專利名稱：一種基于enu誘變技術(shù)的人類charge綜合癥的小鼠模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得基因Chd7的特異位點突變小鼠模型的方法以及該方法在研究人類CHARGE綜合癥中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小鼠是一種非常好的可用于研究人類疾病的致病病因，分子機制以及治療方法的動物模型。運用表型驅(qū)動的方法高通量篩選化學(xué)誘變或者射線誘變的小鼠來建立人類疾病模型是一種越來越常見的手段。ENU(N-乙基-N-亞硝基脲)是一種強烈的烷基化試劑，可以將自己的乙基轉(zhuǎn)移給DNA中的氧或氮自由基，從而導(dǎo)致DNA堿基錯配和替換。利用ENU 來誘導(dǎo)DNA堿基突變的方法已經(jīng)在美、英、德、日、澳和加拿大等國建立數(shù)以千計的模擬人類出生缺陷、代謝性疾病、自身免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病的模型突變小鼠模型。相關(guān)的致病基因被不斷定位，克隆。相關(guān)的致病機理，治療方法在不斷地研究中。 在國內(nèi)，目前南京大學(xué)模式動物研究所已經(jīng)成功進行了多次ENU誘變，已經(jīng)篩選到了許多突變小鼠品系，包括白內(nèi)障、聽力下降、骨密度異常、肢 體缺陷、打轉(zhuǎn)、癱瘓及毛發(fā)異常等，目前正在對這些小鼠品系進行突變定位以及病理，病因的研究。
CHARGE綜合癥是一種在新生兒中發(fā)病率為1/12000-1/8500的遺傳導(dǎo)致的出生缺陷。其名稱CHARGE概括了該綜合癥的主要表型，包括眼球發(fā)育不全(ocular Coloboma)，心臟缺陷(Heart defects of any type),后鼻孔閉鎖(Atresia of the choanae),生長發(fā)育遲緩(Retarded growth and development),生殖器萎縮(Genital hypoplasia),耳朵異常 (Ear abnormalities)。除此以外,CHARGE綜合癥還具有外顯率不一的一系列異常,包括腭裂，唇裂，面癱，中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，脊柱側(cè)彎，骨骼異常，免疫系統(tǒng)異常等。
CHD7蛋白是一種隸屬于CHD家族的蛋白。CHD家族的蛋白是可以利用ATP水解的能量改變核小體內(nèi)組蛋白與DNA的結(jié)合面的解旋酶。60% -80%的CHARGE綜合癥患者都具有CHD7基因的突變。因此Chd7基因被普遍公認為CHARGE綜合癥的致病基因。帶有Chd7 基因突變的小鼠，其表型與人類CHARGE綜合癥十分相似，因而是一種非常好的人類CHARGE 綜合癥的疾病模型。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠，從而產(chǎn)生一種CHARGE綜合癥動物模型的方法，其中用到變性高效液相色譜分析(DHPLC)方法來鑒定小鼠的基因型。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
步驟一、注射ENU誘變雄性小鼠，注射計量為100mg/kg，注射頻率為每周一次，注射的周期為2-4周，并從注射ENU開始向小鼠飲水中添加SDM ；
步驟二、可育性檢驗，在三個月內(nèi)將注射過ENU的的雄性小鼠與正常雌性小鼠合籠，可育的雄性小鼠被拋棄；
步驟三、篩選基因突變的代謝異常小鼠，將步驟二中三個月內(nèi)不育的雄性小鼠與正常的雌性小鼠合籠，繁殖產(chǎn)生下一代小鼠，對新生小鼠進行表型篩選，得到基因突變的具打轉(zhuǎn)表型的小鼠；
步驟四、通過遺傳連鎖分析和基因克隆測序確定突變位置，將步驟三中所述基因突變小鼠與C3H/HeJ小鼠交配產(chǎn)生I代小鼠，選出有打轉(zhuǎn)表型的I代雌性小鼠與C3H/HeJ 雄性小鼠產(chǎn)生2代小鼠；提取2代小鼠的DNA，并通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫提供的引物進行PCR反應(yīng)， 對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，得到與Chd7位點緊密連鎖的突變位點；
