專利名稱：產(chǎn)生用于生物分析的冷凍血或冷凍血細(xì)胞的方法
產(chǎn)生用于生物分析的冷凍血或冷凍血細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在-40。C至-60。C的溫度下、優(yōu)選在-50。C至-60。C下，低 溫保存含有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的人全血或血細(xì)胞的改進(jìn)的方法，由此 單核細(xì)胞(monocyte)和淋巴細(xì)胞的功能得到保存。本發(fā)明特別涉及在不需 要分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的 情況下，低溫保存含有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的人全血或血細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
為了臨床檢查針對(duì)受細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性(即接種個(gè)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)) 抵抗的病原體的疫苗，通常從接種個(gè)體的血液樣品中分離單個(gè)核細(xì)胞。 為此，需現(xiàn)場(chǎng)裝備高度專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室以及具有相應(yīng)資格的工作人員。 而且，所有的容器和試劑必須是無熱原的。通常，將細(xì)胞在液氮(通常為 氣相)中冷凍、儲(chǔ)藏并裝運(yùn)。
通常，在發(fā)展中國家(如在非洲)進(jìn)行上述臨床檢查。現(xiàn)場(chǎng)裝備專門化 的實(shí)驗(yàn)室、招募合適的工作人員以及運(yùn)輸液氮中的樣品，都需要高昂的 資金和高超的技術(shù)。而且，在無熱原的條件下分離單個(gè)核細(xì)胞易受外界 的影響，熱原物質(zhì)可能激活單核細(xì)胞，這使得樣品無價(jià)值。
原檢測(cè)中的基本工具。簡而言之，將待測(cè)量的樣品在加熱的情況下與人 血液或血細(xì)胞一起溫育，其后，評(píng)估作為單核細(xì)胞激活指示劑的促炎細(xì) 胞因子的產(chǎn)生。這個(gè)步驟也可以用新鮮抽取的人血液進(jìn)行，但是作為一 條準(zhǔn)則，即用型以及充分地表征的血液或血細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)化和市場(chǎng)分配所 需的。
Lakey等(Lakey JR， Anderson TJ， Rajotte RV. Novel approaches to cryo-preservation of human pancreatic islets (低溫保存人月夷島的新方法). Transplantation. 2001 Sep 27: 72(6):1005-11)記載了具有標(biāo)準(zhǔn)低溫保護(hù)劑 二曱亞砜(DMSO)的乙二醇(EG)對(duì)分離的人胰島存活和功能的低溫保護(hù)作用。結(jié)果證明，與2.0 M的DMSO和各種濃度的EG相比，較低濃度
的保存。 卩 、 、' 口
人全血分析日益用于檢測(cè)免疫功能或檢測(cè)熱原污染，這是因?yàn)樗鼈?提供了諸如便于操作、制備假象少以及生理細(xì)胞環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。然而，該
方法經(jīng)常受到新鮮抽取的血液的利用率、在#:感染供體情況下的推斷的
安全性顧慮、以及個(gè)體間供體差異的限制。
EP 0741294 Bl記載了通過與全血接觸和隨后測(cè)量內(nèi)源性熱原的產(chǎn) 生檢測(cè)化合物的熱原活性的方法。但沒有記載血液的低溫保存。
