專利名稱：一種診斷急性髓細胞白血病的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及ー種定量RT-PCR檢測試劑盒，具體涉及ー種實時熒光定量RT-PCR檢測人糖基轉移酶，Lc3合成酶3 3Gn-T5的試劑盒，是ー種通過逆轉錄(RT)mRNA樣品得到cDNA，再結合實時熒光定量PCR檢測技術，精確定量檢測標本中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA表達量的試劑盒。
背景技術：
腫瘤(Tumor)是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的新生物。一般認為，腫瘤細胞 是單克隆性的，即ー個腫瘤中的所有瘤細胞均是ー個突變的細胞的后代。一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。所有的惡性腫瘤總稱為癌癥(cancer)。目前腫瘤的發(fā)生率與死亡率居高不下，并且有愈演愈烈的趨勢，已經(jīng)成為威脅我國及世界人民健康的一大類疾病。對于腫瘤的治療一直是大家研究的熱點，但是就目前的情況來看，惡性腫瘤的治愈還有很大的難度，然而如果能對腫瘤患者進行早期的診斷，對進一歩制定治療方案有非常重要的意義，是提高腫瘤治愈率的重要途徑之一。而腫瘤的早期診斷有賴于腫瘤特異性標記的發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性標記是目前腫瘤領域的研究熱點之一，腫瘤相關的蛋白有80%是糖蛋白，多種糖脂亦與腫瘤密切相關，所以控制糖脂的糖基轉移酶也受到關注。急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是ー種異質性髓細胞腫瘤，也稱急性非淋巴細胞性白血病，常進展迅速，其特點是由造血干細胞惡變而形成的原始細胞克隆取代了正常骨髄造血。由于白血病細胞代替了正常血細胞，它們不具備正常血細胞的功能，由此導致貧血，血小板和粒細胞減少而引發(fā)一系列并發(fā)癥。若不經(jīng)過治療，存活期一般不超過半年。有的病例從診斷到死亡，甚至不過一周，死亡的主要原因是出血和感染。目前標準化療可以獲得約70 80%的完全緩解(Complete Remission，CR)率，但大部分CR后的患者終將復發(fā)，甚至一部分患者難以達到CR而成為難治性白血病，治療無效而死亡。分子生物學從分子水平研究生物大分子的結構與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質，近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展及其在醫(yī)學領域的廣泛應用，通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)在臨床組織樣本中進行腫瘤特異性標記的檢測已成為可能并被嘗試。RT-PCR比傳統(tǒng)的檢測方法具有較高的靈敏度及特異性，能夠在復雜的生物樣本中檢測到極其微量的腫瘤特異性標記物，對于腫瘤的早期診斷以及長期的預后具有十分重要的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種診斷急性髓細胞白血病的試劑盒，提高檢測的特異性、靈敏度和準確率。為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種診斷急性髓細胞白血病的試劑盒，包括逆轉錄體系和PCR擴增體系；所述逆轉錄體系包括T重復寡核苷酸OlogodT、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述PCR擴增體系包括SYBRGreen聚合酶鏈反應體系、引物對；
其中，所述逆轉錄反應液含有焦炭酸ニこ酯處理的水、M-MLV逆轉錄酶緩沖液；
所述SYBR Green聚合酶鏈反應體系含有PCR緩沖液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green熒光染料；所述模板cDNA包括正常人骨髓樣本cDNA和急性髓細胞白血病患者骨髓樣本cDNA，其中，正常人骨髓樣本cDNA作為陰性對照，急性髓細胞白血病患者骨髓樣本cDNA作為陽性對照；
所述引物對為可擴增人Lc3合成酶P 3Gn-T5和人P -actin的引物對，本領域技術人員可以根據(jù)引物設計的常規(guī)技術設計；優(yōu)選的技術方案中，所述引物對由上游引物和下游引物組成，其中上游引物具有SEQ ID No. I所示序列5' -ttttggattggtcgtgttcat-3';下游引物具有 SEQ ID No. 2 所示序列5' -cggctgtgtagtcagggtaag-31 ;人 P-actin 上游 引物具有 SEQ ID No. 3 所示序列5' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3';下游引物具有 SEQID No. 4 所示序列5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'。上述技術方案中，所述焦炭酸ニこ酯處理的水的制備方法為將焦炭酸ニこ酯原液與超純水按照體積I : 1000稀釋，攪拌12 24小時，取該混合均勻的溶液進行高壓濕熱滅菌即制得焦炭酸ニこ酯處理的水。上述技術方案中，所述M-MLV逆轉錄酶緩沖液包括250mM PH8. 3的Tris-HCl，375mM 的 KCl，15mM 的 MgCl2，50mM 的 DTT。上述技術方案中，所述RNA酶抑制劑可選用本領域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為E. coli表達的非競爭性抑制RNase的重組蛋白酶。上述技術方案中，所述PCR緩沖液為本領域技術人員公知的現(xiàn)有技術，優(yōu)選的技術方案中，所述PCR緩沖液包括25mM的KCl，終濃度2. 5mM的MgCl2, 200mM的(NH4)2S04。上述試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。上述試劑盒的使用方法包括以下步驟
