專利名稱：用于鑒定acc脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對(duì)微生物1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸 (ACC)脫氨酶結(jié)構(gòu)基因設(shè)計(jì)的通用特異性簡(jiǎn)并引物和用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從根瘤菌等細(xì)菌中擴(kuò)增ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdS)的方法。
背景技術(shù)：
植物遭受旱澇、鹽堿、高低溫、重金屬等逆境脅迫和病原微生物侵染會(huì)應(yīng)激產(chǎn)生大量植物激素乙烯。高水平的乙烯會(huì)抑制植物根伸長(zhǎng)、促植物器官衰老和脫落、加重病癥。ACC 是植物合成乙烯的直接前體。有些定殖在植物體內(nèi)外的細(xì)菌能吸收植物細(xì)胞分泌出來的 ACC,并用ACC脫氨酶催化ACC脫氨基反應(yīng)，生成α -酮丁酸和NH3作為細(xì)菌生長(zhǎng)所需的碳氮源。與此同時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)的ACC濃度下降，相應(yīng)地ACC氧化成乙烯的量降低，從而消減在逆境下乙烯對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制，延緩植物器官的衰老或病害的發(fā)展。由于植物不能靠運(yùn)動(dòng)選擇適宜生長(zhǎng)的地方而免不了生長(zhǎng)在逆境中，與植物緊密聯(lián)合的有ACC脫氨酶的細(xì)菌往往會(huì)比有固氮、溶磷或分泌鐵載體等特性的細(xì)菌更易產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)的效應(yīng)；ACC脫氨酶也就被認(rèn)為是細(xì)菌促植物生長(zhǎng)的一種重要特性(Glick et al. Critical Reviews of Plant Sciences 2007,26 :227-242)。隨著全球氣候變暖，自然災(zāi)害頻發(fā)，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，利用微生物幫助植物抗逆和修復(fù)污染的土壤和水體受到人們的重視，大量的有ACC脫氨酶的細(xì)菌被分離和篩選出來，顯示出促植物生長(zhǎng)、抗逆和清除污染物的效益。根瘤菌與豆科植物共生體系的固氮能力是自然界多種生物固氮體系中最強(qiáng)的，固氮量占地球生物固氮量的65%以上。根瘤菌若能高效結(jié)瘤和固氮，一方面侵染力要強(qiáng)，能夠躲避或壓制植物把根瘤菌作為外來入侵物而產(chǎn)生的防衛(wèi)反應(yīng)，另一方面要適應(yīng)植物的生存環(huán)境，能耐受干旱、高鹽、偏酸堿或高低溫等逆境或稱非生物脅迫。篩選能耐受非生物脅迫的根瘤菌只需操作自由培養(yǎng)狀態(tài)的根瘤菌，相對(duì)便捷。篩選侵染力強(qiáng)的根瘤菌，通常要逐一接種相應(yīng)的豆科植物，培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測(cè)根部的結(jié)瘤數(shù)和接種根瘤菌的占瘤率；若要從數(shù)量較多的根瘤菌菌株中篩選出侵染力強(qiáng)的菌株往往需要較大的培養(yǎng)空間，耗時(shí)耗力。早在20世紀(jì)70年代就有研究發(fā)現(xiàn)乙烯抑制根瘤菌結(jié)瘤和固氮，90年代的研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌侵染引發(fā)豆科植物產(chǎn)生ACC和乙烯，近十年的研究發(fā)現(xiàn)有些根瘤菌有ACC脫氨酶，它們的ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(accK)在根瘤中的表達(dá)量很高，如果把根瘤菌的acdS敲除，根瘤菌的結(jié)瘤能力會(huì)顯著降低(Uchiumi et al. Journal of Bacteriology 2004,186 2439-2448)；相反，如果向原本沒有ACC脫氨酶的根瘤菌導(dǎo)入acdS，那根瘤菌工程菌的結(jié)瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株(Ma et al. Applied and Environmental Microbiology 2004,70 :5891-5897)。