專利名稱：：一種dna的多點定向突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及一種DNA的多點定向突變方法，與基因體外誘變技術(shù)有關(guān)。
背景技術(shù)：
：基因誘變是改造生物體最直接有效的方法，它的發(fā)展經(jīng)過了從整體(細(xì)胞)誘變到局部(基因)誘變，從體內(nèi)的隨機(jī)誘變到體外的定點誘變。體外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是改造、優(yōu)化基因常用的手段。該技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，如研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性，改造啟動子或者DM作用元件，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性，研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等方面。對于單一位點的突變，常采用的方法是寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變、盒式誘變以及PCR介導(dǎo)的定點突變(羅師平，冷希岡.基于PCR的體外誘變技術(shù).國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊，2005,3:188-192.)。PCR介導(dǎo)的定點突變技術(shù)由于其快速、簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點，得到了廣泛的應(yīng)用，其主要方法包括重疊延伸PCR介導(dǎo)的定點突變以及環(huán)狀誘變PCR。而對于多位點的定向突變，目前主要采用多位點的環(huán)狀誘變PCR,其優(yōu)點是無需亞克隆，但由于其要擴(kuò)增整個質(zhì)粒，因而需要保真度好且擴(kuò)增效率高的DNA聚合酶，并且同時引入多個突變的效率并不高(如Stratagene公司推出的QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesiskit,其同時引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%)。本發(fā)明通過改進(jìn)重疊延伸PCR的反應(yīng)條件，提高了同時引進(jìn)多點突變的頻率，為體外多點定向突變提供了一種簡單高效的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提高同時引入多點突變的頻率。以重疊延伸PCR為基礎(chǔ)，通過改進(jìn)引物設(shè)計方法，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，成倍提高了同時引入多點突變的頻率，為在實驗室進(jìn)行體外多點定向突變操作提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。本發(fā)明通過以下方式實現(xiàn)在任何一個基因的兩端各設(shè)計一條包含酶切位點的引物，在需突變的位點設(shè)計一對特異引物。在第一輪PCR之前，先進(jìn)行特異引物的單向PCR，再經(jīng)過多輪PCR過程，得到全長基因并克隆測序。其具體步驟如下1、引物設(shè)計根據(jù)需突變位點序列，設(shè)計一對特異引物，其中，引物中的突變位點5'端為10個堿基，3'端為20個堿基左右，因此同一突變位點的一對引物之間重疊序列為21個堿基。引物設(shè)計如附圖l所示。2、第一輪PCR此輪PCR分為單向PCR與常規(guī)PCR兩個階段單向PCR:1)反應(yīng)體系在25ulPCR反應(yīng)液中，含有30ng模板DNA,2.5ulPCR緩沖液(購自TOYOBO，卜"同)，1u125mMMgS04,2.5ul2mMdNTPs,1.5ul10pmol/ul引物，0.5UKOD-Plus(TOYOBO〉;2)反應(yīng)程序94。C2min;94。C15sec，55。C30sec，68°C1min,5個循環(huán)。常規(guī)PCR:1)反應(yīng)體系按P1和P4、P3和P6、P5和P8、P7和P2的組合，將單向PCR反應(yīng)產(chǎn)物加在一起；2)反應(yīng)程序94。C2min;94。C15sec,55。C30sec，68。C1min，30個循環(huán);及后延伸68。C5min;33)分別回收PCR產(chǎn)物P1P4、P3P6、P5P8、P7P2。3、第二輪PCR將第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋100倍作為此輪PCR反應(yīng)的模板，按照P1P4、P3P6(引物Pl和P6)與P5P8、P7P2(引物P5和P8)的組合進(jìn)行。1)反應(yīng)體系在50ulPCR反應(yīng)液中，含有兩種模板DNA各1ul,5ulPCR緩沖液，2ul25mMMgS04,5ul2mMdNTPs,1.5ul10pmol/ul引物1,1.5u110pmol/ul引物2,1UKOD-Plus(TOYOBO);2)反應(yīng)程序94。