專利名稱：一種可同時(shí)抑制t、b淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(autoimmunity diseases)是機(jī)體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答的疾病狀態(tài)，往往是由于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)而導(dǎo)致的一類疾病。自身免疫性疾病在人群中的發(fā)病率約為3% 5%。自身免疫疾病種類很多，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等一類疾病。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的兩種最為重要的功能細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)中扮演重要角色。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫， 二者既相互區(qū)別又相互聯(lián)系。T細(xì)胞激活時(shí)需要其細(xì)胞膜上的抗原識別受體(TCR)識別抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)溝槽中特異抗原肽，構(gòu)成T淋巴細(xì)胞免疫活化的第一信號。T淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞(APC)表面眾多的協(xié)同刺激分子 (costimulatory molecules)和相應(yīng)受體(costimulatory molecules receptor, CMR)構(gòu)成活化的第二刺激信號，例如CD4與MHC II類分子配對；CD8與MHC I類分子配對；CD28與 B7 (CD80)配對；LFA2(CD2)與LFA3 (CD58)配對；LFA1與ICAMl配對等均可作為第二信號， 其中以⑶28與B7(⑶80)相互作用在T淋巴細(xì)胞活化時(shí)最為重要。同樣地，B淋巴細(xì)胞對胸腺依賴抗原(TDAg)的刺激反應(yīng)中需要與T淋巴細(xì)胞相互作用，B淋巴細(xì)胞才能活化。首先 B淋巴細(xì)胞通過胞膜上的抗原識別受體(BCR)與抗原結(jié)合，抗原內(nèi)化后，經(jīng)胞內(nèi)溶酶體等加工處理成順序決定簇抗原，順序決定簇抗原與MHC II類分子結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞膜表面，B淋巴細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞(APC)將抗原遞呈給輔助性T淋巴(T h)細(xì)胞，Th細(xì)胞活化并表達(dá)膜分子和分泌多種淋巴因子(IL-2，IL-4，IL-6等)，在這些分子作用下B淋巴細(xì)胞表達(dá)高親和力的BCR和豐富的MHCII類分子。在B淋巴細(xì)胞活化中⑶40分子與⑶40L的結(jié)合， B淋巴細(xì)胞活化因子(BlyS)分別與其三種受體即B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物 (TACI)和B細(xì)胞活化因子受體(BAFF-R)的結(jié)合，為B細(xì)胞活化的第二刺激信號。綜上所述，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化中共刺激信號(第二刺激信號)扮演著重要的角色，沒有共刺激信號T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞將不能活化。鑒于自身免疫性疾病往往是由于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞過度活化，功能亢進(jìn)而導(dǎo)致的一類疾病。所以，阻斷T 淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化共刺激信號可以降低免疫反應(yīng)，達(dá)到治療自身免疫性疾病的目的，是目前治療自身免疫性疾病的措施之一。下表是全球已上市和在研臨床III期以上阻斷共刺激信號抗體類藥物的品種列表。表I上市和在研臨床III期以上阻斷共刺激信號抗體類藥物的品種列表序號尚品名英文名研發(fā)公司類型作用靶點(diǎn)適應(yīng)癥上市國家及時(shí)間IAmevivealefaceptAstellasLFA3/IgGl 融合蛋白CD2銀屑病2003 年美國2OrenciaabataceptBMSCTLA4/IgGl 融合蛋白CD28類風(fēng)濕2006 美國3BenlystabelimumabHuman Genome Sciences人源抗體B淋巴細(xì)胞活化因子(BlyS)系統(tǒng)性紅斑狼瘡2011 年美國4YervoyipilimumabMedarex人源抗體CTLA4黑色素瘤、前列腺癌2011 年美國5NulojixbelataceptBMSCTLA4/IgGl 融合蛋白(局親和)CD28抗移植排斥2011 年美國6ataciceptZymoGeneti CSTACI/ IgGl 融合蛋白B淋巴細(xì)胞活化因子(BlyS)狼瘡腎炎，紅斑狼瘡Phase III表中alefacept、abatacept、belatacept 和 atacicept 的結(jié)構(gòu)均為受體-Fe 融合蛋白。該類結(jié)構(gòu)已經(jīng)被證實(shí)是除了抗體藥物以外，能清除體內(nèi)多余配體分子的一種有效手段。