有一研究檢測(cè)了 10個(gè)商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的根瘤菌菌株發(fā)現(xiàn)有一半(5個(gè))的菌株有acdS和ACC脫氨酶活性(Ma et al. Antonie van Leeuwenhoek 2003,83 :285-291)。這些研究都表明有ACC脫氨酶的根瘤菌有強(qiáng)的侵染力，能高效結(jié)瘤；篩選有ACC脫氨酶的根瘤菌能更可預(yù)測(cè)地實(shí)現(xiàn)與豆科植物高效結(jié)瘤固氮。ACC脫氨酶在多個(gè)綱目的細(xì)菌和真菌中存在。檢測(cè)細(xì)菌是否有ACC脫氨酶通常用含有ACC的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)菌并誘導(dǎo)細(xì)菌的ACC脫氨酶活性，再用比色法檢測(cè)ACC脫氨酶催化ACC脫氨的產(chǎn)物-α -酮丁酸。但有研究發(fā)現(xiàn)有些根瘤菌有acdS，但在自生狀態(tài)下沒有 ACC 脫氨酶活性(Ma et al. Antonie van Leeuwenhoek 2003，83 :285-291)，只在與豆科植物共生的根瘤中表達(dá) acdS(Uchiumi et al. Journal of Bacteriology 2004， 186 :2439-2448 ；Nukui et al. Applied and Environmental Microbiology 2006,72 4964-4969)。這樣，要鑒定細(xì)菌是否有ACC脫氨酶，從分子水平檢測(cè)細(xì)菌是否有acdS是比檢測(cè)細(xì)菌是否有ACC脫氨酶活性更穩(wěn)妥的方法。檢測(cè)細(xì)菌是否有acdS可以用DNA雜交法或PCR擴(kuò)增法。PCR擴(kuò)增比DNA雜交在實(shí)驗(yàn)操作上要簡(jiǎn)便得多，快得多，費(fèi)用也低，所以更適合用來從大量菌株中篩選有acdS的細(xì)菌。PCR技術(shù)作為分子生物學(xué)最常用的技術(shù)，經(jīng)廣泛持續(xù)的研發(fā)，效率越來越高，操作越來越簡(jiǎn)便，費(fèi)用越來越低。如有些商業(yè)化的2XPCR預(yù)混液中加入了增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑，顯著提高了 PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度，還能有效擴(kuò)增GC含量高、有二級(jí)結(jié)構(gòu)等復(fù)雜模板，降低了對(duì)PCR條件的要求；反應(yīng)前只需向2XPCR預(yù)混液加入引物、模板和用純水補(bǔ)足反應(yīng)體積，降低了取樣誤差，提高了檢測(cè)重復(fù)性。已有一些研究設(shè)計(jì)了用PCR法擴(kuò)增細(xì)菌acdS完整或部分序列的簡(jiǎn)并引物，但還沒有特異性和廣譜性兼?zhèn)涞囊?。有針?duì)Miizobium屬根瘤菌的acdS設(shè)計(jì)的引物，但對(duì) Rhizobium屬不同種的根瘤菌要用不同的引物對(duì)(Duan et al. Microbial Ecology 2009， 57 :423-436),廣譜適用性差。有的引物是針對(duì)β-和Y _變形桿菌綱細(xì)菌的acdS設(shè)計(jì)的(Blaha et al. FEMS Microbiology Ecology 2006,56 :455-470 ；Shah et al. Canadian Journal of Microbiology 1998,44 :833-843)，對(duì)有些屬于α -變形桿菌綱的根瘤菌不適用，而且對(duì)有些有ACC脫氨酶活性的β-和Y-變形桿菌綱細(xì)菌，也不能從中擴(kuò)增出 acdS (Shah et al. Canadian Journal of Microbiology 1998,44:833-843)。有的廣譜引物簡(jiǎn)并度太高，特異性差，能擴(kuò)增到非ACC脫氨酶的ACC脫氨酶同源蛋白的基因，如D-半胱氨酸脫巰基酶的基因(Hontzeas et al. Applied and EnvironmentalMicrobiology 2005, 71 :7556-7558)。已有研究表明ACC脫氨酶與其它同源蛋白的氨基酸序列保守區(qū)和酶活性關(guān)鍵位點(diǎn)在第51 (Lys，簡(jiǎn)寫K)，78 (Ser，S), 268 (Tyr, Y)和294(Tyr, Y)位上的氨基酸殘基是相同的，但在第295位和322位上的氨基酸殘基是不同的，而且這兩個(gè)氨基酸殘基決定了酶的催化特性。ACC脫氨酶在第295位和322位上的氨基酸殘基是Glu (E)和Leu (L)，而其它同源蛋白往往是Thr(T)或義！·^。因此，根據(jù)第295位和322位上氨基酸殘基的差異有可能設(shè)計(jì)出擴(kuò)增acdS的特異引物。