C2min;94。C15sec，55。C30sec,68。Clmin，35個循環(huán);及后延伸68。C5min;3)回收PCR產(chǎn)物P1P6、P5P2。3、第三輪PCR將第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍作為此輪PCR反應(yīng)的模板。1)反應(yīng)體系在50ulPCR反應(yīng)液中，含有兩種模板DNA各1ul，5ulPCR緩沖液，2ul25mMMgS04,5ul2mMdNTPs，1.5ul10pmol/ulPl，1.5ul10pmol/ulP2,1UKOD-Plus(TOYOBO);2)反應(yīng)程序94°C2min;94°C15sec,55°C30sec,68°C2min，35個循環(huán);及后延伸68°C5min;3)岡收PCR產(chǎn)物；4)酶切產(chǎn)物；5)克隆測序。如果期望得到的基閑突變位點更多，所述的PCR的次數(shù)應(yīng)相應(yīng)增加，其反應(yīng)程序同上述的反應(yīng)程序。本發(fā)明的特點本發(fā)明在PCR引物序列中導(dǎo)入突變堿基，用于單向PCR反應(yīng)，擴(kuò)增堿基發(fā)生突變的DNA單鏈分子，以增加突變DNA分子模板量，然后加入另一個PCR引物進(jìn)行雙向擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量序列突變的雙鏈DNA分子，從而使在隨后的PCR反應(yīng)中，攜帶突變堿基的引物能與突變DNA模板優(yōu)先復(fù)性，大量擴(kuò)增已經(jīng)突變的DNA分子。將含不同突變的DNA片段用于重疊延伸PCR反應(yīng)，擴(kuò)增全長基因序列。同時在引物設(shè)計時，不采用重疊延伸PCR設(shè)計兩條完全互補(bǔ)引物的常規(guī)原則，而是設(shè)計兩條部分互補(bǔ)的引物，延長突變位點3'端的引物長度，減少5'端引物的堿基數(shù)，這樣既保證了引物與模板的結(jié)合，也保證了重疊延伸過程中，重疊片段間的結(jié)合穩(wěn)定性。這種突變方法可成倍提髙突變頻率。圖1，是本發(fā)明PCR引物介導(dǎo)的多點突變示例。圖2,是第一輪PCR產(chǎn)物回收后檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3，是第一輪PCR產(chǎn)物回收后檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4，是第二輪PCR產(chǎn)物回收后檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖5，是本發(fā)明一個具體實施例中擬南芥叩rl基因的定向突變的DNA序列，圖5序列中加粗和下劃線的堿基為突變位點。圖6，是本發(fā)明設(shè)計的編號為Pl-P8的引物序列，Pl和P2序列中帶下劃線的序列為限制性內(nèi)切酶位點，P3-P8序列中加粗以及下劃線的位點為突變位點。具體實施例方式實施例l擬南芥nprl基因的定向突變從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中經(jīng)RT-PCR獲得的如圖5所示的nprl基因，定向突變前附圖5基因序列中加粗顯示的位點與GenBank中的來自哥倫比亞生態(tài)型擬南芥nprl基因序列(Genebank登陸號AccessionNo.:U76707)不一致，采用以下步驟和附圖6所示的引物對所述的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥nprl基閔進(jìn)行定向突變。1)單向PCR:反應(yīng)體系P3—P8P1—P2IOXPCR緩沖液2.5ul2.5uldNTPs(2mM)2.5ul2.5ulMgS04(25mM)1ul1ulPrimer(10pmol/ul)1.5ul1.5ulKOD-Plus(1U/ul)0.5ul0.5ul模板DNA30ng/ddH20補(bǔ)至25ul補(bǔ)至25ul擴(kuò)增條件94°C2min;94°C15see,55°C30sec,68°C1min，5個循環(huán)。2)雙向PCR第一輪PCR:將單向PCR產(chǎn)物按照如圖6所示的PI和P4、P3和P6、P5和P8、P7和P2的引物組合合并為50ul體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件94°C2min;94°C15sec,55°C30sec，68°C1min,30個循環(huán)；及后延伸68。C5min;回收PCR產(chǎn)物P1P4、P3P6、P5P8、P7P2(見附圖2)。