目前上市的有 etanercept (1998)、alefacept (2003)、abatacept (2006)、 riIonacept (2008)和belatacept (2011)均為此結(jié)構(gòu)，其中不乏“重磅炸彈”級藥物， etanercept在2009年和2010年全球銷售額達(dá)80億和84億美元。受體-Fe融合蛋白中受體結(jié)構(gòu)域在融合蛋白中執(zhí)行結(jié)合配體的功能，而Fe部分(包括輕鏈恒定區(qū))具有多種作用易檢測，可使用通用的抗人二抗進(jìn)ELISA檢測；易純化，通過與protein A的結(jié)合而使用親和層析方便地純化；增加半衰期，IgG重鏈恒定區(qū)約有氨基酸殘基330個(gè)，輕鏈恒定區(qū)約有氨基酸殘基110個(gè)，組合成4肽鏈后分子量超過IOOkDa,大大延長藥物在體內(nèi)的半衰期； 可提供額外的生物學(xué)效應(yīng)如補(bǔ)體激活、ADCC效應(yīng)等免疫調(diào)節(jié)活性。此外，與抗體藥物相比受體-Fe融合蛋白不必進(jìn)行繁瑣的抗體篩選和人源化過程，具有親和力高、免疫源性低等優(yōu)點(diǎn)。⑶28 CTLA-4/B7 (⑶80)為T淋巴細(xì)胞重要的共刺激信號(第二刺激信號)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4/CD152)和CD28同為免疫球蛋白超基因家族成員，二者具有 70%的同源性，均為表達(dá)于T細(xì)胞表面的跨膜受體。⑶28和CTLA-4是一對具有正負(fù)調(diào)節(jié)功能的重要共刺激分子，二者競爭性結(jié)合B7分子，但CTLA4與其配體B7分子親和力較CD28 大20倍。⑶28與APC上的B7-1和B7-2的結(jié)合后能夠傳遞共刺激信號給T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng) ⑶3/TCR復(fù)合體或⑶2分子的作用，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化和分泌多種細(xì)胞因子。CTLA-4則抑制T淋巴細(xì)胞的增殖、活化，誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡，是機(jī)體免疫系統(tǒng)維持的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 ⑶28和CTLA-4的天然配體為存在于APC表面的B7分子家族，包括B7-1 (⑶80)、B7_2 (⑶86) 和B7-3。B7-1和B7-2表達(dá)于激活的單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，B7-3 主要在角質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。
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B淋巴細(xì)胞活化因子(BlyS)與其受體則為B淋巴細(xì)胞的重要活化信號。B淋巴細(xì)胞活化因子(B lymphocyte stimulator, Blys)又被稱為 THANK(TNF homologue that activates apotosis, nuclear factor-κ B, and c-JUN NH2_terminal kinase), TALLl(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand-I), BAFF(B cell activating faetors belonging to the TNF family), zTNF4 及 TNF 13B,是 1999 年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(TNF)配體超家族成員。作為B細(xì)胞的共刺激因子，Blys的主要作用是刺激B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體，其正常表達(dá)維持依賴和不依賴T細(xì)胞抗原刺激的B細(xì)胞活化和增殖至關(guān)重要。Blys還參與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能。Blys受體分別為 B 細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)、穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interacter, TACI)和 BAFF-R,這三種受體與 Blys 的親和力都達(dá)到 Sub-nanomolar級，其中BCMA及TACI均為BLyS與腫瘤壞死因子家族另一成員APRIL(a proliferation-inducing ligand, 一種誘發(fā)增殖的配體)的共受體，BAFF-R是BLyS的特異性受體。Blys的過量表達(dá)或缺陷均能引起機(jī)體的免疫失衡進(jìn)而誘發(fā)各種自身免疫性疾病。 B淋巴細(xì)胞活化因子(Blys)是目前治療自身免疫性疾病良好的靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白，所述的免疫融合蛋白包括兩部分一部分為序列如SEQ ID. I所示的氨基酸序列組成的多肽鏈；另一部分為序列如 SEQ ID. 2所示的氨基酸序列組成的多肽鏈。