共有-簡(jiǎn)并雜合寡核苷酸弓丨物(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primer，C0DEH0P)法是設(shè)計(jì)廣譜簡(jiǎn)并引物的有效方法(Rose et al. Nucleic Acids Research 1998,26 :1628-1635)。C0DEH0P法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的原理是選擇靶蛋白保守區(qū)內(nèi)連續(xù)3-4個(gè)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并核苷酸序列(9-12個(gè)堿基)得到3’簡(jiǎn)并核心區(qū)；在5’ 端根據(jù)引物退火溫度的設(shè)置選擇部分保守或優(yōu)勢(shì)氨基酸殘基，結(jié)合密碼子偏好性設(shè)計(jì)出5’ 端非簡(jiǎn)并共有序列夾。通過在較短的3’簡(jiǎn)并核心區(qū)序列用較少的簡(jiǎn)并堿基來控制適度的引物簡(jiǎn)并度，控制適度的有效引物的濃度；通過加長(zhǎng)5’端非簡(jiǎn)并共有序列夾來控制引物退火溫度，保障擴(kuò)增特異性。這樣，在首輪擴(kuò)增時(shí)，通過雜合引物在3’簡(jiǎn)并核心區(qū)與模板正確匹配而實(shí)現(xiàn)正確延伸；在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中，通過雜合引物與首輪擴(kuò)增產(chǎn)物在5’共有序列夾區(qū)正確匹配而實(shí)現(xiàn)正確擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計(jì)出針對(duì)ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdS)的廣譜且特異的簡(jiǎn)并引物，用于從根瘤菌等細(xì)菌中用PCR法擴(kuò)增出acdS，在分子水平鑒定具有ACC脫氨酶的細(xì)菌，從大量根瘤菌中快速篩選出具ACC脫氨酶的能高效結(jié)瘤的根瘤菌。本發(fā)明的解決方案是，基于盡可能多種類的、已確證有ACC脫氨酶活性的微生物包括α -、β -和Y -變形桿菌綱的細(xì)菌和真菌的acdS的保守區(qū)和C0DEH0P法設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增acdS的廣譜簡(jiǎn)并引物，通過序列比對(duì)選出能區(qū)分acdS序列和與ACC脫氨酶高度相似的D-半胱氨酸脫巰基酶的基因序列的特異簡(jiǎn)并引物，用預(yù)測(cè)有效的廣譜特異引物從已知有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌中擴(kuò)增acdS，用檢驗(yàn)有效的廣譜特異引物從根瘤菌中擴(kuò)增acdS， 篩選出有ACC脫氨酶的、有較高幾率能與寄主豆科植物高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌。本發(fā)明中，設(shè)計(jì)出的擴(kuò)增acdS片段的廣譜特異的新引物有3條正向引物 acdSf3、反向引物 acdSr3 和 acdSr4。acdSf3的核甘酸序列是5，ATCGGCGGCATCCAGffSNAAYCANAC 3，，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列是IGGIQ(S)NQT，包括了第78位的保守氨基酸殘基Ser(S)，下劃線區(qū)是3’簡(jiǎn)并核心區(qū)，簡(jiǎn)并度是128，在acdS序列中對(duì)應(yīng)部分的GC含量平均約60% ；序列比對(duì)分析顯示3’簡(jiǎn)并核心區(qū)能很好匹配各類受試微生物的acdS中相應(yīng)的保守序列，而且3’簡(jiǎn)并核心區(qū)的3’端不與D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應(yīng)序列匹配(圖1)，即能區(qū)分acdS和D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應(yīng)序列，對(duì)acdS的擴(kuò)增特異性強(qiáng)。