第二輪PCR:上一輪PCR產(chǎn)物稀釋IOO倍，作為此輪PCR反應(yīng)的模板，每一反應(yīng)中加入重疊互補(bǔ)的兩個模板，并加入兩端引物，按照P1P4、P3P6(引物P1、P6)和P5P8、P7P2(引物P5、P2)的組合進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系IOXPCR緩沖液5uldNTPs(2mM)5ulMgS04(25mM)2ulPrimed(10pmol/ul)1.5ulPrimer2(10pmol/ul)1.5ulKOD-Plus(1U/ul)1ul模板11ul模板21ulddH20補(bǔ)至50ul擴(kuò)增條件94°C2min;94°C15sec,55°C30sec,68。C1min,35個循環(huán);及后延伸68°C5min;回收PCR產(chǎn)物P1P6、P5P2(附圖3)。第三輪PCR:P1P6和P5P2稀釋100倍作為此輪PCR反應(yīng)的模板，引物為Pl和P2,反應(yīng)體系同上，擴(kuò)增條件94°C2min;94°C15sec，55°C30sec，68°C2min，35個循環(huán)；及后延伸68°C5min;回收產(chǎn)物叩rl(附圖4)，SmaI和SacI酶切，克隆至pBluescript中，挑取2個克隆測序，結(jié)果表明2個克隆均為四個位點產(chǎn)生預(yù)期突變。突變后上述堿基與GenBank中的來自哥倫比亞生態(tài)型擬南芥nprl基因序列(Genebank登陸號AccessionNo.:U76707)保持一致，從而成功地完成了本發(fā)明的任務(wù)。而采用常規(guī)重疊延伸PCR，同樣挑取2個克隆測序，測序結(jié)果表明，2個克隆均只有一個位點發(fā)生突變(如表1所示)。表1本發(fā)明方法與常規(guī)重疊延伸PCR突變效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求1、一種DNA分子多點定向突變的方法，包括重疊延伸PCR步驟，其特征在于，在所述的重疊延伸PCR之前增加一個單向PCR步驟即在期望的基因突變位點處設(shè)計一對特異引物，每一條特異引物先進(jìn)行單向PCR，按照編號為P1與P4，P3與P6，P5與P8，P7與P2的組合將單向PCR產(chǎn)物合并后，進(jìn)行第一輪PCR，產(chǎn)物為含有不同突變位點的DNA片段；以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪PCR；再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第三輪PCR，得到全長基因序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的特異引物P3、P4、P5、P6、P7和P8的序列如下所示，P3:5，—ctctttcttcaagagcgctttagccgccgct—3,;P4:5'—aaagcgctcttgaagaaagagcttctcgctg—3';P5:5，—gagttagtcaagttgcttttgaaagaggatc—3';P6:5，—caaaagcaacttgactaactcaatatcatcc—3，；P7:5，—aattaggaaattcgtccctgacagattcgacttcttccacatcga—3，；P8:5'—tctgtcagggacgaatttcctaattccaaattgtcctcactaaag—3'。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單向PCR步驟如下1)反應(yīng)體系在25ulPCR反應(yīng)液中，含有30ng模板DNA,2.5ulPCR緩沖液，1ul25mMMgS04,2.5ul2mMdNTPs，1.5ul10pmol/ul特異引物，0.5UKOD-Plus;2)擴(kuò)增條件94'C2min;94。C15sec，55。C30sec，68°C1min，共5個循環(huán)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一輪PCR的擴(kuò)增條件是94'C2min;94°C15sec，55°C30sec，68°C1min，30個循環(huán)，后延伸68。C5min并回收PCR產(chǎn)物。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第二、三輪PCR的模板是將回收后的產(chǎn)物稀釋100倍使用。6、權(quán)利要求l所述的方法在基因定向誘變中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種DNA的多點定向突變方法。本發(fā)明利用單向PCR反應(yīng)，特異擴(kuò)增突變序列，增加突變模板量；再結(jié)合重疊延伸PCR，獲得定向多點高頻率DNA突變；在這一反應(yīng)體系中，改變引物設(shè)計方法，使之既利于與模板復(fù)性，又利于片段間的重疊延伸，從而提高突變頻率。本發(fā)明為體外定向誘變DNA提供了一種簡單有效的方法。文檔編號C12N15/11GK101096669SQ20071005227公開日2008年1月2日申請日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日發(fā)明者劉春雷,廖玉才,李和平,濤黃申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)