Schindler等(Schindler S， Asmus S, von Aulock S， Wendel A, Hartung T: Fennrich S. Cryopreservation of human whole blood for pyrogenicity testing (低溫保存人全血用于熱原性檢測(cè)).J Immunol Methods. 2004 Nov; 294(1-2): 89-100)記載了批量產(chǎn)生低溫保存的血液的方法，所述血液在解 凍后可以直接使用而不需任何洗滌步驟。如通過FACS分析所顯示的， 單個(gè)核細(xì)胞保持完整。細(xì)胞因子的釋放可通過多種免疫學(xué)刺激進(jìn)行誘導(dǎo)。 與新鮮的血液相比，細(xì)胞制劑釋放更高量的白介素-l(3(IL-l(3)和IL-6,但 無TNF。通過向新鮮血液中加入低溫保護(hù)劑二曱亞砜(DMSO),可將這些 差異僅歸因于DMSO的存在。大批量低溫保存的血液可通過混合最多10 位供體的血液捐贈(zèng)品制備，而不依賴對(duì)血型的區(qū)分。有關(guān)誘導(dǎo)IL-1(3釋放 的世界衛(wèi)生組織(WHO)的脂多糖(內(nèi)毒素，LPS)參考制品(EC-6)的檢查限 度是至少0.5個(gè)內(nèi)毒素當(dāng)量(EU)/ml?？梢砸砸幌盗兴幬餀z測(cè)歐洲藥典規(guī) 定的極限濃度下的內(nèi)毒素標(biāo)樣，表明體外熱原檢測(cè)(IPT)也可用低溫保存 的血液進(jìn)行。描述了其他可能的應(yīng)用，包括高通量篩選免疫調(diào)節(jié)劑或毒 素以及保存患者的樣品用于稍后的單核細(xì)胞功能分析。
EP 05024463.1記載了低溫保存哺乳動(dòng)物全血的改進(jìn)的方法，包括提 供人全血樣品，提供稀釋的含水低溫保護(hù)劑，以1:2至2:1的比例混合所 述樣品和所述稀釋的含水低溫保護(hù)劑，以便產(chǎn)生低溫預(yù)混合物 (cyto-premix)，并在-65。C至-100。C的溫度下、優(yōu)選在-80。C下、在適宜 的冷凍器中冷凍所述預(yù)混合物，以便獲得哺乳動(dòng)物全血的低溫保存的樣
5然而，所有上文引用的文獻(xiàn)都涉及借助通過投入液氮(-196。C)的休克 冷凍(shock-freezing)的低溫保存或使用干水(-79。C)。而且，已知的是，保 存的細(xì)胞在接近低溫過程中和加熱至室溫時(shí)由于溶液作用和細(xì)胞內(nèi)水狀 物的形成而經(jīng)常受到破壞，這只能通過非常快速的冷凍來防止。
此外，基于人發(fā)熱反應(yīng)的可選擇熱原檢測(cè)是通過將檢測(cè)樣品與人全 血一起溫育并產(chǎn)生IL-1、 IL-6或TNFa作為讀出的方式建立的。另外， 可選擇熱原4企測(cè)的所述試劑盒可在市場(chǎng)上獲得(標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液、ELISA 等)，但新鮮抽取的人血液是每個(gè)實(shí)驗(yàn)所需的。最后，如上文，在液氮中 低溫保存PBMCs的技術(shù)已完全建立，但是因?yàn)槠湫枰獙?shí)驗(yàn)設(shè)備、產(chǎn)生過 程以及適宜的裝運(yùn)和儲(chǔ)藏，因而昂貴和費(fèi)力。
由上文可見，仍然需要簡單還易于使用、有特色、安全和穩(wěn)定的保 存全血的方法。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供這種改進(jìn)的方法以及與這種 方法以及相關(guān)方法相關(guān)的優(yōu)勢(shì)、特別是在約-60。C至-約-40。C的相對(duì)高溫 下。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，上述目標(biāo)是通過低溫保存哺乳動(dòng)物全血 或血細(xì)胞的改進(jìn)的方法解決的，該方法包括，提供人全血或血細(xì)胞的樣
品，提供稀釋的含水低溫保護(hù)劑，混合所述樣品和所述稀釋的含水低溫 保護(hù)劑，以便產(chǎn)生低溫預(yù)混合物，并在適宜的冷凍劑或冷凍器中，在-40。C 至-65。C的溫度下冷凍所述預(yù)混合物，以便獲得哺乳動(dòng)物全血或血細(xì)胞的 低溫保存的樣品。
與利用(液體或氣體形式的)氮或干水的已建立的方法相比，本發(fā)明 技術(shù)的第一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，費(fèi)用低了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于冷凍和儲(chǔ)藏而言，不 需要儲(chǔ)藏和運(yùn)輸用自動(dòng)化制冷機(jī)和氮容器或-80。C的深度冷凍器，且對(duì)于 運(yùn)輸而言，不需要干水。因此， 一方面可節(jié)省外圍實(shí)驗(yàn)室以及中心實(shí)驗(yàn) 室的投資，另一方面節(jié)省高昂的運(yùn)輸費(fèi)用。
