專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)蕪菁花葉病毒的一步多重rt-pcr法及其專(zhuān)用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的一步多重RT-PCR 法及其專(zhuān)用引物。
背景技術(shù)：
完菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus,TuMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae) 馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),病毒粒子呈彎曲線形，長(zhǎng)約720nm,寬約15_20nm,由95 %的外殼蛋白和5%的RNA構(gòu)成。病毒核酸為單鏈正義RNA，約由10，000個(gè)核苷酸組成。TuMV 寄主范圍廣泛，在人工接種條件下，可侵染43科156屬，超過(guò)318種雙子葉植物及部分單子葉植物；主要侵染十字花科蔬菜作物和觀賞性物種，是僅次于黃瓜花葉病毒(CMV)浸染大田蔬菜最重要的病毒。據(jù)調(diào)查，我國(guó)白菜因TuMV危害平均每年造成5%的產(chǎn)量損失，有些年份減產(chǎn)10%以上，病害嚴(yán)重的地塊幾乎絕收。對(duì)該病毒的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)有助于控制其傳播流行，減輕危害和損失。常用的植物病毒檢測(cè)方法有傳統(tǒng)的生物學(xué)檢測(cè)方法、血清學(xué)方法、電鏡檢測(cè)法和分子生物學(xué)方法等。傳統(tǒng)生物學(xué)方法簡(jiǎn)單、直觀、可靠，能準(zhǔn)確反映病毒的生物學(xué)特性，但需要具備指示植物、溫室、網(wǎng)室等隔離條件，且檢測(cè)速度很慢，如隔離措施不當(dāng)，容易交叉感染，影響準(zhǔn)確性。電鏡檢測(cè)是最直接、最準(zhǔn)確的檢測(cè)病毒的手段，但用電鏡觀察時(shí)需要樣品含有的病毒濃度較高，因此需要對(duì)被檢病毒進(jìn)行提純，病毒提純費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且電鏡法所需電鏡及超速離心設(shè)備價(jià)格昂貴，操作對(duì)初學(xué)者掌握難度較大。血清學(xué)方法是檢測(cè)植物病毒最常用的有效方法之一，該方法需要與被檢病毒相對(duì)應(yīng)的特異性抗血清。但抗血清制備需要的時(shí)間較長(zhǎng)，且檢測(cè)結(jié)果容易受抗血清的特異性影響，有時(shí)會(huì)有交叉反應(yīng)。分子生物學(xué)方法是從核酸水平來(lái)檢測(cè)病毒的存在，比血清學(xué)方法靈敏度高，可檢測(cè)到皮克(Pg)級(jí)甚至飛克 (fg)級(jí)，并且特異性更強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣本的檢測(cè)。由于分子生物學(xué)方法顯著的優(yōu)越性， 使得其在病毒檢測(cè)中得以迅速?gòu)V泛的應(yīng)用。分子生物學(xué)方法包括核酸雜交、雙鏈RNA電泳、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、 熒光定量PCR、芯片檢測(cè)等方法，其中RT-PCR方法檢測(cè)病毒是最為廣泛應(yīng)用的方法之一，該方法需要病毒基因特異性引物(GSP)對(duì)病毒核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。雖然ELISA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)，但其檢測(cè)的靈敏性無(wú)法與RT-PCR方法相比，RT-PCR方法是 DAS-ELISA方法敏感度的1000倍。隨著人們對(duì)不同來(lái)源的病毒進(jìn)行基因組測(cè)序工作的進(jìn)展，GenBank的數(shù)據(jù)不斷豐富，使得利用RT-PCR方法檢測(cè)病毒變得更加切實(shí)可行。在此基礎(chǔ)上人們進(jìn)而開(kāi)發(fā)了多重RT-PCR，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種病毒。一般RT-PCR檢測(cè)法需要分兩步進(jìn)行先提取樣品總RNA，然后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，步驟相對(duì)繁瑣。在兩步法的基礎(chǔ)上人們?yōu)榱撕?jiǎn)化步驟，開(kāi)發(fā)了一步RT-PCR法，即反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。因此，建立快速、高靈敏度的病毒檢測(cè)體系是對(duì)TuMV病毒防治的先決條件。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的引物組。
D本發(fā)明提供的檢測(cè)蕪菁花葉病毒的引物組，為如下引物組C、引物組A或引物組D
所述弓I物組C包括引物對(duì)a和引物對(duì)b ；
所述引物組A包括引物對(duì)a;
所述引物組B包括引物對(duì)b ;
所述引物對(duì)a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成；
所述引物對(duì)b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成。
上述引物組中，所述引物組C還包括隨機(jī)引物和Oligo d (T) 18 ；
所述引物組A還包括隨機(jī)引物和/或Oligo d (T) 18 ；
所述引物組B還包括隨機(jī)引物和/或Oligo d(T) 18。
所述隨機(jī)引物為Random Primer,購(gòu)自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D3801 ；
所述Oligo d(T) 18為Oligo d(T) 18，購(gòu)自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D511。
上述引物組中，所述引物組C由所述引物對(duì)a、所述引物對(duì)b、所述隨機(jī)引物和所述Oligo (KT) 18 組成；
上述引物組中，所述引物組A由所述引物對(duì)a、所述隨機(jī)引物和/或所述Oligod(T) 18 組成；
