專利名稱：一種鏈霉菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鏈霉菌菌株及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
真菌引起的感染分為淺表真菌感染和深部真菌感染。淺表真菌感染的傳染性強， 其常見致病菌是各種癬菌，主要侵犯皮膚、毛發(fā)、指(趾)甲等，這些真菌病雖然頑固但不致命。深部真菌感染常見的病原菌為念珠菌屬和曲霉菌，主要侵犯內(nèi)臟器官和深部組織，危害性極大，?？晌＜吧?，其中，白色念珠菌(Candida albicans)是造成深部真菌感染的一類主要的病源真菌，它是造成醫(yī)院血液感染的主要原因，在傷口和體液中感染時具有很強的致死性，而且臨床研究發(fā)現(xiàn)其致死率并不隨常規(guī)抗真菌藥物的使用而下降。
過去，真菌感染一般只發(fā)生在特定的亞群患者中，然而隨著化療、移植、HIV/ADIS 感染或糖尿病等免疫受損患者數(shù)量的增多，真菌感染的發(fā)病率也不斷提高，侵入性真菌感染(Invasive Fungal Infections，簡寫為IFIs)的預(yù)防和治療領(lǐng)域正逐漸向接受化療、移植以及HIV/ADIS或糖尿病患者等人群擴(kuò)展，因此抗真菌藥物市場具有巨大的發(fā)展空間。目前微生物來源的抗真菌抗生素也已得到了飛速發(fā)展，從微生物次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型抗真菌抗生素是獲得抗真菌抗生素的一條重要途徑。
在臨床上，隨著真菌感染率的上升，對抗真菌藥物的使用率不斷提高，隨之而來的是耐藥菌株也不斷增多，已有抗真菌抗生素的療效大幅度降低，給臨床的治療也帶來一定的困難，因此尋找安全、高效、低毒、廣譜的新型抗真菌抗生素已越來越引起人們的重視。
近10年來(1996 2005)，各國報道的新抗真菌抗生素約有174種，化學(xué)結(jié)構(gòu)多達(dá)30余個類型，其中有一部分抗生素?？怪参镎婢蠖鄶?shù)抗動物真菌的抗生素或因抗真菌譜過窄，體內(nèi)活性微弱，或因細(xì)胞毒性較強等，天然物本身與經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾的產(chǎn)物，具有發(fā)展前景者不多。
放線菌(Actinomycete)是一類具有絲狀分枝細(xì)胞的革蘭氏陽性細(xì)菌，因菌落呈放射狀而得名，大多數(shù)有發(fā)達(dá)的分枝菌絲。放線菌重要的屬包括鏈霉菌屬和小單孢菌屬等， 其中，鏈霉菌是放線菌中最大的一個類群，是抗生素的重要生物來源。
rDNA由保守區(qū)和可變區(qū)組成，在細(xì)菌中高度保守，素有“細(xì)菌化石”之稱，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用和最常用的分子鐘。其中16S rRNA序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法?，F(xiàn)在人們對16S rDNA序列有了清晰的認(rèn)識，目前已經(jīng)明確細(xì)菌的16S rDNA全長約1540bp，片段長度適中，信息量較大且易于分析。在細(xì)菌的16S rDNA中有多個區(qū)段高度保守，根據(jù)這些保守區(qū)人們可以設(shè)計出細(xì)菌的通用引物，用它們可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16S rDNA片段，擴(kuò)增得到的細(xì)菌的16S rDNA片段根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法的不同，發(fā)展了多個分支，如16S rDNA的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析(ARDRA)、末端限制性片段長度多態(tài)性(TRFLP)分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、DGGE的巢式PCR擴(kuò)增。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種鏈霉菌菌株及其應(yīng)用，該鏈霉菌菌株抑制真菌效果好，尤其對白色念珠菌具有很好的抑制效果，對于真菌病的治療具有重要意義。
一種鏈霉菌菌株，命名為鏈霉菌(Streptomyces sp. ) ZJU088，其保藏號為CGMCC No.4889。
所述的鏈霉菌ZJU088于2011年5月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4889，該菌株的分類命名為鏈霉菌Mi^ptomyces sp. ο
所述的鏈霉菌ZJU088的生物學(xué)特征為菌落顏色是灰色，菌落形態(tài)較圓整，表面有褶皺，中間突起呈白色，直徑大小為中型(約5mm左右)，菌株產(chǎn)芽孢的時間在培養(yǎng)4d達(dá)到高峰，7d完全成熟。
所述的鏈霉菌ZJU088的16S rDNA序列如SEQ ID NO 1所示。
本發(fā)明還提供了一種如所述的鏈霉菌ZJU088在抑制白色念珠菌生長中的應(yīng)用。
通過對本發(fā)明的鏈霉菌菌株進(jìn)行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株對白色念珠菌(Candida albicans)具有強烈的抑菌效果；通過對鏈霉菌ZJU088的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征及16S rDNA序列分析，鏈霉菌ZJU088具備典型的放線菌形態(tài)特征，16S rDNA序列與鏈霉菌 (Stroeptomyces)的同源性為 99%。