本發(fā)明技術(shù)的第二個(gè)優(yōu)勢(shì)是，也可將從個(gè)體采集的樣品作為全血直 接冷凍，而沒有污染風(fēng)險(xiǎn)。在評(píng)估用于確定細(xì)胞結(jié)合免疫性(以及熱原檢 測(cè))的樣品過程中，絕對(duì)必須防止PBMCs受到刺激，因?yàn)殡S后由于高噪 音水平不能再測(cè)量特定的信號(hào)。在已建立的方法中，在低溫保存進(jìn)行前， 通過梯度離心的方式分離PBMCs。為了防止細(xì)胞的刺激，必須保證無熱原的梯度凝膠，這經(jīng)常不是使用常規(guī)梯度和/或檢測(cè)試管的情況。另外， 評(píng)估實(shí)驗(yàn)室中的工作必須絕對(duì)無菌和無熱原，這在常規(guī)條件下難以實(shí)現(xiàn)。 后者特別適用于經(jīng)驗(yàn)少的實(shí)驗(yàn)室或者資格低的工作人員。
本發(fā)明方法的第三個(gè)優(yōu)勢(shì)是，為了保護(hù)免疫細(xì)胞的功能，不需要異
源人AB血清各自血漿。為了成功地低溫保存分離的PBMCs或其他的細(xì) 胞，加入人血清(從AB血型供體中獲得的，以排除針對(duì)淋巴細(xì)胞的血型 同種凝集素的作用)是關(guān)鍵的。必須小心地選擇許多適宜的AB血清，因 為一定百分比的AB血清誘導(dǎo)T細(xì)胞刺激。在PBMCs的低溫保存中，最 好的試劑是自體血清。低溫保存的全血、自體血清各自血漿是自動(dòng)包含 于樣品中的，或者，如果需要，加入的。
優(yōu)選地，所述稀釋的含水低溫保護(hù)劑是選自溶解于磷酸鹽緩沖液(如 倫森緩沖液(S6rensenbuffer))、含有約生理濃度(如150mM)的鹽的含水緩 沖液或其他適宜的含水無鹽或基本上無鹽的緩沖液中的10%-30%、優(yōu)選 20。/。的DMSO。"基本上無鹽"意指，緩沖液僅含有痕量鹽和/或低于10 mM的非常低量的鹽。其他的這些緩沖液對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知 的。其他適宜的試劑包括幾乙基淀粉(HES)。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，在混合 前，不需要冷卻細(xì)胞和DMSO或?qū)⑺麄兎胖糜诒?。在本發(fā)明的方法中， 這兩種組分都可以處于室溫下(參閱下文的實(shí)施例)。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述混合通過小心地混合所述 樣品和所述稀釋的含水低溫保護(hù)劑進(jìn)行。小心的混合可通過將稀釋的含 水低溫保護(hù)劑慢慢地滴入全血或血細(xì)胞樣品中并顛倒含有樣品的試管或 容器進(jìn)行。優(yōu)選在混合低溫保護(hù)劑(如DMSO)時(shí)，小心地振蕩樣品。
在本發(fā)明方法的另 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品還含有抗凝血?jiǎng)?如肝素，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，向血液樣品中加入所述抗凝血?jiǎng)?br> 在本發(fā)明方法的另 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，血細(xì)胞選自人外周血單 個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、 apherese-單核細(xì)胞、血沉棕黃層、干細(xì)胞(如來自臍 帶血或外周血)、細(xì)胞治療(如用于腫瘤治療的樹突細(xì)胞)以及基于細(xì)胞的 基因治療(如遺傳》務(wù)飾淋巴細(xì)胞)。
最佳的是，為了避免樣品中單核細(xì)胞的冷凍干燥，將哺乳動(dòng)物全血 或血細(xì)胞的低溫保存樣品填入基本上不含空氣的凍存管(cryotubes)。優(yōu)選地，混合步驟后，將所述預(yù)混合物在室溫下或者4。C至30°C、 優(yōu)選22+/-2°C下保存30分鐘至180分鐘、優(yōu)選30分鐘至60分鐘的時(shí)間 段。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，與加入低溫保護(hù)劑(如DMSO)后直接冷凍的樣品 相比，冷凍前短暫的儲(chǔ)藏步驟提高了冷凍細(xì)胞的反應(yīng)性。再者，在不期 望受限于理論的情況下，看起來這種作用可歸因于低溫保護(hù)劑向細(xì)胞膜 以及向細(xì)胞質(zhì)整合的改善。