(1)逆轉錄配置逆轉錄反應體系，每20y L的逆轉錄反應體系包括10 y L的待測樣品的RNAUiiL的Ologo dT共浴70°C 10分鐘，取出立即置于冰上2分鐘，再加入2iiL的dNTPs、liiL的RNA酶抑制劑、5 ii L的逆轉錄反應液及Iii L的M-MLV逆轉錄酶，共浴420C 60分鐘，然后700C 10分鐘，得到cDNA，4°C保存；
(2)在熒光定量PCR儀上進行擴增檢測配置PCR擴增反應體系，每25yL的PCR擴增反應體系包括SYBR Green聚合酶鏈反應體系12. 5 u L,上下游引物各0. 25 u L，cDNA2 u L，DEPC水10 ii L ;反應條件為50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，95°C 15秒、60°C 60秒共40個循環(huán)；得到待測樣品的熒光定量PCR擴增結果；
(3)采用步驟(2)的方法對試劑盒中的模板cDNA進行熒光定量PCR擴增，得到陽性對照和陰性對照的熒光定量PCR擴增結果；然后分析上述待測樣品、陽性對照、陰性對照的熒光定量PCR擴增結果的Ct值(P 3Gn-T5)和Ct值(P -actin)，通過公式^ 3Gn_T5的mRNA相對水平=計算得到待測樣品、陽性對照、陰性對照的P 3Gn-T5的mRNA相對水平，以待測樣品的P 3Gn-T5的mRNA相對水平值和陽性對照、陰性對照的P 3Gn_T5的mRNA相對水平相比，即可判斷待測樣品是否取自AML患者。
上述技術方案中，DEPC水溶液是ー種g在通過焦碳酸ニこ酯(DEPC)處理，以徹底清除RNA酶的無離子水溶液；?；瘎━摔郴固妓狨?diethylprocarbonate,DEPC),是RNA酶的化學修飾劑，和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性，還可滅活其它各種蛋白質。本發(fā)明的主要原理是Lc3合成酶P 3Gn-T5是控制鞘糖脂合成的關鍵的糖基轉移酶，是與AML相關的特異性較高的腫瘤特異性標記。在AML患者骨髓組織中檢測出Lc3合成酶P 3Gn-T5的高表達，可以對AML的診斷及治療提供有力證據(jù)。通過RT-PCR進行微量腫瘤特異性標記的檢測，可以較準確地進行定量，相比傳統(tǒng)方法具有較高的靈敏度。由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點
I.本發(fā)明建立了利用SYBR Green技術檢測Lc3合成酶P 3Gn_T5的表達的方法，并提供一種可以方便準確靈敏地診斷急性髓細胞白血病的試劑盒。2.由于本方法采用了 PCR擴增技術，使得表達的檢測敏感度大大提高，而且由于熒光染料的應用，使其特異性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率，使得檢測人員可以在極少的標本中獲得足夠的信息。3.本發(fā)明中設計的引物以及檢測結果，可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發(fā)提供可靠的依據(jù)。


圖I為實施例中正常人的骨髓樣本中提取RNA同樣經(jīng)過逆轉錄和PCR擴增曲線； 圖2為實施例中正常人骨髓樣本與AML病人骨髓樣本中Lc3合成酶P 3Gn-T5表達對比圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進ー步描述
實施例一診斷人AML發(fā)生的熒光RT-PCR方法
(I)材料
Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，Ologo dT、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、SYBR Green聚合酶鏈反應體系、PCR緩沖液均購自美國Fermentas公司，ABI 7500熒光定量系統(tǒng)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。(2)引物設計與合成
以全長cDNA序列為模板，使用Prime5軟件分析引物位點，并根據(jù)同時考慮基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。檢測人Lc3合成酶@ 3Gn-T5用上游引物序列為
5' -ttttggattggtcgtgttcat-3 ';檢測人 Lc3 合成酶 P 3Gn_T5 用下游引物序列為5 ' -cggctgtgtagtcagggtaag-3 1 ;檢測人P-actin用上游引物序列為 5 ' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3 ';檢測人 P-actin 用下游引物序列為5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'，均由上海生エ公司合成。(3)標本檢測
從12例AML患者骨髓樣本和6例正常人骨髓樣本提取總RNA，經(jīng)逆轉錄總體積20 u L，、其中IOuLRNA與IuL Ologo dT共浴70°C 10分鐘，取出馬上置于冰上2分鐘，再加入2 u LdNTPsUuL RNA酶抑制劑、5uL逆轉錄反應液及IuL M-MLV逆轉錄酶，共浴42 °C 60分鐘，然后70°C 10分鐘，4°C保存。在熒光定量PCR儀上進行，總體積25 u L，其中SYBR Green聚合酶鏈反應體系12. 5 u L，上下游引物各0. 25 u L，cDNA2 u L，DEPC水10 uし反應條件50°C 2分鐘，95。。10分鐘，95°C 15秒、60°C 60秒共40個循環(huán)。進行Real time PCR實驗，得到圖1，從圖I可