上述引物組中，所述引物組B由所述引物對(duì)b、所述隨機(jī)引物和/或所述Oligod(T) 18 組成。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的PCR試劑。
本發(fā)明提供的PCR試劑，為如下I)-3)中的任意一種
I)由上述的引物組中的所述引物組C、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；
2)由上述的引物組中的所述引物組A、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；
3)由上述的引物組中的所述弓丨物組B、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成。
在上述PCR試劑中，所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV ；
所述各引物組中的所述引物對(duì)a和所述引物對(duì)b的各條引物在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 125 μ mol/L ；
所述引物組A或所述引物組B中的所述隨機(jī)引物在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的終濃度均為 I. 25 μ mol/L ；
所述引物組A或所述引物組B中的所述Oligo d(T) 18在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 625 μ mol/L。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的試劑盒。
本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的PCR試劑。
上述的引物組、上述的PCR試劑或上述的試劑盒在鑒定或輔助檢測(cè)蕪菁花葉病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍?；蛏鲜龅囊锝M、上述的PCR試劑或上述的試劑盒在制備鑒定或輔助檢測(cè)蕪菁花葉病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述的引物組、上述的PCR試劑或上述的試劑盒在鑒定或輔助檢測(cè)待測(cè)植物是否感染蕪菁花葉病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中，上述待測(cè)植物具體為蘿卜、甘藍(lán)或四月慢油菜。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助檢測(cè)待測(cè)植物是否感染蕪菁花葉病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物組織的RNA提取物作為模板，分別用上述的PCR試劑或上述的試劑盒中的所述的引物組C、所述的引物組A或所述的引物組B 進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述引物組C擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為156bp和/或377bp，則待測(cè)植物為或候選為感
染蕪菁花葉病毒；若所述引物組A擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為156bp，則待測(cè)植物為或候選為感染蕪菁花葉
病毒;若所述引物組B擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為377bp，則待測(cè)植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒。上述方法中，所述大小為156bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列I或與其同源性大于90%的核苷酸序列；所述大小為377bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列2或與其同源性大于90%的核苷酸序列；所述一步RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為55°C ；所述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳；所述待測(cè)植物為蘿卜、甘藍(lán)或四月慢油菜；上述方法中的所述待測(cè)植物組織的RNA提取物按照如下方法制備將所述待測(cè)植物葉片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl, EDTA、 SDS和水組成；所述Tris在所述提取液中的終濃度為200mM，所述NaCl在所述提取液中的濃度為250mM，所述EDTA在所述提取液中的濃度為25mM，所述SDS在所述提取液中的濃度為0.5% (質(zhì)量百分含量)；所述提取液的pH值為7.5 ;所述研磨在23 °C -28 °C條件下進(jìn)行；所述組織為葉片。上述提取液在提取RNA中的應(yīng)用；上述應(yīng)用中，所述提取的溫度具體為 230C -28O。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了兩套針對(duì)TuMV的特異性引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和普通Taq酶，建立了一步法多重RT-PCR，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)TuMV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，尤其是兩套針對(duì)TuMV的特異性引物確保了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；另外在一步法多重RT-PCR中的模板只需要在室溫條件下對(duì)樣品簡(jiǎn)單研磨即可制備，研磨的粗提液或經(jīng)濃縮后的DNA-RNA混合物均可作為模板，方法簡(jiǎn)便,不需要經(jīng)過(guò)先對(duì)總RNA的單獨(dú)提純步驟；再者，一步法多重RT-PCR中的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比現(xiàn)有的一步法RT-PCR使用的 SuperscriptII價(jià)格便宜,在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)更容易被接受。