優(yōu)選地，在-40。C至-60。C的溫度、優(yōu)選-55。C至-60。C的溫度下冷凍 所述預(yù)混合物。冷凍在適宜的冷凍器中進(jìn)4亍，如-40。C或-60。C的商購的 冷凍器。而且適宜的冷凍劑如干水都可使用，只要能達(dá)到適宜的溫度。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了本發(fā)明的方法，其還包括將所述低 溫保存的樣品在-40。C至-60。C的溫度、優(yōu)選在-55。C至-60。C下，儲(chǔ)藏1-4 周、優(yōu)選3周的時(shí)段。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與儲(chǔ)藏了較短時(shí)間段的細(xì)胞相 比，已在-40。C至-60。C下、優(yōu)選-55。C至-60。C下儲(chǔ)藏了一定時(shí)間段(理 想的是約3周)的細(xì)胞的反應(yīng)性/生存力得到改善。在此時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了 最佳反應(yīng)性，并且由此應(yīng)優(yōu)選使用這種最小儲(chǔ)藏期。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物選自小鼠、大鼠、 山羊、貓、犬、馬、山羊、幾內(nèi)亞豬、倉鼠、猴或人。人是優(yōu)選的。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是全血或血細(xì)胞樣品的樣 品池(pool)。出于實(shí)用的原因，該池可由2-20個(gè)、優(yōu)選約10個(gè)樣品組成， 但是樣品的理論數(shù)是沒有限制的。
本發(fā)明的另 一 方面涉及確定接種個(gè)體的個(gè)體免疫狀態(tài)、特別是細(xì)胞 結(jié)合免疫性的方法，包括上文的低溫保存方法。
本發(fā)明的另 一方面涉及熱原檢測(cè)的方法，包括上文的低溫保存方法。
本發(fā)明的另 一方面涉及確定CD4以及CD8 T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的 穩(wěn)定性和功能性的方法，包括上文的低溫保存方法。
依然是本發(fā)明的另 一方面涉及臨床^r測(cè)針對(duì)病原體的疫苗的方法， 包括上文的低溫保存方法，所述病原體通過細(xì)胞免疫性受到排斥。
依然是本發(fā)明的另 一方面涉及進(jìn)行本文所述方法的試劑盒，其中所 述試劑盒含有進(jìn)行所述方法的諸如小瓶、標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液的材料、進(jìn)行 ELISA的材料、進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的材料、手冊(cè)和/或裝運(yùn)冷凍樣品的材料。
8根據(jù)本發(fā)明，研發(fā)了允許冷凍全血樣品的方法，所述樣品用于在無 進(jìn)一步制備的情況下、特別是無單個(gè)核細(xì)胞的在前分離的情況下，確定 細(xì)胞結(jié)合免疫性。樣品的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能未受到損壞。低溫 保存的發(fā)生，不需要液氮。由此，用很少的資金和技術(shù)努力評(píng)估個(gè)體的 血液樣品(例如，疫苗的臨床檢查)變?yōu)榭赡堋?br> 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，解決了本發(fā)明的目標(biāo)，這是因?yàn)轭A(yù)稀釋 (如在上文的緩沖液或磷酸鹽緩沖液中為20%)所需的低溫保護(hù)劑(如
DMSO)，且隨后小心地混合血液樣品或血細(xì)胞樣品(如以1:1的比例)。 在優(yōu)選的室溫下靜置后，可在-40。C至-60。C下、在冷凍器中或干冰上直 接冷凍樣品。不需要額外的輔助物。單核細(xì)胞和CD3細(xì)胞的功能(例如， 用適宜的標(biāo)志物刺激的能力)得到維持。如此產(chǎn)生的低溫血(cryoblood)樣 品在至少 一年內(nèi)是穩(wěn)定的。
令人驚訝的是，用于檢測(cè)細(xì)胞結(jié)合免疫性的深度冷凍的血液樣品，(a) 不再需要在高度專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理(分離單個(gè)核細(xì)胞)，以及(b) 不再需要在基于液氮的冷凍器中或在-80。C下進(jìn)行冷凍和運(yùn)輸。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于費(fèi)用的實(shí)質(zhì)節(jié)省(約90%)以及勞力的實(shí)質(zhì)節(jié)省。對(duì) 于臨床檢查針對(duì)通過細(xì)胞結(jié)合免疫性排斥的病原體(例如肺結(jié)核、瘧疾) 的疫苗，不再需要?jiǎng)趧?dòng)密集型以及昂貴的實(shí)驗(yàn)室以及高資格的工作人員。 也簡化了樣品的運(yùn)輸。而且，可基本上減少樣品(例如在細(xì)胞分離過程中， 通過非無熱原的裝置以及化學(xué)品)污染的危險(xiǎn)。