本發(fā)明的可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白的制備方法，包括以下步驟I)將B淋巴細(xì)胞活化因子(BlyS)三種受體之一的穿膜蛋白活化物(TACI)胞外功能結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白κ輕鏈恒定區(qū)Ck編碼基因通過重疊PCR方法連接，得到核苷酸序列如SEQ ID. 3所示的TACI/C κ編碼基因；2)同樣將 CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)胞外功能結(jié)構(gòu)域與人的IgG4重鏈恒定區(qū)Fc(CHl、CH2和CH3)編碼基因連接，得到核苷酸序列如SEQ ID. 4所示的CTLA-4/IgG4Fc編碼基因；其中IgG4Fc恒定區(qū)有兩個(gè)氨基酸突變，第228位的 S突變?yōu)镻，第235位的L突變?yōu)镋 ；3)將克隆得到的上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后克隆至真核細(xì)胞表達(dá)載體；4)真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至工程細(xì)胞(CH0、293或NSO細(xì)胞)中，在上述細(xì)胞中組裝成同抗體類似的4肽鏈結(jié)構(gòu)，得到Ultra-T/B免疫融合蛋白。Ultra_T/B免疫融合蛋白為一種受體-Fe (Fragment cristallizable)融合蛋白。本發(fā)明的可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白，具有用于制備治療由于 T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫性疾病的藥物的用途。本發(fā)明中，一方面為使Ultra-T/B免疫融合蛋白在真核細(xì)胞，特別是CHO細(xì)胞中高表達(dá)，對融合蛋白的編碼基因進(jìn)行了優(yōu)化，使其更適于在CHO細(xì)胞中表達(dá)；另一方面為進(jìn)一步降低免疫融合蛋白可能具有與效應(yīng)細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)Fe YR 的結(jié)合能力和提高IgG4的穩(wěn)定性，對IgG4鉸鏈區(qū)和CH2恒定區(qū)的氨基酸殘基S228P， L235E (Fe氨基酸殘基編號按Kabat數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行了突變。在IgG四種亞類中本發(fā)明之所以選擇IgG4是由于IgG4與Clq的結(jié)合能力最弱，不能經(jīng)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，產(chǎn)生補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(CDC效應(yīng))，也不能結(jié)合單核巨噬細(xì)胞，不能介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC 效應(yīng))；但I(xiàn)gG4分子的缺點(diǎn)是形成的二聚體不夠穩(wěn)定以及有一定的結(jié)合中性粒細(xì)胞Fe Y R 的能力，本發(fā)明中通過鉸鏈區(qū)和CH2恒定區(qū)氨基酸的突變的可以克服IgG4分子的上述缺陷。因此本發(fā)明的Ultra-T/B免疫融合蛋白可作為一種未來治療自身免疫性疾病反復(fù)使用藥物，可降低未來用于患者體內(nèi)后由此產(chǎn)生的毒副作用。經(jīng)ELISA方法檢測 Ultra-T/B免疫融合蛋白(或免疫融合蛋白305)在體外可以很好的結(jié)合可溶性CD80 (B7) 和B淋巴細(xì)胞活化因子(Blys)這兩種T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化分子，將來用于體內(nèi)可同時(shí)抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化作用，未來可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等自身免疫性疾病的治療。說明書附Ia為TACI/C κ表達(dá)載體的構(gòu)建過程中PCR擴(kuò)增C κ和TACI的電泳圖，其中， LC κ擴(kuò)增產(chǎn)物；2，TACI擴(kuò)增產(chǎn)物；3，分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖Ib為TACI/C κ表達(dá)載體的構(gòu)建過程中重疊PCR擴(kuò)增TACI/C κ的電泳圖，其中，1，TACI/C K擴(kuò)增產(chǎn)物；2，分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖Ic為TACI/C κ表達(dá)載體的構(gòu)建過程中雙酶切鑒定PHG_TACI/C κ載體的電泳圖，其中，I，pHG-TACI/C κ載體；3，分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2a為CTLA_4/IgG4表達(dá)載體的構(gòu)建過程中PCR擴(kuò)增IgG4和CTLA-4的電泳圖， 