專利名稱：一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因， 含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主以及利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該基因的表達(dá)產(chǎn)物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
亞硝酸鹽還原酶是一類催化亞硝酸鹽還原的酶。亞硝酸鹽廣泛存在于腌制或新鮮食物以飼料中。食品中亞硝酸鹽的過(guò)量，會(huì)使血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，降低血液的載氧能力，造成高鐵血紅蛋白血癥，對(duì)人體造成嚴(yán)重危害。亞硝酸鹽還可在人體內(nèi)與仲胺、 叔胺和氨基化合物反應(yīng)形成強(qiáng)致癌物亞硝胺化合物，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。鑒于食品中超標(biāo)亞硝酸鹽污染可引起食品安全問(wèn)題，人們正在努力尋找有效控制或降解亞硝酸鹽的方法，生物酶法消除食品亞硝酸鹽是一條可行的途徑。迄今，有不少報(bào)道認(rèn)為植物乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的能力，并推測(cè)植物乳酸菌降解亞硝酸鹽與所含的亞硝酸鹽還原酶有關(guān)。然而，目前植物乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的基因及其基因編碼的酶蛋白序列還未見(jiàn)研究報(bào)道。參考文獻(xiàn)王琦，李悅鵬，婁峰閣.亞硝酸鹽的危害及其替代物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)飲食衛(wèi)生與健康，2005，2 (9) :36-37孫菲菲，蔣芳玲，侯喜林，李英等.白菜亞硝酸還原酶基因BcNiR的克隆及表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2009，36 (10) 1511-1518Eugene J. Mitacek, Klaus D. Brunnemann, Maitree Suttaj it, Lee S. Caplan. Geographic Distribution of Liver and Stomach Cancers in Thailand in Relation to Estimated Dietary Intake of Nitrate, Nitrite, and Nitrosodimethylamine[J]. Nutrition and Cancer, 60:2，196-203龔鋼明，管世敏，邵海，呂玉濤.降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離鑒定[J].食品工業(yè)， 2009(5) :12-13G. Wolf, W. P. Hammes. Effect of hematin on the activities of nitrite reductase and catalase in lactobacilli[J]. Arch Microbiol (1988) 149: 220 -224Krishna P. Rai, Chunhui Zhang, Wen Shui Xia. Effects of pure starter cultures on physico-chemical and sensory quality of dry fermented Chinese-style sausage[J], Food Sci Technol, 2010, 47(2) :188 - 194陳燕紅，程萍，喻國(guó)輝，潘麗晶.沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris 2-8的亞硝酸鹽還原酶基因克隆和序列分析[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38(5): 647 653Braker G, Fesefeldt A, Witzel KP. Development of PCR primer systems foramplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples[P]. Applied and Environmental Microbiology, 1998，64(10) : 3769 3775. Lima I, Moreira S M, Osten J R V, et al. Biochemical responses of the marine mussel Myfilus gal loprovincialis to petrochemical environmental contamination along the North-western coast of Portugal [J]. Chemosphere, 2006， 66 (7) :1230-1242. Danes V, Alhama J, Navas JI, et al. Ecotoxicological effects of metal pollution in two mollusc species from the Spanish South Atlantic littoral [ J]. Environ Poll, 2006，139 :214-223. Antonio T, Carlos M. Environmental impacts of intensive aquaculture culture in marine waters[J]. Water Research, 2000 , 34(1):334-342。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一為了解決上述的問(wèn)題而提供一種人工合成的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因；
本發(fā)明的目的之二提供了一種由上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的之三是提供含有上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因轉(zhuǎn)化而成的質(zhì)粒。本發(fā)明的目的之四在于提供了一種含有上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的重組大腸桿菌。本發(fā)明的技術(shù)原理