本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用ENU誘變技術(shù)，篩選到了一個新的Chd7基因突變的小鼠品系，命名為COAl小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠的表型與人類CHARGE綜合癥完全一致，從而得到一個從基因到表型完全模仿人類CHARGE綜合癥的優(yōu)秀動物模型，可用于CHARGE綜合癥病因病理研究，治療方式研究及藥物篩選。


圖1為COAl小鼠的基因型鑒定結(jié)果以及基因編碼區(qū)的突變說明。
圖2為COAl小鼠的眼球發(fā)育不全表型。
圖3為COAl小鼠的后鼻孔閉鎖表型。
圖4為COAl小鼠的心臟發(fā)育缺陷(心房中隔缺損，心室中隔缺損)表型。
圖5為COAl小鼠的骨骼發(fā)育異常表型。
圖6為COAl小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的前腦發(fā)育異常表型。
具體實施方式
小鼠的飼養(yǎng)和繁育:C57BL/6J和C3H/Hej購自Jackson實驗室(美國)，飼養(yǎng)在南京大學(xué)模式動物研究所的AALAC認證的SPF級的動物房里。所有的小鼠操作均嚴格按照 “Principles of laboratory animal care”(美國國立衛(wèi)生院發(fā)行號 85-23,1985 修訂版； http://grantsl.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm)和“the care and use of laboratory animals”(美國國家研究理事會，1996).并得到了模式動物研究所動物管理委員會的批準和監(jiān)督。
實施例一
我們通過多聚鏈式擴增反應(yīng)(PCR)技術(shù)對Chd7突變小鼠進行基因型鑒定，基因組DNA中特異地擴增出包含有Chd7基因第四個外顯子的部分，所使用的PCR引物序列為: Chd7-4f:5’ -CGAAGGTGTACGCTAAGTGATG-3’，Chd7-4r:5’ -GTTTCTGTGGGCTCTGGCTC-3’.將所得的PCR產(chǎn)物進行DHPLC分析，含有突變的PCR產(chǎn)物結(jié)果為雙峰，不含突變的PCR產(chǎn)物結(jié)果為單峰。
實施例二
小鼠胚胎前腦組織的形態(tài)學(xué)研究。分別取胚胎期12.5，13.5，15.5，17.5的小鼠胚胎，用4%多聚甲醛固定胚胎，進行大體形態(tài)學(xué)分析。然后將胚胎用梯 度酒精脫水，并用用石蠟包埋，進行連續(xù)切片以及HE染色。在高倍顯微鏡下觀察突變小鼠胚胎和野生型小鼠胚胎前腦組織形態(tài)的差異。
實施例三
小鼠胚胎前腦中線組織的細胞凋亡情況的研究。取胚胎期10.5的小鼠胚胎，用 4%多聚甲醛固定胚胎，然后將胚胎用梯度酒精脫水，并用用石蠟包埋，進行連續(xù)切片。然后用PR0MEGA的檢測細胞凋亡的試劑盒檢測小鼠前腦切片中線部位的細胞凋亡情況。也可以取胚胎期10.5的小鼠胚胎，直接將其置于預(yù)先配好的Nile blue的染液中，37度放置30-45 分鐘，然后將胚胎取出放到PBS中，4度過夜，待非特異性背景藍色褪去后，立即在體視鏡下觀察分析小鼠前腦切片中線部位的細胞凋亡情況
實施例四
用原位雜交技術(shù)分析小鼠胚胎前腦的分子表達水平，從而分析小鼠胚胎前腦發(fā)育異常的機制機理。
步驟一、取胚胎期9.5或者10.5的小鼠胚胎，用4%多聚甲醛固定胚胎，然后將胚胎用梯度甲醇脫水，然后復(fù)水。
步驟二、復(fù)水之后用5%的雙氧水進行漂白。用蛋白酶K適量消化組織蛋白，之后用4%多聚甲醛0.25%戊二醛進行后固定。
步驟三、先用預(yù)雜交液在65攝氏度與雜交，然后用基因特異性的探針在65攝氏度孵育16-20小時。
步驟四、用羅氏(roche)公司購買的洗脫液清洗胚胎，然后與購于羅氏公司的抗地高辛的抗體在4攝氏度孵育16-20小時。