為了確定患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)，如果例如在醫(yī)生或內(nèi)科醫(yī)師辦公室 的檢查點(diǎn)進(jìn)行，那么迄今必須采集新鮮血液并在同一天內(nèi)在專業(yè)化的實(shí) 驗(yàn)室中檢查，這需要如快遞等的后勤付出并涉及進(jìn)一步的費(fèi)用。本發(fā)明 的方法允許在無其他問題的情況下按所需評(píng)估樣品。樣品可稍后診斷并 可在干水上進(jìn)行簡易裝運(yùn)?？稍讷F醫(yī)醫(yī)藥中考慮相似的情形(因?yàn)檫@也可 涉及疫苗的臨床檢測(cè))，并且包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
盡管根據(jù)本發(fā)明的方法在人類中的優(yōu)選實(shí)用性，對(duì)其進(jìn)行了描述， 但本發(fā)明的方法也可以在例如就疫苗而言，在類似人(例如牛)的臨床試驗(yàn) 和研究中，用于其他的動(dòng)物。
仍然是本發(fā)明的另 一方面涉及分析和/或檢測(cè)空氣中熱原的方法(優(yōu)選在不良建筑物綜合征(sick-building-syndrome)的背景下)，其中，通過膜
血一起溫育，隨后進(jìn)行本文所述的檢測(cè)。
仍然是本發(fā)明的另 一方面涉及(例如在運(yùn)輸/裝運(yùn)/儲(chǔ)藏/生產(chǎn)前)分析 和/或檢測(cè)制藥工業(yè)的反應(yīng)容器、儲(chǔ)藏容器/桶狀物、容器/發(fā)酵罐的熱原缺 乏的方法，其中加入根據(jù)本發(fā)明制備的稀釋的血液，使之反應(yīng)/接觸，并 隨后確定細(xì)胞因子或其他合適的參數(shù)。
在下面的實(shí)施例中，參考附圖，將對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，而不是 對(duì)其進(jìn)行限制。出于本發(fā)明的目的，將所有本文引用的文獻(xiàn)在此以全文 的方式通過引用并入。


圖1表示-40。C下產(chǎn)生和儲(chǔ)藏的低溫血的質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)-40。C下深 度冷凍的低溫血在解凍后對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)性，并與新鮮抽取血液的反應(yīng) 相比(相同供體的新鮮和深度冷凍血液樣品分別來自相同血液樣品)。
圖2和圖3表示對(duì)-60。C下產(chǎn)生的低溫血質(zhì)量的另一檢測(cè)，并與相同 供體的新鮮抽取的血液(特別地和作為合并樣品)相比，以及與-80。C下的 產(chǎn)生和儲(chǔ)藏相比。
圖2A至圖2D表示從5位供體抽取的新鮮血液樣品對(duì)內(nèi)毒素(WHO 標(biāo)準(zhǔn))的反應(yīng)性，IL-1(3 (A)、 IL-6 (B)以及TNFa的誘導(dǎo)(特別測(cè)定(particular determination)以及三細(xì)胞因子-ELISA (Tri-Cytokine-ELISA)概括測(cè)定 (summarising determination)) (C和D)。
圖3A至圖3D表示儲(chǔ)藏7天后低溫血(圖2所示5位供體的合并血液) 對(duì)內(nèi)毒素(WHO標(biāo)準(zhǔn))的反應(yīng)性，IL-ip(A)、 IL4(B)以及TNFa(C)的誘導(dǎo) (特別測(cè)定以及三細(xì)胞因子-ELISA概括測(cè)定)(D)。產(chǎn)生全部數(shù)據(jù)，以與 -80。C下的產(chǎn)生和4諸藏相比較。
圖4表示-60。C下產(chǎn)生和儲(chǔ)藏的低溫血的穩(wěn)定性(4A)。檢測(cè)了-60。C 下保存的低溫血解凍后對(duì)內(nèi)毒素(WHO標(biāo)準(zhǔn))的反應(yīng)性，并與-80。C下保 存的低溫血的反應(yīng)相比(4B)。
實(shí)施例