圖1為本發(fā)明鏈霉菌菌株ZJU088的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征圖2是對本發(fā)明鏈霉菌菌株ZJU088的16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖 (圖中 M 為 DL3000Marker，1 為 Sti^ptomyces sp.)。
具體實施方式
培養(yǎng)基
(1)斜面培養(yǎng)基(高氏一號培養(yǎng)基，g/L)淀粉 2. 0，NaCl 0. 5，KNO3 0. 1，K2HPO4 0. 05，MgSO4 0. 05，F(xiàn)eSO4 0. 001，瓊脂 2. 0，土豆汁 10. 0，調(diào) pH 7. 2 7. 4。
(2)種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 1. 5，酵母粉 1. 0，K2HPO4 0. 1，MgSO4O. 05，F(xiàn)eSO4 0. 001，調(diào) pH7. 0 后加 CaCO3 0. 04。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)黃豆粉0. 6，可溶性淀粉3. 0，酵母粉1. 0，K2HPO4 0. LNaCl 0. 2，MgSO4 0. 05，F(xiàn)eSO4 0. 002，pH 7. 0。
(4)白色念珠菌培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖2. 0，蛋白胨1. 0，瓊脂2. 0。
供試菌株
白色念珠菌(Candida albicans)菌株為實驗菌株，無特異性要求。
實施例1菌株分離純化
土壤樣品在浙江東海劃定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行五點交叉采樣，每點采取土樣10g，放入錐形瓶內(nèi)，混勻后取土壤樣品10g，加到一個裝有90ml無菌水的錐形瓶中，置于搖床上振蕩 30min，使土樣中的菌體充分分散于水中，即為KT1菌液。接種環(huán)火焰滅菌冷卻后蘸取一環(huán)稀釋度為10—1菌液，在高氏一號培養(yǎng)基平板上作四區(qū)劃線接種，28°C培養(yǎng)5d，然后挑取單菌4落劃線，進(jìn)一步純化。
將培養(yǎng)后的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，移入無培養(yǎng)基平皿二8°C 培養(yǎng)4d后移入涂布白色念珠菌的平板，瓊脂塊中心間隔距離為km，培養(yǎng)過夜，根據(jù)抑制圈大小選擇單菌落進(jìn)行復(fù)篩。
復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)法進(jìn)行，取初篩得到的50株菌種，接入到種子瓶中，250ml錐形瓶中裝25ml種子培養(yǎng)基，初始pH 7.0J8°C下200r/min培養(yǎng)Mh。再將種子液以10% (ν/ν) 的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，250ml三角瓶中裝40ml發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C、pH 7. 0下200r/ min培養(yǎng)4d，離心取上清液，注入白色念珠菌培養(yǎng)基中，比較50株菌種所產(chǎn)抗真菌物質(zhì)抑制白色念珠菌的程度，最終獲得1株最高效抑制白色念珠菌的菌株，編號為ZJU088。斜面培養(yǎng)基保藏菌株于4°C冰箱中，長期保藏采用甘油管保藏法于-20°C凍存。
實施例2菌株鑒定
(1)形態(tài)觀察
在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，菌落顏色是灰色，菌落形態(tài)較圓整，表面有褶皺， 中間突起呈白色，直徑大小為中型(約5mm左右)，菌株產(chǎn)芽孢的時間在培養(yǎng)4d達(dá)到高峰， 7d完全成熟。在平板上培養(yǎng)4d后，挑取單菌落，在光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示，根據(jù)形態(tài)觀察和光學(xué)顯微鏡下孢子及菌絲體的觀察，可初步鑒定為一種放線菌。
(2) 16S rDNA 序列分析
取1環(huán)經(jīng)活化的放線菌菌種，接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，然后按10% (ν/ν)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中下200r/min培養(yǎng)4d，用紗布過濾，收集菌體在60°C下烘干，然后用液氮破壁，并在-80°C下保藏。利用下述改良CTAB法進(jìn)行菌種基因組DNA提取， 在-20°C下保存。
改良CTAB 法
①取1.5ml EP管，挑取覆蓋管底Imm破壁后的菌體，加入545 μ L TE緩沖液 (10mmol/L Tris. HCl, pH 8. 0 ； lmmol/L EDTA, pH 8. 0)，加入 20 μ L 溶菌酶 QOmg/ml)，用槍頭反復(fù)吹打使之重懸，然后加入30 μ L 10%305和61^ 10mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴 3h ；
②力口5yL 10mg/ml RNaseIh ；