acdSr3 的核苷酸序列是 5，GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT 3，，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列是DPVY(E)GKSMH，包括了第295位的保守氨基酸殘基Glu(E)，下劃線區(qū)是3’簡(jiǎn)并核心區(qū)，簡(jiǎn)并度是64，在acdS序列中對(duì)應(yīng)部分的GC含量平均約；序列比對(duì)分析顯示3’簡(jiǎn)并核心區(qū)能很好匹配受試acdS中相應(yīng)序列，但3’簡(jiǎn)并核心區(qū)的3’端也與多數(shù)受試D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應(yīng)序列匹配(圖幻，對(duì)acdS的擴(kuò)增特異性弱。acdSr4的核苷酸序列是5，GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA 3’，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列是 YAH(L) GGQP,包括了第322位的保守氨基酸殘基Leu (L)，下劃線區(qū)是3’簡(jiǎn)并核心區(qū)，簡(jiǎn)并度是64，在acdS序列中對(duì)應(yīng)部分的GC含量平均約72% ；序列比對(duì)分析顯示3’簡(jiǎn)并核心區(qū)能很好匹配受試acdS中相應(yīng)序列，與D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應(yīng)序列匹配度差(圖3)，能較好區(qū)分acdS和D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應(yīng)序列，對(duì)acdS的擴(kuò)增特異性較強(qiáng)。因預(yù)測(cè)到acdSr4比acdSr3對(duì)acdS相應(yīng)序列的特異性要強(qiáng)，所以預(yù)測(cè)用acdSf3/ acdSr4引物對(duì)擴(kuò)增acdS片段的特異性比用acdSf3/acdSr3引物對(duì)強(qiáng)，而acdSf3/acdSr3 引物對(duì)的擴(kuò)增特異性主要決定于acdSf3的特異性。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，特異性擴(kuò)增acdS首選acdSf3/acdSr4引物對(duì)。但因acdSr4在acdS序列中對(duì)應(yīng)部分的GC含量較高(平均約 72% )，用acdSf3/acdSr4引物對(duì)擴(kuò)增acdS的反應(yīng)條件要求也要高于用acdSf3/acdSr3引物對(duì)的條件，所以實(shí)際應(yīng)用時(shí)，對(duì)同一菌株分別用acdSf3/acdSr4和acdSf3/acdSr3引物對(duì)擴(kuò)增，以分別確保檢測(cè)的特異性和成功率。本發(fā)明中，利用權(quán)利要求1所述的引物鑒定和篩選微生物是否具有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶的方法，其特征在于，是將acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一個(gè)引物對(duì)用于PCR反應(yīng)，從微生物或其核酸樣品中擴(kuò)增ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的部分序列； 用acdSf3/acdSr4引物對(duì)擴(kuò)增出的acdS片段大小760bp，用acdSf3/acdSr3引物對(duì)擴(kuò)增出的acdS片段大小680bp ；如能用acdSf3/acdSr4引物對(duì)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度760bp的DNA片段，或者用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增得到長(zhǎng)度760bp和680bp的DNA片段，即認(rèn)為微生物有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶；如只能用acdSf3/acdSr3引物對(duì)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度680bp的DNA片段， 還需要以acdSf3或/和acdSrf為測(cè)序引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測(cè)序獲得所得DNA片段的堿基序列，如果測(cè)得的序列與基因數(shù)據(jù)庫GenBank中序列相似度最高的是ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的序列，則認(rèn)為微生物有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶。對(duì)于有不只一個(gè)接近預(yù)期大小片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以通過切膠回收分別純化不同大小的片段，再以相應(yīng)引物為測(cè)序引物分別進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，如果其中有一個(gè)DNA片段的序列與基因數(shù)據(jù)庫GenBank 中序列相似度最高的是ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的序列，則認(rèn)為微生物有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶。本發(fā)明中，針對(duì)acdS的廣譜特異簡(jiǎn)并引物的應(yīng)用所依托的是PCR技術(shù)。在實(shí)際操作中，一方面使用了添加了增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑的2XPCR預(yù)混液商品，提高了擴(kuò)增acdSr4引物對(duì)應(yīng)的GC含量高模板的效率，也降低了取樣誤差，提高了檢測(cè)重復(fù)性。另一方面，利用根瘤菌等革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁易破解的特性，將根瘤菌及其它革蘭氏陰性細(xì)菌的單菌落用10 μ 1無菌水懸浮后取1 μ 1直接加入PCR反應(yīng)體系，利用PCR預(yù)變性反應(yīng)階段的高溫裂解細(xì)菌細(xì)胞，以釋放出的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，免去提取細(xì)菌基因組DNA的步驟，簡(jiǎn)便、省時(shí)、省錢，適用于從多個(gè)細(xì)菌中快速篩選有ACC脫氨酶的菌株。本發(fā)明提供的acdSf3/ acdSrf和aCdSf3/acdSr4兩對(duì)引物經(jīng)預(yù)測(cè)也適用于從放線菌(革蘭氏陽性)和真菌基因組中擴(kuò)增acdS(圖1，2，3)，但本發(fā)明針對(duì)根瘤菌等革蘭氏陰性細(xì)菌所用的制備PCR模板的方法不適用于放線菌和真菌。本發(fā)明的有益效果在于提供了兩對(duì)廣譜且特異的用于PCR法擴(kuò)增微生物acdS片段的新引物acdSf3/ acdSr3和aCdSf3/aCdSr4，預(yù)測(cè)適用于α-、β-和γ -變形桿菌綱的細(xì)菌、放線菌和真菌。 實(shí)踐已證實(shí)基于這兩對(duì)引物的PCR能從有ACC脫氨酶活性的屬于β -變形桿菌綱的伯克霍爾德菌、草螺菌和屬于Y -變形桿菌綱的假單胞菌中擴(kuò)增到acdS的片段，能從大量屬于 α -變形桿菌綱的根瘤菌中快速篩選出有acdS的菌株，比已有的其它研究設(shè)計(jì)的引物在廣譜性和特異性上都要強(qiáng)，擴(kuò)增效率也更高。本發(fā)明不僅能用來鑒定有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌有acdS，也能用于篩選有ACC脫氨酶的細(xì)菌；而且，因有研究證實(shí)有ACC脫氨酶的根瘤菌能高效結(jié)瘤，所以本發(fā)明能快速從大量根瘤菌中篩選出能高效結(jié)瘤的菌株。


圖1為核苷酸序列聯(lián)配比對(duì)圖，顯示引物acdSf3序列與各類微生物ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdSf3上部)和D-半胱氨酸脫巰基酶基因(acdSf3下部)相應(yīng)序列間的匹配性。 涂黑堿基表示與引物堿基不匹配。圖2為核苷酸序列聯(lián)配比對(duì)圖，顯示引物acdSrf序列與各類微生物ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdSr3上部)和D-半胱氨酸脫巰基酶基因(acdSr3下部)相應(yīng)序列間的匹配性。涂黑堿基表示與引物堿基不匹配。圖3為核苷酸序列聯(lián)配比對(duì)圖，顯示引物acdSrf序列與各類微生物ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdSr4上部)和D-半胱氨酸脫巰基酶基因(acdSr4下部)相應(yīng)序列間的匹配性。 涂黑堿基表示與引物堿基不匹配。