不同溫度下^f氐溫血的產(chǎn)生利用肝素化管(例如Sarstedt S-monovettes 9ml LH以及Multifly set 21G，無菌且無熱原)，從5位健康個(gè)體每位采集約9ml血液?？梢匀菀?地增加待釆集的血液的量。所述量一方面取決于符合輸注醫(yī)學(xué)考慮的供 體保護(hù)，另一方面取決于后勤標(biāo)準(zhǔn)(通過考慮可用的容量，在限定的時(shí)間 段內(nèi)的低溫血的產(chǎn)生或處理)。在抽取血液前，為了盡可能排除供體的單 核細(xì)胞的最終預(yù)刺激或基于藥物治療的抑制，詢問供體有關(guān)急性感染性 疾病或抗炎藥物使用的情況。
抽取后約3小時(shí)內(nèi)，檢測(cè)小體積的每一血液樣品的反應(yīng)性以及新鮮 狀態(tài)下的單核細(xì)胞的最終預(yù)刺激(參閱第l項(xiàng)，用新鮮血液進(jìn)行預(yù)檢測(cè))。 而且，這些結(jié)果可作為評(píng)估低溫保存成功的參考值。
合并主要體積的血液樣品，并在不同的溫度下冷凍(-40。C、 -60。C以 及-80。C)(參閱第2項(xiàng)，低溫保存)。在冷凍器中短暫儲(chǔ)藏后，檢測(cè)低溫保 存的成功(參閱第3項(xiàng)，低溫血的質(zhì)量控制)。因此，通過在數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)分 析單核細(xì)胞的反應(yīng)性，檢測(cè)低溫血的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性(參閱第4項(xiàng)，儲(chǔ)藏的穩(wěn)
定性)。
1.用新鮮血液進(jìn)行預(yù)檢測(cè)
抽取后，在全血熱原檢測(cè)中檢查而不進(jìn)一步處理小體積(約200 iil)的 每個(gè)血液樣品。這種檢查不應(yīng)該在血液抽取后的大于3小時(shí)后進(jìn)行。為 此，借助多道連續(xù)分配移液器(Brand HandyStep或Eppendorf Multipette plus 4981)以及無菌且無熱原的附件(如EppendorfCombitips biopur 1 ml), 向細(xì)胞培養(yǎng)平板(如BD Falcon 353072， 96孔平底，無菌且無熱原，如果 需要，必須檢測(cè)平板的無菌性和熱原的缺乏)中加入各自的血液樣品。之 前用纟田月包i告養(yǎng)基(Cambrex、 Invitrogen、 Biochrom、 Biozol 、 Sigma或Gibco 的RPMI 1640 w/L-谷氨酰胺，內(nèi)毒素的含量< 0.025 IU/ml)和系列稀釋于 無菌且無熱原鹽水(如Fresenius Kabi或B. Braun的等滲氯化鈉溶液)的分 別的陽性對(duì)照(如NIBSC，第二國際標(biāo)準(zhǔn)品-LPS 94/580)以及相應(yīng)的無菌 和無熱原陰性對(duì)照(如Fresenius Kabi或B. Braun的等滲氯化鈉溶液)準(zhǔn) 備平板。所用的量如下
220 jil RPMI 1640
+ 20 nl對(duì)照+ 20 新鮮血液。
隨后，利用無菌和無熱原的槍頭(如Eppendorf epT丄P.S. bi叩ur)和多 通道移液器(如Eppendorf Research),通過以100-120 )il往復(fù)吹打5次， 均勻且無泡沫地混合組分。最后，將蓋著的平板轉(zhuǎn)移到37°C、 5% C02 以及95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱(如Heraeus Cytoperm或Labotect C42)中 10-24小時(shí)(通常過夜)。
隨后，在ELISA中(參閱第3項(xiàng))測(cè)定個(gè)體制備物中的內(nèi)源性熱原 IL-1(3 、 IL-6以及TNFa (特別的以及多細(xì)胞因子的ELISA (Multi-Cytokine-ELISA))。預(yù)4企測(cè)結(jié)果顯示于圖2中。 2.低溫M
主要體積的抽取的血液樣品通過無菌和無熱原的一次性血清移液管 (如Greiner Bio-one或VWR)轉(zhuǎn)移至去熱原的玻璃容器內(nèi)，并混合。任選 地，以相同的方式，進(jìn)行個(gè)體供體血液樣品的低溫保存。隨后，將如以 前制備的相同體積的溶解于倫森緩沖液中的20%的DMSO溶液(DMSO: 如Sigma D陽2650; 4侖;^纟爰沖液如Proquant PYROKONTROL,約30 mM 磷酸鹽，兩種試劑都是無菌且無熱原的)力。入該池，并緩慢均勻地淘洗。 然而，也可以使用其他的溶液(如50mMTris緩沖液、PBS、 0.9%鹽水、 RPMI 1640;所有的溶液必須是無菌且無熱原的，如果必要，必須進(jìn)行4企 測(cè))。與各文獻(xiàn)中所建立的相反，使含有DMSO的溶液處于約20。C(室溫) 的溫度范圍而不是處于水冷的狀態(tài)。室溫下30-60分鐘后，將混合物以 1.5ml等分至凍存管(如Nunc凍存管小瓶1.8ml，無菌且無熱原，如果必 要，必須進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè))。必須確保管是密封的。在低溫保存前，必須遵從30 分鐘的最小時(shí)間段(平衡)。