③加IOOyL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加 80 μ L CTAB/NaCl，混勻，65 °C 溫浴 IOmin ；
④加入與上述總體積等體積的氯仿/異戊醇(ν/ν 24 1)，混勻后16000Xg，離心5min，重復(fù)三次后轉(zhuǎn)移上清液。
⑤加入與上清液等體積的酚氯仿異戊醇(ν/ν/ν 25 24 1)混合溶液，混勻后，16000Xg離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液。
⑥加入上一步上清液0. 6倍體積的異丙醇，輕輕混合到DNA沉淀，16000Xg離心 lOmin，棄上清。
⑦向沉淀中加70%乙醇進(jìn)行清洗，6000Xg離心lOmin，棄上清，待乙醇揮發(fā)干凈后，加入50 μ L雙蒸水進(jìn)行溶解。在-20°c下保存。
根據(jù)菌株16S rDNA保守序列設(shè)計下列引物，并由上海生工生物工程公司合成
上游引物5，-AGTTTGTACATGGCTCAG-3，(SEQID NO 2)
下游引物5，-GTTACCTTGTTACGACTT-3，，(SEQID NO 3)
利用上述引物對該菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μ L
ddw10.75 μLIOxPCR Buffer2.0 μLdNTP mixture2.0 μLMg2+2.0 μLTaq聚合酶0.25 μL引物1 (27F)1.0 μL引物 2 ( 1492R)1.0 μLDNA模板1.0汕(根椐濃度定量)
PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，循環(huán)參數(shù)95°C變性lmin，52°C復(fù)性45s，72°C 延伸1.5min，重復(fù)觀個循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，最后4°C保溫。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，在1500bp附近有清晰條帶。選用條帶清晰的產(chǎn)物進(jìn)行純化。
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，并連接到PMD19-T載體后進(jìn)行測序獲得了該菌株16s rDNA 一級結(jié)構(gòu)的1488bp特征序列(其堿基序列如SEQ IDNO 1所示)。通過在Genebank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索(blast)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. 102P41-la) 的序列同源性為99% (Genebank登記號為Icl | 20339)。
根據(jù)上述特征命名該菌株為鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )ZJU088，保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號3號院中科院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心 (CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4889，保藏時間2011年5月19日。
實施例3菌株抑菌活性的測定
采用管碟法測試鏈霉菌ZJU088對供試菌株的抑菌活性，并設(shè)置霉菌素陽性對照和生理鹽水空白對照。
取1環(huán)經(jīng)活化的上述菌種，接入到種子瓶中，250ml錐形瓶中裝25ml種子培養(yǎng)基， 初始PH值7.0J8°C下200r/min培養(yǎng)Mh，制得種子液；將種子液按10% (ν/ν)接種到 250ml錐形瓶(裝40ml發(fā)酵培養(yǎng)基)中，于pH值7. O，觀°C下200r/min下培養(yǎng)4d后，發(fā)酵液于5000rpm下離心15min，留上清液，以管碟法測定發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌作用，結(jié)果顯示其對白色念珠菌具有較強的抑制作用，抑菌圈直徑約為8mm。
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌菌株，其特征在于，命名為鏈霉菌(Streptomyces sp.) ZJU088，保藏號為 CGMCC No. 4889。
2.如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌ZJU088在抑制白色念珠菌生長中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鏈霉菌菌株及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，該菌株命名為鏈霉菌(Streptomyces sp.)ZJU088，現(xiàn)保藏在普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2011年5月19日，保藏號為CGMCC No.4889。本發(fā)明的鏈霉菌菌株具有很好的抑制真菌的作用，尤其對白色念球菌具有強烈的抑菌作用，對于真菌病的治療具有重要意義。
文檔編號C12N1/20GK102533614SQ20121003879
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者劉超超, 吳綿斌 申請人:浙江大學(xué)