具體實(shí)施例方式引物設(shè)計(jì)從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了 17個(gè)已證實(shí)有ACC脫氨酶活性的微生物的ACC脫氨酶的氨基酸序列。這17個(gè)微生物包括6個(gè)α-變形桿菌綱的細(xì)菌[Agrobacterium tumefaciens D3 (氨基酸序列在 GenBank 的登錄號(hào) AAI^8496)、Azospirillum lipoferum4B(ABE66282) > Mesorhizobium Ioti MAFF303099(BAB52295)> Phyllobacterium brassicacearum STM196(AB031418)、 Rhizobium leguminosarum 128C53K(AAL16088)和 Sinorhizobium meliloti SMll (ABA56046) ]，4 個(gè) β-變形桿菌綱的細(xì)菌[Burkholderi caledonica LMG 19076(ACH81521), B.caryophylli LMG 2155 (ACH81522)、Ralstonia solanacearum GMI 1000(CAD17797)禾口 Variovorax paradoxus5C2 (AAT35829)]，2 個(gè) Y —變形桿菌綱的細(xì)菌[Pseudomonas ffluorescens 17(AAC44163)禾口 P. putida UW4(AAV73804)]，2 個(gè)歸屬還未確定的細(xì)菌[Enterobacter cloacae CAL2 (AAD05070) 禾口 Pseudomonas sp.ACP(AAA25689) ], 3 個(gè)真菌[Hansenula saturnus(Q7M523)、 Penicillium citrinum(BAA92150)和 Tricboderma asperellum(ACX94231)]。將這些氨基酸序列用MUSCLE程序列隊(duì)聯(lián)配后提交到多序列聯(lián)配模塊處理器(Blocks Multiple AlignmentProcessor ；http://bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/ process_blocks.html)來鑒定這些ACC脫氨酶序列的保守區(qū)并產(chǎn)生保守區(qū)塊，用C0DEH0P 程序(http//bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/codehop. html)在默認(rèn)參數(shù)下對(duì)各保守區(qū)塊設(shè)計(jì)出引物序列，將各程序生成引物與上述氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列比對(duì)進(jìn)行手動(dòng)校正產(chǎn)生待測(cè)引物。將待測(cè)引物與受試acdS和D-半胱氨酸脫巰基酶基因的相應(yīng)保守區(qū)塊的核苷酸序列聯(lián)配比對(duì)，預(yù)測(cè)在3’簡(jiǎn)并核心區(qū)能有效區(qū)分雙方序列的引物有正向引物 adSf3和反向引物acdSr4，而反向引物acdSr3的區(qū)分能力較弱(圖1，2，3)。引物制備用全自動(dòng)DNA合成儀合成，用ULTRAPAGE方法純化得到白色結(jié)晶，用Tris-EDTA緩沖液(pH 8.0)或超純水稀釋到100 μ M，分裝到0. 5ml離心管內(nèi)，在_20°C保存。PCR擴(kuò)增模板制備取細(xì)菌在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，用10 μ 1無菌純水懸浮菌體，取1 μ 1菌懸液作為PCR反應(yīng)的模板。PCR 擴(kuò)增按天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的2XTaq PCR MasterMix(含染料，目錄號(hào) KT201)產(chǎn)品說明書配制PCR反應(yīng)液。分別用引物對(duì)acdSf3/acdSr4或acdSf3/acdSr3擴(kuò)增。 每個(gè)引物的濃度為0. 4 μ M，加1 μ 1菌懸液作模板，反應(yīng)液的總體積為25 μ 1或50 μ 1 (用于測(cè)序)。以不加菌懸液的反應(yīng)液為陰性對(duì)照。用Bio-Rad SlOOO型PCR儀或東勝龍黑金剛 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C 4min,變性-退火-延伸循環(huán)為94°C 45s,530C 45s, 72°C lmin,循環(huán)；35次，終延伸72°C IOmin0反應(yīng)結(jié)束后吸取1_5 μ 1反應(yīng)液及5 μ 1 250bp DNA ladder marker [寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，目錄號(hào)D515]，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增陽性結(jié)果得到長(zhǎng)度 760bp (用 acdSf3/acdSr4 引物對(duì))或 680bp (用 acdSf3/acdSr3 引物對(duì))的 DNA 片段。