圖I為多種引物組合對(duì)檢測(cè)效果的影響
圖2為病毒量對(duì)擴(kuò)增效率的影響
圖3為粗提物經(jīng)分離純化濃縮后的產(chǎn)物圖
圖4為用粗提液與濃縮產(chǎn)物為模板進(jìn)行檢測(cè)的對(duì)比
圖5為用GSPl引物組合對(duì)TuMV的快速檢測(cè)結(jié)果
圖6為用GSP2引物組合對(duì)TuMV的快速檢測(cè)結(jié)果
圖7為用GSPl引物組合和GSP2引物組合對(duì)TuMV的快速檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中部分材料如下TuMV毒源為來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的北京TuMV毒株Cl、C3、C4， 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供的TuMV毒株Lu2。TuMV毒株Cl、TuMV毒株C3、TuMV毒株C4記載在馮蘭香、徐玲、劉佳、鈕心恪、李秀生“北京地區(qū)大白菜蕪菁花葉病毒株系的鑒定”《中國(guó)蔬菜》1988(4) :11-13;公眾均可從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得。TuMV毒株Lu2記載在國(guó)家蔬菜抗病育種課題TuMV株系研究協(xié)作組“我國(guó)十省 (市)十字花科蔬菜蕪菁花葉病毒(TuMV)株系分化研究”《病毒學(xué)雜志》1990，5 (I). 82-87 ; 公眾可從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得。將上述Cl、C3、C4、Lu2分別在溫室(25°C )條件下人工接種在四月慢油菜和漢王白蘿卜，網(wǎng)罩隔離，得到分別感染Cl、C3、C4、Lu2的四月慢油菜和分別感染Cl、C3、C4、Lu2 的漢王白蘿卜，上述接種在四月慢油菜樣本的葉片花葉皺縮、失綠，呈現(xiàn)出感染TuMV病毒的典型癥狀。接種在漢王白蘿卜樣本的表型極輕微，葉片無(wú)皺縮，有輕微的明脈。負(fù)對(duì)照為未接種上述各種TuMV毒株的四月慢油菜和漢王白蘿卜(生長(zhǎng)狀態(tài)正常， 沒(méi)有TuMV病毒感染病癥)。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(產(chǎn)品目錄號(hào)為D2639A)、Oligo d(T) 18 (產(chǎn)品目錄號(hào)為D511)、 Random Primer (產(chǎn)品目錄號(hào)為D3801，含有6個(gè)堿基的隨機(jī)序列引物，有46種可能序列，5' 末端憐酸化修飾。)為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。DNA聚合酶EasyTaq (API 11)及DNA marker IOObp plus(BM311)為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。實(shí)施例I、一步RT-PCR法中相關(guān)引物的設(shè)計(jì)及條件摸索一、一步RT-PCR法中相關(guān)引物的設(shè)計(jì)在自然條件下蕪菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)非常容易通過(guò)基因重組，產(chǎn)生變異。通過(guò)查閱文獻(xiàn)獲知在TuMV-6Kl基因內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因重組位點(diǎn)，序列高度保守，且TuMV-CP基因的C端相對(duì)比較保守。經(jīng)對(duì)GenBank登錄的122個(gè)TuMV株系進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)TuMV的6K1區(qū)段(GenBank 號(hào) HQ446217. I (C4)編碼區(qū)的第 3526-3681 位)及 CP 保守區(qū)(GenBank 號(hào) HQ446217. I (C4)編碼區(qū)的第9074-9450位)設(shè)計(jì)了兩套特異性引物GSPl和GSP2 (見(jiàn)表I)。 所設(shè)計(jì)的引物經(jīng)NCBI的BLAST檢測(cè)，確保對(duì)TuMV檢測(cè)的唯一性與準(zhǔn)確性。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。表I為兩套特異性引物序列
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的引物組，為如下引物組C、引物組A或引物組B :所述弓I物組C包括引物對(duì)a和引物對(duì)b ；所述引物組A包括引物對(duì)a;所述引物組B包括引物對(duì)b;所述引物對(duì)a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成；所述引物對(duì)b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物組，其特征在于所述引物組C還包括隨機(jī)引物和Oligo d(T) 18 ；所述引物組A還包括隨機(jī)引物和/或Oligo d (T) 18 ；所述引物組B還包括隨機(jī)引物和/或Oligo d(T) 18。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的引物組，其特征在于所述引物組C由所述引物對(duì)a、所述引物對(duì)b、所述隨機(jī)引物和所述Oligo d(T) 18組成；所述引物組A由所述引物對(duì)a、所述隨機(jī)引物和/或所述Oligo d(T) 18組成；所述引物組B由所述引物對(duì)b、所述隨機(jī)引物和/或所述Oligo d(T)18組成。
