專利名稱:從培養(yǎng)細胞產生克隆胚胎和成年動物的方法
發(fā)明技術領域：
描述了一種從體外培養(yǎng)的細胞克隆胚胎和成活后代的方法。優(yōu)選地，該細胞是建立的細胞系，更優(yōu)選它們是胚胎干(ES)細胞。也公開了來自克隆源胚胎的細胞系。我們描述了本發(fā)明不同的方案，表明該方法不是非常依賴于核供體細胞的細胞周期或基因組含量。該方法在產生具有或不具有定向突變的克隆來源組織和生物中有潛在的用途。這種潛在性比現有技術更大，因為現有技術不能使單個細胞從已建立的細胞系執(zhí)行完整胚胎發(fā)育到足月的程序。
最近，發(fā)展了一種獨特的克隆方法，其中首先選擇來自成年哺乳動物組織的供體細胞核，然后顯微注射到去核卵母細胞中(Wakayama等，Nature 394，369
)。顯微注射法能用于生產能被選擇性遺傳改造的存活胚胎、活后代和健康成年動物。這個核轉移方法的應用已經使采用成年來源的丘細胞克隆雌性動物(Wakayama等，Nature 394，369
)和尾來源細胞克隆雄性動物(Wakayama和Yanagimachi，NatureGenet.22，127
)的活產后代的克隆可行。用表型和基因組分析已經嚴格證實了這些動物的克隆起源(Wakayama等，Nature394，369
)。
迄今為止，細胞融合和顯微注射法都存在缺點，它們描述使用新鮮分離的細胞或來自原代的，常常不清楚的細胞培養(yǎng)物作為核供體。這部分是由于培養(yǎng)細胞的外遺傳不穩(wěn)定性(Dean等，Development 125，2273
)。任何規(guī)避了這些問題的克隆方法將允許細胞在被用作克隆方法中的核供體前，在體外被改造。這將具有重大的實用性它將，例如，允許含有基因組定向突變克隆的產生和允許克隆祖先細胞的長期貯存。
培養(yǎng)的胚胎干(ES)細胞(如ES細胞系)來自胚泡的內細胞團(ICM)，并在體外顯示出罕見的核型和細胞遺傳學穩(wěn)定性(Evans等，Nature292，154
；Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國78，7634
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[ColdSpring Harbor Laboratory Press]，173-181頁
)。小鼠ES細胞顯示發(fā)育多潛能當被轉移至小鼠胚胎時，它們能產生含有細胞類型方面明顯無限制的ES細胞貢獻的嵌合后代(Hogan等，Manipulating themouse embryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，173-181頁
；Bradley等，Nature 309，255
)。然而，對于完全由ES細胞發(fā)育為個體，它們必須與來自發(fā)育中胚胎的異源細胞相伴(因此，該胚胎是嵌合的)。該異源細胞來自二倍體(Bradley等，Nature309，255
；Hooper等，Nature 326，292
)或四倍體(Nagy等，Development 110，815
；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國90，8424
；Zang等，Mech.Dev.62，137
)胚胎。除非ES細胞被發(fā)育中胚胎的異源細胞拯救，否則ES細胞不可能進行足月胚胎發(fā)育。這是使用ES細胞的一個主要缺點，因為它們不能指導能夠向足月發(fā)育進展的胚胎發(fā)育；因此由它們產生的后代先前必然是嵌合的。這就使得必需漫長的育種程序以獲得僅僅來自ES細胞的后代。
ES細胞可用于將定向基因組改變導入動物。ES細胞基因尋靶已經被廣泛用于創(chuàng)造帶有定向突變的多種小鼠品系(Capecchi，Science244，1288
)；Ramirez-Solis等，Mets.Enzymol.225，855-878