實(shí)施例1從有ACC脫氨酶活性的歸屬于β -變形桿菌綱的伯克霍爾德菌和草螺菌和歸屬于Y -變形桿菌綱的假單胞菌的菌株中擴(kuò)增acdS片段受試菌株是已檢測(cè)到有ACC脫氨酶活性的44個(gè)細(xì)菌菌株。其中有1個(gè)從甘蔗根際土壤中分離的、5個(gè)從玉米莖內(nèi)分離的和12個(gè)從水稻根分離的歸屬于變形桿菌綱的伯克霍爾德屬的菌株，10個(gè)從水稻根分離的歸屬于變形桿菌綱的草螺菌屬的菌株和 16個(gè)從水稻根分離的歸屬于Y-變形桿菌綱的假單胞菌屬的菌株(li et al. Letters in Applied Microbiology 2011，53 :178-185)。這些菌株分別在LB培養(yǎng)基(每升含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg氯化鈉，15g瓊脂粉，pH7.0)上，在培養(yǎng)。用20 μ 1移液器吸頭挑取直徑約Imm的單菌落移入10 μ 1無菌純水中懸浮菌體，取1 μ 1菌懸液作為PCR反應(yīng)的模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增后都分別得到了 760bp和680bp的DNA片段，并且以acdSf3和acdSr3 為測(cè)序引物對(duì)其中680bp的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比較發(fā)現(xiàn)都與acdS最相似，證實(shí)擴(kuò)增所得是acdS的片段。這些序列在GenBank中的登錄號(hào)為 HQ728585 到 HQ7^626，HQ728641, HQ728642 和 HQ84077。其中草螺菌屬菌株的 acdS 序列與數(shù)據(jù)庫中草螺菌菌株SmRl的acdS序列的相似度有93. 5% -100%，而與其它屬細(xì)菌 acdS序列的相似度都低于80% ；其中假單胞菌屬菌株的acdS序列與數(shù)據(jù)庫中其他微生物 WacdS序列相似度較低，與最相似的草螺菌SmRl的acdS序列的相似度也僅75% -76%。 由于這些草螺菌(包括數(shù)據(jù)庫中草螺菌菌株SmRl的acdS序列)和假單胞菌的acdS序列與數(shù)據(jù)庫中其它細(xì)菌的acdS序列差異比較大，用以前研究設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物沒能從中擴(kuò)增出acdS序列，所以，本發(fā)明設(shè)計(jì)的新引物對(duì)acdSf3/acdSr3和acdSf3/acdSr4比以前研究設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物的廣譜性和擴(kuò)增效率高。實(shí)施例2從大量根瘤菌菌株中擴(kuò)增acdS片段，篩選出可能高效結(jié)瘤的根瘤菌受試根瘤菌是從刺槐根瘤內(nèi)分離到的200個(gè)根瘤菌分離物。這些根瘤菌分別在TY 培養(yǎng)基(每升含5g胰蛋白胨，3g酵母提取物，0. 44g 二水氯化鈣，15g瓊脂粉，pH6. 8-7. 0) 上，在培養(yǎng)。用20 μ 1移液器吸頭挑取直徑約Imm的單菌落移入10 μ 1無菌純水中懸浮菌體，取1 μ 1菌懸液作為PCR反應(yīng)的模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增且以acdSf3和acdSr3為測(cè)序引物對(duì)680bp的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，獲得23個(gè)不同序列，都與GenBank數(shù)據(jù)庫中根瘤菌的acdS 序列最相似，證實(shí)擴(kuò)增所得的是acdS的片段；其中20個(gè)菌株的acdS序列與Mesorhizobium 屬根瘤菌的acdS序列最相似，可能歸屬于Mesorhizobium屬；有3個(gè)菌株的acdS序列與 Sinorhizobium屬根瘤菌的acdS序列最相似，可能歸屬于Sinorhizobium屬。這些結(jié)果與此前研究發(fā)現(xiàn)Mesorhizobium屬根瘤菌在刺槐根瘤中占優(yōu)勢(shì)是相符的(Wei et al. FEMS Microbiology Ecology 200968 :320-328 ；Shiraishi et al.Soil Science and Plant Nutrition 2011,57 :765-774)。從200個(gè)根瘤菌分離物中快速篩選出的這23個(gè)具ACC脫氨酶的菌株很可能是侵染力強(qiáng)、能高效結(jié)瘤的菌株；接下來可以通過在不同脅迫條件下培養(yǎng)根瘤菌菌株和接種刺槐苗的實(shí)驗(yàn)從這23個(gè)菌株中篩選出對(duì)逆境適應(yīng)性強(qiáng)、高效結(jié)瘤固氮且促刺槐苗生長(zhǎng)的高效根瘤菌，在刺槐造林育苗生產(chǎn)上發(fā)揮作用。