隨后，在不同的溫度下冷凍血液池。為此，將凍存管分成大約相同 規(guī)才莫的三組，轉(zhuǎn)移至合適的盒子(如Nalgene、 Roth或Brand的9x9塑料 凍存盒)進(jìn)行儲(chǔ)藏，并在無任何其他輔助裝置的情況下儲(chǔ)藏于下列冷凍器 中
a) -80。C (設(shè)備Heraeus Hera冷凍器)
b) 隱60。C (i殳備Forma Scientific Enviroscan生物冷凍器)
c) 畫40。C (設(shè)備DJM CryoResearch超低溫冷凍器)。3. 低溫血的質(zhì)量控制
建議在儲(chǔ)藏約一周后盡早進(jìn)行低溫血的質(zhì)量控制，因?yàn)轱@然即使在 深度冷凍狀態(tài)下，平衡過程仍然發(fā)生。為了檢查低溫保存的合并樣品， 將一等分試樣各自解凍，優(yōu)選在干燥箱(如Heraeus VT5042)中、37°C下 靜置。通過不流動(dòng)的暖空氣解凍優(yōu)于其他的方法(如在水浴中和在加熱塊 上)。15分鐘后，將管從加溫箱中取出，小心地上下振蕩，進(jìn)行充分混合。 隨后，如上文第1項(xiàng)孵育新鮮血液時(shí)所述的，再次借助多道連續(xù)分配移 液器以及無熱原的制劑，立即加入到具有培養(yǎng)基和對(duì)照的細(xì)胞培養(yǎng)平板 上。解凍時(shí)間的確切觀察以及快速處理很重要，因?yàn)榈蜏匮钡郊尤氲?細(xì)胞培養(yǎng)平板都受10。/。DMSO的影響，這會(huì)損害單核細(xì)胞的功能。如以 下可以看出，DMSO的濃度通過加入培養(yǎng)基中稀釋了 6.5倍。組合物如 下
200plRPMI 1640 + 20 nl對(duì)照
+ 40 ^低溫血(由于用含有DMSO的緩沖液進(jìn)行預(yù)稀釋，與新鮮血液 相比，血液的體積加倍)。
在將組分(也參閱新鮮血液溫育部分的第l項(xiàng))混合后，在此情況下， 也將蓋著的平板轉(zhuǎn)移至上文所述的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在所述條件下培養(yǎng) 10-24小時(shí)。
溫育時(shí)間期滿后，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)平板，利用多通道移液管并 以100 !il吹打5-6次，再次混合孔的內(nèi)容物。不需要分離上清液和細(xì)胞 或碎片。隨后，根據(jù)制造商的推薦，將50-200 ^d每一樣品用于單細(xì)胞因 子ELISA (single-cytokine-ELISA) (R&D Systems Quantikine或DuoSet)中， 或用于多細(xì)胞因子ELISA中，以便能檢測(cè)LPS刺激誘導(dǎo)的IL-1卩和/或IL-6 和/或TNFa的釋放。結(jié)果顯示于
圖1至圖3中。
4. 有關(guān)低溫血儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的檢查
在不同的時(shí)間點(diǎn)，從冷凍器中取低溫保存的血液樣品，并和第3項(xiàng) 相似，檢查其單核細(xì)胞的反應(yīng)性。結(jié)果顯示于圖4中。
1權(quán)利要求
1.低溫保存哺乳動(dòng)物全血或血細(xì)胞的方法，包括-提供人全血或血細(xì)胞樣品，-提供稀釋的含水低溫保護(hù)劑，-混合所述樣品和所述稀釋的含水低溫保護(hù)劑，以便產(chǎn)生低溫預(yù)混合物，以及-使用適宜的冷凍器或冷凍劑，在-40℃至-60℃的溫度下，冷凍所述低溫預(yù)混合物，以便獲得哺乳動(dòng)物全血或血細(xì)胞的低溫保存的樣品。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述稀釋的含水低溫保護(hù)劑選自 溶解于諸如倫森緩沖液、PBS的磷酸鹽緩沖液或含有生理濃度鹽的其他 緩沖液或其他適宜的含水無鹽和/或基本上無鹽的緩沖液和/或自體血漿 的10%-30%DMSO。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中將所述稀釋的含水低溫保護(hù) 劑與所述樣品以1:2至2:1的比例混合。