīng)時間及反應(yīng)程度容易控制，可有效的控制酶解速度，可有效的分裂產(chǎn)生特定的肽。20世紀(jì)80年代后，隨著發(fā)酵工業(yè)和基因工程的迅猛發(fā)展，酶的制取和提純工藝日趨成熟，酶的產(chǎn)量和活性也大幅提高，生產(chǎn)成本也急劇降低，此外酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)的活性肽安全性極高，受到了科研工作者得廣泛關(guān)注，因此近幾年報道的活性肽的制備方法多是酶解法。但是應(yīng)用蛋白酶直接水解存在不能回收和成本高等缺陷因而在工業(yè)上的應(yīng)用受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，達(dá)到酶制劑可重復(fù)回收利用、降低成本、酶解過程連續(xù)、不需進(jìn)行滅酶處理、實(shí)現(xiàn)連續(xù)化的生產(chǎn)的目的。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，所述的方法包括以下步驟(I)將海藻酸鈉溶液與堿性蛋白酶經(jīng)磁力攪拌Ih混勻后，逐滴滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，所述的海藻酸鈉按重量百分比計，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 9-3.3%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 8-3.2% ； (2)將海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶放入填充床反應(yīng)器中，所述的填充床反應(yīng)器的填充柱的內(nèi)徑為I. 5cm，柱高30cm;(3)利用蠕動泵將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應(yīng)器進(jìn)行酶解，所述的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %，PH為9-10，酶解溫度40-60°C，蠕動泵流量500-900ml/h ； (4)將酶解液離心，取上清液凍干，得到大豆多肽。本發(fā)明方法利用固定化酶與生物反應(yīng)器相結(jié)合的方法酶解大豆分離蛋白，不僅保留了蛋白酶原有的優(yōu)點(diǎn)，而且可反復(fù)使用，易與反應(yīng)液分離，避免雜質(zhì)混入并具有延長酶的使用期和保管期，具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、產(chǎn)物性能佳、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，同時可獲得高質(zhì)量的大豆肽。


圖I 一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法工藝路線圖；圖2海藻酸鈉濃度對酶活力回收率的影響；
圖3 pH對酶活力回收率的影響；圖4 CaCl2濃度對酶活力回收率的影響；圖5游離酶添加量對固定化酶活力和回收率的影響；圖6固定化時間對酶活力回收率的影響；圖7各影響因素對固定化酶活力回收率的降維分析；圖8 Y = f (X1, X2)的響應(yīng)面； 圖9 Y = f (X1, X4)的響應(yīng)面；圖10 Y = f (X1, X5)的響應(yīng)面；圖11 Y = f (x3, X4)的響應(yīng)面；圖12 pH對大豆分離蛋白水解度的影響；圖13水解溫度對大豆分離蛋白水解度的影響；圖14底物流速對大豆分離蛋白水解度的影響；圖15水解時間對大豆分離蛋白水解度的影響；圖16 Y = f (X1, X2)的響應(yīng)面圖17 Y = f (X1, X3)的響應(yīng)面；圖18 Y = f (x2, X3)的響應(yīng)面；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，所述的方法包括以下步驟(1)將海藻酸鈉溶液與堿性蛋白酶經(jīng)磁力攪拌Ih混勻后，逐滴滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，所述的海藻酸鈉按重量百分比計，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 9-3.3%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 8-3.2% ；(2)將海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶放入填充床反應(yīng)器中，所述的填充床反應(yīng)器的填充柱的內(nèi)徑為I. 5cm，柱高30cm ； (3)利用蠕動泵將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應(yīng)器進(jìn)行酶解，所述的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %，PH為9-10，酶解溫度40-60°C，蠕動泵流量500-900ml/h ; (4)將酶解液離心，取上清液凍干，得到大豆多肽。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為3.1%。氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為3.0%。大豆分離蛋白溶液pH優(yōu)選為9. 52，酶解溫度優(yōu)選為50. 5 °C。螺動泵流量優(yōu)選為730mL/h。實(shí)驗(yàn)例I大豆蛋白酶解工藝條件最佳參數(shù)的篩選實(shí)驗(yàn)I材料與方法I. I材料、試劑大豆分離蛋白哈高科protex 6L喊性蛋白酶丹麥novo公司I. 2主要儀器設(shè)備pHS-25型酸度計上海偉業(yè)儀器廠
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電熱恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠I. 3實(shí)驗(yàn)方法I. 3. I固定化堿性蛋白酶的制備稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉于一定pH的硼酸緩沖溶液中，配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液。量取一定量的protex 6L堿性蛋白酶,并用硼酸緩沖液稀釋。將一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液按一定比例與protex 6L混合,充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?用螺動泵將混合液以5cm高度注入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CaCl2中形成凝膠珠，放入4°C冰箱中進(jìn)一步硬化一段時間。得到顆粒均勻、形狀規(guī)整的海藻酸鈉微球。用無菌生理鹽水洗滌3 5次，以洗去表面CaCl20取出抽濾，并用濾紙吸干，稱總重％，同時測其酶活，剩余的于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩. 3. 2單因素試驗(yàn)設(shè)計以固定化酶酶活力回收率為評價指標(biāo)，研究不同海藻酸鈉濃度，pH, CaCl2濃度，游離酶添加量，固定化時間對固定化酶效果的影響。I. 3. 3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以固定化酶活力回收率為指標(biāo)，利用SAS軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計，因素水平表見表I。表I響應(yīng)面設(shè)計因素水平編碼表
權(quán)利要求
1.一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟(1)將海藻酸鈉溶液與堿性蛋白酶經(jīng)磁力攪拌Ih混勻后，逐滴滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，所述的海藻酸鈉按重量百分比計，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 9-3.3%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 8-3.2% ； (2)將海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶放入填充床反應(yīng)器中，所述的填充床反應(yīng)器的填充柱的內(nèi)徑為I. 5cm，柱高30cm ; (3)利用蠕動泵將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應(yīng)器進(jìn)行酶解，所述的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，PH為9-10，酶解溫度40-60°C，蠕動泵流量500-900ml/h ； (4)將酶解液離心，取上清液凍干，得到大豆多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為3. 1%。
3.按照權(quán)利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為3.0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于大豆分離蛋白溶液PH優(yōu)選為9. 52，酶解溫度優(yōu)選為50. 50C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于蠕動泵流量優(yōu)選為730mL/h。
全文摘要
一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法屬于大豆多肽提取技術(shù)；該方法將自制的固定化堿性蛋白酶加入到填充床反應(yīng)器中，將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應(yīng)器進(jìn)行酶解，經(jīng)柱層析分離，凍干，得到大豆肽產(chǎn)品；本發(fā)明方法利用固定化酶與生物反應(yīng)器相結(jié)合的方法酶解大豆分離蛋白，酶解過程連續(xù)，不需進(jìn)行滅酶處理，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)化的生產(chǎn)，具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、產(chǎn)物性能佳、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，且固定化酶可重復(fù)利用，同時可獲得高質(zhì)量的大豆肽。
文檔編號A23J3/34GK102613387SQ20121009704
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者李楊, 江連洲, 王梅, 王勝男, 齊寶坤 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)