權(quán)利要求
1.用于鑒定ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的引物，其特征在于，包括正向引物acdSf3、反向引物 acdSr3和acdSr4，其核苷酸序列分別是acdSf3 :5’ -ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3‘；acdSr3 :5’ -GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’ ；acdSr4 :5’ -GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA-3，。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的引物鑒定和篩選微生物是否具有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和 ACC脫氨酶的方法，其特征在于，是將acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一個(gè)引物對(duì)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從微生物或其核酸樣品中擴(kuò)增ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的部分序列；如能用aCdSf3/acdSr4引物對(duì)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度760bp的DNA片段，或者用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增得到長(zhǎng)度760bp和680bp的DNA片段，即認(rèn)為微生物有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶；如只能用acdSf3/acdSr3引物對(duì)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度680bp的DNA片段，還需要以acdSf3 或/和acdSrf為測(cè)序引物測(cè)定所得DNA片段的堿基序列，如果測(cè)得的序列與基因數(shù)據(jù)庫 GenBank中序列相似度最高的是ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的序列，則認(rèn)為微生物有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物是細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)，旨在提供用于鑒定ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的引物及方法。該引物包括正向引物acdSf3、反向引物acdSr3和acdSr4。鑒定和篩選微生物是否具有ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因和ACC脫氨酶的方法，是將acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一個(gè)引物對(duì)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從微生物或其核酸樣品中擴(kuò)增ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的部分序列，并根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判斷。本發(fā)明能從大量屬于α-變形桿菌綱的根瘤菌中快速篩選出有acdS的菌株，比已有的其它研究設(shè)計(jì)的引物在廣譜性和特異性上都要強(qiáng)，擴(kuò)增效率也更高。也能用于篩選有ACC脫氨酶的細(xì)菌，能快速從大量根瘤菌中篩選出能高效結(jié)瘤的菌株。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102534034SQ20121003864
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者安千里, 常四平, 張繼泰, 李萬里, 李江川, 李鄭義 申請(qǐng)人:武漢凱迪工程技術(shù)研究總院有限公司, 浙江大學(xué)