其中，1，IgG4擴(kuò)增產(chǎn)物；2，分子量標(biāo)準(zhǔn)；3，CTLA-4擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2b為CTLA-4/IgG4表達(dá)載體的構(gòu)建過程中重疊PCR擴(kuò)增CTLA_4/IgG4的電泳圖，其中，1，CTLA-4/IgG4回收產(chǎn)物；2，分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2c為CTLA-4/IgG4表達(dá)載體的構(gòu)建過程中雙酶切鑒定pLG-CTLA_4/IgG4的電泳圖，其中，1，pLG-CTLA-4/載體；2，分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3為雙酶切鑒定Ultra-T/B免疫融合蛋白表達(dá)載體的電泳圖，其中，1，分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，Ultra-T/B免疫融合蛋白表達(dá)載體；圖4為Ultra-T/B免疫融合蛋白結(jié)構(gòu)圖；圖5為Ultra-T/B免疫融合蛋白與CD80 (B7)的結(jié)合結(jié)果示意圖；圖6為Ultra-T/B免疫融合蛋白與Blys的結(jié)合結(jié)果示意圖；圖7為Ultra-T/B免疫融合蛋白純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果示意圖，其中1，蛋白質(zhì) Marker ;2，純化產(chǎn)物I (非還原);3，純化產(chǎn)物2 (非還原);4，蛋白質(zhì)Marker ;5，純化產(chǎn)物 1(還原)；6，純化產(chǎn)物2(還原)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I構(gòu)建Ultra-T/B免疫融合蛋白包括以下步驟
一、Ultra-T/B免疫融合蛋白基因的克隆I、基因的合成委托上海捷瑞生物工程有限公司合成TACI編碼基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID. 5所示；同樣，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成CTLA-4編碼基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID. 6所示。2、表達(dá)載體的構(gòu)建 材料含Ck和IgG4Fc恒定區(qū)(IgG4)氨基酸殘基，其中IgG4Fc恒定區(qū)有兩個(gè)氨基酸突變，第228位的S突變?yōu)镻，第235位的L突變?yōu)镋，(Fe氨基酸殘基編號按Kaba數(shù)據(jù)庫)，由本單位構(gòu)建。引物設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白，其特征在于，所述的免疫融合蛋白包括兩部分一部分為序列如SEQ ID. I所示的氨基酸序列組成的多肽鏈；另一部分為序列如SEQ ID. 2所示的氨基酸序列組成的多肽鏈。
2.制備如權(quán)利要求I中所述的可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟1)將TACI和Ck編碼基因連接，得到核苷酸序列如SEQID. 3所示的TACI/Ck編碼基因;2)將CTLA-4和IgG4Fc恒定區(qū)的編碼基因連接，得到核苷酸序列如SEQID. 4所示的 CTLA-4/IgG4 Fe編碼基因；其中IgG4 Fe恒定區(qū)有兩個(gè)氨基酸突變，第228位的S突變?yōu)?P，第235位的L突變?yōu)镋 ;3)將克隆得到的上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后克隆至真核細(xì)胞表達(dá)載體；4)真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至工程細(xì)胞中，在上述細(xì)胞中組裝成同抗體類似的4肽鏈結(jié)構(gòu)，得到可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所說的工程細(xì)胞選自CH0、293或NSO 細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求I中所述的可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白，具有用于制備治療由于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫性疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可同時(shí)抑制T、B淋巴細(xì)胞功能的免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的融合蛋白具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4，CTLA-4)和穿膜蛋白活化物(transmembraneactivatorandCAMLinteracter，TACI)胞外功能結(jié)構(gòu)域的功能區(qū)，能與抗原提呈細(xì)胞表面分子B7(CD80)和B淋巴細(xì)胞活化因子(BlyS)特異地、高親和性結(jié)合，具有抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化的能力。由于自身免疫性疾病(autoimmunitydiseases)是T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)而導(dǎo)致的一類疾病，因此Ultra-T/B免疫融合蛋白具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(TypeIdiabetes)等一類疾病的潛力。
文檔編號C12N15/85GK102585016SQ20121005765
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者萬露, 楊思儀, 王星恒, 王星源, 耿達(dá)天, 胡品良, 陳宏 , 高曉雨 申請人:江蘇健德生物藥業(yè)有限公司