知實驗可靠，得到合格的擴增曲線。通過ABI 7500 System軟件導出Ct值，得到表1， 從表I可知P 3Gn_T5和^ -actin的Ct值，表中No. 1-6是正常對照，No. 7 18是AML患者。表I. P 3Gn_T5 和 & -actin 的 Ct 值
No. Jct 值(P 3Gn-T5) ICt 值(g -actin)
122.3114.81
222.9414. 14
322. 6014. 58
420. 9015. 32
521.1913.28
630. 0021. 25
728. 2020. 72
832. 6230. 27
927. 7023. 32
1026. 2022.05
1133.1425. 47
1228. 8727. 14
1328. 1824. 17
1427. 1024. 63
1534.1626. 75
1630. 1928. 15
1732.1927. 00
18[26. 04123. 15
將正常人和AML患者的Ct值結果進行分析，通過公式P 3Gn-T5的mRNA相對水平=，得到表2，表中No. 1-6是正常對照(平均值為0. 0065)，No. 7 18是AML患者(平均值為0. 1055)
表2. Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA相對水平
No.丨g3Gn-T5 INo. I》3Gn-T5 [No. [g3Gn-T5
10.0055 7 0.0056 13 0.0622
20.0022 8 0. 1953 14 0. 1801
30.0039 9 0.0481 15 0.0059
40.0209 10 0.0561 16 0.2426
50.0042 11 0.0049 17 0.0275
6jo. 0023 112 10. 3022 [18 Jp. 1353
從表2可知急性髓細胞白血病患者和正常對照中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA相對水平。對比正常人骨髓樣本與AML病人骨髓樣本中Lc3合成酶P 3Gn_T5表達結果，得到圖2，從圖2可知急性髓細胞白血病患者骨髓中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA水平高于正常對照。
權利要求
1.一種診斷急性髓細胞白血病的試劑盒，包括逆轉錄體系和PCR擴增體系；其特征在于，所述逆轉錄體系包括重復T寡核苷酸Ologo dT、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述PCR擴增體系包括SYBR Green聚合酶鏈反應體系、引物對； 其中，所述逆轉錄反應液含有焦炭酸ニこ酯處理的水、M-MLV逆轉錄酶緩沖液；所述SYBR Green聚合酶鏈反應體系含有PCR緩沖液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green熒光染料；所述引物對為可擴增人Lc3合成酶P 3Gn-T5和人P -actin的引物對。
2.根據(jù)權利要求I所述診斷急性髓細胞白血病的試劑盒，其特征在于，所述引物對由上游引物和下游引物組成，其中人Lc3合成酶P3Gn-T5上游引物具有SEQ IDNo. I 所示序列5' -ttttggattggtcgtgttcat-3 1 ;下游引物具有 SEQ ID No. 2 所示序列5 1 -cggctgtgtagtcagggtaag-3 1 ;人 P -actin 上游引物具有 SEQ ID No. 3 所示序列5 ' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3 ';下游引物具有 SEQ ID No. 4 所示序列5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'。
3.根據(jù)權利要求I所述診斷急性髓細胞白血病的試劑盒，其特征在于，所述模板cDNA包括正常人骨髓樣本cDNA和急性髓細胞白血病患者骨髓樣本cDNA，其中，正常人骨髓樣本cDNA作為陰性對照，急性髓細胞白血病患者骨髓樣本cDNA作為陽性對照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷急性髓細胞白血病的試劑盒，包括逆轉錄體系和PCR擴增體系；其特征在于，所述逆轉錄體系包括重復T寡核苷酸OlogodT、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs；所述PCR擴增體系包括SYBRGreen聚合酶鏈反應體系、引物對；其中，所述逆轉錄反應液含有焦炭酸二乙酯處理的水、M-MLV逆轉錄酶緩沖液；所述SYBRGreen聚合酶鏈反應體系含有PCR緩沖液、模板cDNA、dNTPs、SYBRGreen熒光染料；所述引物對為可擴增人Lc3合成酶β3Gn-T5和人β-actin的引物對。本發(fā)明建立了利用SYBRGreen技術檢測Lc3合成酶β3Gn-T5的表達的方法，并提供一種可以方便準確靈敏地診斷急性髓細胞白血病的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102643899SQ20121005845
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權日2012年3月7日
發(fā)明者李云森, 王征, 王艷萍 申請人:蘇州大學