4.一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的PCR試劑，為如下1)-3)中的任意一種1)由權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組中的所述引物組C、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；2)由權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組中的所述引物組A、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；3)由權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組中的所述引物組B、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PCR試劑，其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV ；所述各引物組中的所述引物對(duì)a和所述引物對(duì)b的各條引物在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 125ymol/L；所述引物組A或所述引物組B中的所述隨機(jī)引物在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的終濃度均為 L 25 μ mol/L ；所述引物組A或所述引物組B中的所述Oligo d(T) 18在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 625 μ mol/L。
6.一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求4或5所述的PCR試劑。
7.權(quán)利要求1-3任一所述的引物組、權(quán)利要求4或5的所述的PCR試劑或權(quán)利要求6 所述的試劑盒在鑒定或輔助檢測(cè)蕪菁花葉病毒中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1-3任一所述的引物組、權(quán)利要求4或5的所述的PCR試劑或權(quán)利要求6 所述的試劑盒在制備鑒定或輔助檢測(cè)蕪菁花葉病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1-3任一所述的引物組、權(quán)利要求4或5的所述的PCR試劑或權(quán)利要求6 所述的試劑盒在鑒定或輔助檢測(cè)待測(cè)植物是否感染蕪菁花葉病毒中的應(yīng)用；所述待測(cè)植物具體為蘿卜、甘藍(lán)或四月慢油菜。
8.一種鑒定或輔助檢測(cè)待測(cè)植物是否感染蕪菁花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物組織的RNA提取物作為模板，分別用權(quán)利要求4或5的所述PCR試劑或權(quán)利要求6 所述試劑盒中的所述的引物組C、所述的引物組A或所述的引物組B進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增， 得到擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述引物組C擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為156bp和/或377bp，則待測(cè)植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒；若所述引物組A擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為156bp，則待測(cè)植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒； 若所述引物組B擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為377bp，則待測(cè)植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述大小為156bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列I或與其同源性大于 90%的核苷酸序列；所述大小為377bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列2或與其同源性大于 90%的核苷酸序列；所述一步RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為55°C ；所述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳；所述待測(cè)植物為蘿卜、甘藍(lán)或四月慢油菜；所述組織為葉片；所述待測(cè)植物組織的RNA提取物按照如下方法制備將所述待測(cè)植物葉片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl、EDTA、SDS和水組成；所述 Tris在所述提取液中的終濃度為200mM，所述NaCl在所述提取液中的濃度為250mM，所述 EDTA在所述提取液中的濃度為25mM、所述SDS在所述提取液中的濃度為O. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述提取液的PH值為7. 5 ;所述研磨在23 °C -28 °C條件下進(jìn)行。
10.權(quán)利要求8或9所述方法中的所述提取液在提取RNA中的應(yīng)用；所述提取的溫度具體為 23 °C -28 °C。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的一步多重RT-PCR法及其專(zhuān)用引物。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)蕪菁花葉病毒的引物組，為如下引物組C、引物組A或引物組B所述引物組C由引物組A和引物組B組成；所述引物組A包括引物對(duì)a；所述引物組B包括引物對(duì)b；所述引物對(duì)a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成；所述引物對(duì)b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明建立了一步法多重RT-PCR，對(duì)TuMV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102586478SQ20121003865
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者葉艷英, 姚磊, 曾鋼, 馬榮才 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心