以金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌；大腸桿菌等的亞硝酸鹽還原酶基因?yàn)閰⒖?，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用植物乳桿菌提取的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因片段，將該片的連接到pET-32a ( + )表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶(NiRL)蛋白表達(dá)， 獲得植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因，其堿基序列如SEQ ID NO: 1的多核苷酸； 含有上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因的重組質(zhì)粒。上述的重組質(zhì)粒優(yōu)選為pET_32a ( + ) - NiRL質(zhì)粒，其中所用的載體pET_32a ( + ) 還可以采用常用的其他PET、pKK223-3或ρΗΤ載體替代。當(dāng)選用PET載體時(shí)，可以選用大腸桿菌或枯草桿菌表達(dá)，當(dāng)選用ΡΚΚ223-3載體時(shí)要用大腸桿菌JM105表達(dá)，而當(dāng)選用ρΗΤ載體時(shí)要用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)。所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而成的重組微生物，所述的重組微生物為重組大腸桿菌或重組枯草桿菌，且所述的重組大腸桿菌優(yōu)選為Ε. coliBL21 (DE3)或JM105。利用上述的重組大腸桿菌或重組枯草桿菌生產(chǎn)的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶，該還原酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
本發(fā)明的技術(shù)效果
本發(fā)明通過(guò)以金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌；大腸桿菌等的亞硝酸鹽還原酶基因?yàn)閰⒖?，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用植物乳桿菌提取的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因片段，將該片的連接到pET-32a ( + )表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶(NiRL) 蛋白表達(dá)，從而獲得了一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白。另外，所得的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白可以用于處理肉腌制品或飼料中過(guò)量的亞硝酸鹽殘留，也可以用于植物乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的分子結(jié)構(gòu)等理論研究。


圖1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定圖，其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 =PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2 陰性對(duì)
照?qǐng)D2、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖，其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 雙酶切重組質(zhì)粒； 圖3、PCR產(chǎn)物鑒定圖，其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2 陰性對(duì)照； 圖4、重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后菌體全蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)，其中M 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)； 1 誘導(dǎo)后重組菌體全蛋白；2 誘導(dǎo)后非重組菌體全蛋白；
圖5、實(shí)施例4含有植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白提取液的酶活性測(cè)定結(jié)果； 圖6、實(shí)施例4無(wú)植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白提取液的酶活性測(cè)定的陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，僅僅是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說(shuō)明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明。本發(fā)明所用的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司； IPTG、Ampici 11 in購(gòu)自上海生工生物公司；
回收試劑盒購(gòu)自BI0MIGA公司；
Taq DNA聚合酶、high ligation連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I ,Xho I、Hind III均購(gòu)自Fermentas公司；
其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。本發(fā)明所用的植物乳桿菌(Lac ο如以7ΛΛ5 /^a/ iar腫)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心(保藏編號(hào)CCTCC NO 22708)；
本發(fā)明所用的大腸桿菌E. coli TGU E. coli BL21 (DE3)及質(zhì)粒pET_32a ( + )由本實(shí)驗(yàn)室保存。本發(fā)明所用的設(shè)備
TGL-160冷凍離心機(jī)為上海恒科儀器有限公司；
SHP-150s生化培養(yǎng)箱HWS12電熱恒溫水浴、酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo Fisher公司； SYQ-DSX-280型滅菌鍋、Tan Gis 1000凝膠電泳圖成像系統(tǒng)為上海天能科技有限公
司；
SUB_Cell GT電泳儀為美國(guó)BIO-RAD公司；
SG412壓力蒸汽式滅菌鍋為上海華線醫(yī)用儀器有限公司。
本發(fā)明最終所得的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的酶活測(cè)定方法參照GENMED公司細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶總活性比色測(cè)定法進(jìn)行。實(shí)施例1
一種人工合成的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因，其堿基序列如SEQ ID N0:1，該序列通過(guò)如下方式獲得
(1)、PCR引物設(shè)計(jì)