步驟五、用可以去內(nèi)源性堿性磷酸酶的清洗液清洗胚胎，然后與購于羅氏公司的的顯色底物在4攝氏度孵育。每隔I個小時觀察一次。等到顯色反應(yīng)進行得充分時，終止反應(yīng)。
步驟五、用梯度甲醇脫水復(fù)水胚胎，最后放在50%的甘油中，并于體式鏡下觀察拍照。一共可以運用Bmp4, Shh, Fgf8, Foxgl, Ttr, Lhx2, Dlx5等基因的探針分析這些基因在突變胚胎以及野生型胚胎中的表達水平以及表達區(qū)域。
除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍 。
權(quán)利要求
1.一種基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠模型的方法，其特征在于包括如下步驟步驟一、注射ENU誘變雄性小鼠，注射計量為100mg/kg，注射頻率為每周一次，注射的周期為2-4周，并從注射ENU開始向小鼠飲水中添加SDM ；步驟二、可育性檢驗，在三個月內(nèi)將注射過ENU的的雄性小鼠與正常雌性小鼠合籠，可育的雄性小鼠被拋棄；步驟三、篩選基因突變的代謝異常小鼠，將步驟二中三個月內(nèi)不育的雄性小鼠與正常的雌性小鼠合籠，繁殖產(chǎn)生下一代小鼠，對新生小鼠進行表型篩選，得到基因突變的具打轉(zhuǎn)表型的小鼠；步驟四、通過遺傳連鎖分析和基因克隆測序確定突變位置，將步驟三中所述基因突變小鼠與C3H/HeJ小鼠交配產(chǎn)生I代小鼠，選出有打轉(zhuǎn)表型的I代雌性小鼠與C3H/HeJ雄性小鼠產(chǎn)生2代小鼠；提取2代小鼠的DNA，并通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫提供的引物進行PCR反應(yīng)，對 PCR產(chǎn)物進行電泳分離，得到與Chd7位點緊密連鎖的突變位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠模型的方法，其特征在于該小鼠表現(xiàn)出眼球發(fā)育不全，聽力缺陷，生殖力缺陷，打轉(zhuǎn)，嗅覺缺陷，前腦發(fā)育缺陷，心臟發(fā)育缺陷，后鼻孔閉鎖等完全模擬人類CHARGE綜合癥的表型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠模型的方法，其特征在于突變位點位于小鼠的四號染色體Chd7基因的第四個外顯子上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠模型的方法，其特征在于所述步驟四中小鼠的基因型包括純合子、雜合子與野生型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠模型的方法，在研究人類CHARGE綜合癥中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于ENU誘變技術(shù)產(chǎn)生Chd7基因突變的小鼠模型的方法，在篩選Bmp4激動劑藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及獲得基因Chd7的特異位點突變小鼠模型的方法以及該方法在研究人類CHARGE綜合癥和篩選Bmp4激動劑類藥物中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括如下步驟通過ENU注射C57BL/6J雄鼠，在通過不育檢測后，這些雄鼠與正常B6雌鼠交配產(chǎn)生G1代小鼠，在G1代小鼠中，篩選出有打轉(zhuǎn)表型的小鼠品系，通過遺傳連鎖分析和基因克隆測序，將突變位點定位到小鼠染色體的特定位置，并確定突變基因和突變位置；并通過對Chd7基因突變小鼠進行表型分析，得出該Chd7突變小鼠完全模擬人類CHARGE綜合癥的表型，是一種非常好的人類CHARGE綜合癥的模型小鼠的結(jié)論。該小鼠模型可用于進一步人類CHARGE綜合癥的病因病理研究以及對CHARGE綜合癥治療方法和藥物的篩選。
文檔編號C12Q1/68GK103250682SQ20121003791
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者蔣璇, 林兆宇, 冼黎, 陳維倩, 高翔 申請人:南京大學(xué)