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述混合通過小心地 混合所述樣品和所述稀釋的含水低溫保護(hù)劑進(jìn)行。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品還含有諸如 肝素的抗凝血?jiǎng)?br> 6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述血細(xì)胞選自人外 周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、 aph erese-單才亥纟田月包、jfe^冗^it"^"、干纟田月包、纟田 胞治療劑以及基于細(xì)胞的基因治療劑。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中將哺乳動(dòng)物全血或血 細(xì)胞的所述低溫保存樣品裝入基本上不含空氣的凍存管。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在環(huán)境溫度或4°C 至30°C下、優(yōu)選22+/-2°C下，將所述混合后的所述低溫預(yù)混合物樣品儲(chǔ) 藏30-180分鐘、優(yōu)選30-60分鐘的時(shí)間段的步驟。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中在-40。C至-60。C的溫 度下、優(yōu)選-60。C下，冷凍所述低溫預(yù)混合物。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在-40。C至-60。C 的溫度下、優(yōu)選-50。C下，將所述低溫保存的樣品儲(chǔ)藏2-4周、優(yōu)選3周 的時(shí)間^:的步驟。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在將所述低溫預(yù)混 合物的組分混合前，使所述組分處于室溫下。
12. 如權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
13. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是來自相 同或不同供體的全血或血細(xì)胞樣品的池。
14. 確定個(gè)體的全身免疫狀態(tài)的方法，包括權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng) 所述的方法。
15. 熱原^r測(cè)的方法，包括權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法。
16. 確定CD4細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞功能 性的方法，包括權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法。
17. 臨床檢測(cè)針對(duì)通過細(xì)胞免疫排斥的病原體的疫苗的方法，包括權(quán) 利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及在-40℃至-60℃的溫度、優(yōu)選-60℃下，低溫保存含有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的人全血的改進(jìn)的方法，由此單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能得到保存。本發(fā)明特別涉及在不需要分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)情況下，低溫保存含有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的人全血或血細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)A01N1/02GK101583268SQ200780038563
公開日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2007年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日
發(fā)明者托馬斯·蒙塔戈-萊辛, 蔭戈·斯普瑞特澤爾, 貝蒂娜·洛斯施納 申請(qǐng)人:聯(lián)邦血清與疫苗管理局保羅-埃利希爾-研究所