以金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌I3SeudomonaS aeruginosa、布魯氏桿菌；大腸桿菌hcherichia coli的亞硝酸鹽還原酶基因?yàn)閰⒖?，設(shè)計(jì)出PCR引物即上游引物為 5’ GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG3，(BamH I )，見(jiàn) SEQ ID NO:3，下游引物為 5' CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG3' (Xho I)，見(jiàn) SEQ ID N0:4，并人工合成；
(2)、植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA的提取
①、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)(保藏編號(hào)CCTCC NO 22708)培養(yǎng)物 5000r/min,離心15min，棄上清，取沉淀(菌體)0. 05g置1. 5ml EP中，加Iml TE緩沖液，使沉淀懸浮均勻后，于12000r/min，離心10 min，棄上清，再加入Iml TE緩沖液，使沉淀重懸， 13000r/m,離心IOmin ；重復(fù)上述步驟2次，收集沉淀；
②、沉淀物中加入200μ 1 TE緩沖液，使沉淀懸浮均勻后，加入300 μ 1溶菌酶溶液，混勻，于37°C保溫lh，再加入10 μ 1蛋白酶K溶液和200 μ 1 5% SDS,混勻，55°C保溫30min。 取去置于冰浴中冷卻anin，于12000r/m，離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)滅菌的EP管中；
③、加入與上清液等體積的飽和酚，使之混勻，于12000rpm離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中，再加入等體積的酚-氯仿，使之混勻，12000r/m離心5min，將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈的EP管中，加入等體積的氯仿，使之混勻，12000r/m離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈的EP管中；
④、加入上清液0.1倍體積的5mol/L NaCl溶液和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混勻，0°C下放置Ih;
⑤、于12000r/m離心lOmin，棄上清液，向沉淀中加入Iml70%乙醇，輕輕混勻洗滌沉淀，12000r/m，離心lOmin，棄上清；
重復(fù)該步驟⑤一次，棄上清并吸干；
⑥、沉淀于37°C放置5min，使殘留乙醇揮發(fā)，沉淀用50μ 1 TE懸浮均勻，即得到植物乳桿菌基因組DNA提取物，樣品置-20°C保存待用；
(3)、目的基因的擴(kuò)增
以實(shí)施例1中步驟(2)的⑥提取的植物乳桿菌基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45s，61°C退火45s，72°C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，得PCR擴(kuò)展的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組 DNA ；
用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)目的基因PCR產(chǎn)物；電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1，在1600附近有一條明顯的DNA條帶，即為上述所得的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA。實(shí)施例2
含有實(shí)施例1所得的PCR擴(kuò)展的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA的重組表達(dá)載體的構(gòu)建，步驟如下
將實(shí)施例1所得的PCR擴(kuò)展的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA與pET-32a( + ) 表達(dá)載體連接，室溫反應(yīng)30 min，然后80°C保溫10 min，冷卻至4°C，得到連接產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID Ν0:1ο
2.含有如權(quán)利要求1所述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因的重組質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒為pET-32a( + ) - NiRL質(zhì)粒。
4.利用如權(quán)利要求2或3所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而成的重組微生物。
5.如權(quán)利要求4所述的重組微生物，其特征在于所述的重組微生物為重組大腸桿菌或重組枯草桿菌。
6.如權(quán)利要求5所述的重組微生物，其特征在于所述的重組大腸桿菌優(yōu)選為含有重組質(zhì)粒為 pET-32a ( + ) - NiRL 的 E. coliBL21 (DE3)或 JM105。
7.利用如權(quán)利要求6所述的重組微生物生產(chǎn)的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶，其特征在于該還原酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因，含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主以及利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該基因的表達(dá)產(chǎn)物及其應(yīng)用。即以金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌;大腸桿菌的亞硝酸鹽還原酶基因?yàn)閰⒖?，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用植物乳桿菌提取的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因片段，將該片的連接到pET-32a(+)表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶(NiRL)蛋白表達(dá)，從而獲得植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102559715SQ20121003777
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者何婷婷, 高然, 龔鋼明 申請(qǐng)人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院