)。定向突變的導入利用同源重組來“剔除”或“引入(knock in)”基因組的靶片段，以用新來的基因替換它們。突變的表型效果可由選擇引入基因來制定，可以完全改變表型，或細微改變。來自ES細胞的克隆動物能夠結合基因尋靶和動物克隆的優(yōu)點，利于基因打靶動物的生產。如果來自ES細胞的核-甚至在體外長期培養(yǎng)的-能用于生產有活力的、可繁殖的克隆動物的話，它們將是通過克隆改造哺乳動物基因組的最佳選擇。然而，以前的一些困難已經包括開發(fā)適當的培養(yǎng)和選擇步驟以有效允許在尋靶步驟而不是隨機DNA修飾中ES細胞的選擇。
現有技術尚未證明任何培養(yǎng)的ES細胞系，或ES細胞樣細胞系或其它已建立的細胞系能指導核轉移后完整發(fā)育，盡管核轉移已經用于生產綿羊、牛和山羊。例如，Campbell等(Nature 380，64
)已經報道采用核轉移，從短期培養(yǎng)的、胚胎源上皮細胞通過細胞融合方法克隆綿羊；然而，這些細胞表達與分化和細胞定型關聯的標記，因此明顯不是ES細胞。
Stice等(WO 95/17500)已經報道用同代來源的、低傳代的ES細胞樣細胞的膜融合核轉移來生產牛胚胎。Stice等沒有提供他們在從這些或任何其它ES細胞樣細胞生產后代(活或仍活產)中，核轉移方法成功的實施例，因為所有受孕在妊娠60天前均流產；母牛最長的妊娠是55天，平均妊娠期280天。
Tsunoda and Kato(J.Reprod.Fert.98，537
)報道了與來自已經傳代11-20次的細胞系的ES細胞核融合(用副流感病毒和電融合)的小鼠去核卵在體外至雙細胞、四細胞、桑椹胚和胚泡期的發(fā)育。然而，用所得胚胎向替代母親轉移后沒有獲得活胎兒。
與此顯著不同，現在公開的本發(fā)明的方法允許從單個培養(yǎng)細胞的核產生活后代。
發(fā)明概述這里描述的發(fā)明提供了這些缺點的解決方法。它提供了一種從單個重建的細胞克隆繁殖(例如，以完整動物的形式)分化細胞的方法。供體核典型地插入去核受體細胞如，卵母細胞或卵裂球中，并產生重建細胞。所得重建細胞的發(fā)育被啟動和培養(yǎng)。因此，在相關的實施方案中，本發(fā)明提供了(i)從ES細胞，通過將ES細胞的核內容物插入去核卵母細胞的細胞質中，并允許重建細胞分化，而克隆地衍生胚胎，和(ii)該方法產生的培養(yǎng)細胞或動物。
在一個實施方案中，所得重建細胞的分化沿著一個或多個導致產生各種不同細胞類型的特定的途徑進行。在另一個實施方案中，所得重建細胞發(fā)育為胚胎，該胚胎接著發(fā)育為有活力的活產后代。這里使用的術語“核”意指包含整個核或其一部分，其中核內容物至少包括能夠在缺乏任何其它非線粒體基因組的細胞中指導發(fā)育的最少物質。所得組織是由提供用于注射到去核卵母細胞中的核的細胞(核供體)克隆得到的；該步驟產生后代時，該后代是來自核供體細胞的克隆。
因此，本發(fā)明提供了通過將培養(yǎng)的ES細胞系的細胞核插入去核卵母細胞中，由ES細胞系克隆動物的方法。核供體可來自構建成熟的細胞系，或可來自新產生的細胞系。在一些動物如哺乳動物中，大多數構建的ES細胞系會源于雄性；即，它們擁有XY核型。相反，在鳥類中，大多數構建的ES細胞系會源于雌性；即，它們擁有XX核型。來自這種XY細胞系的完整動物克隆因此反映了這個起源并且是雄性。相應地，在核供體來自源于雌性的細胞系的實施方案中，產生具有XX核型的完整動物克隆并且其是雌性，反之對于來自XY核型的ES細胞的動物亦然。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的細胞來自除小鼠之外的物種，包括但不限于下組中的那些靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids和鼠的其它嚙齒動物。在一個有利實施方案中，ES細胞樣細胞來自這些物種胚泡的ICM。
在進一步的實施方案中，就在使用待提供核供體細胞的ES細胞前，構建該細胞。在一個有利實施方案中，在ES細胞用于產生克隆來源細胞，如克隆動物前，進行遺傳修飾。
ES細胞核轉移后重建的細胞可在體外培養(yǎng)后發(fā)育為胚泡，或在體內可實施這種發(fā)育，如，對于豬而言。在一個實施方案中，胚泡可轉移到適當的代孕母親中，產生來自重建細胞的克隆動物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明方法的克隆來源的桑椹胚或胚泡可以，反過來，與來自最初用于提供核供體以產生克隆來源胚胎的培養(yǎng)物的ES細胞聚集(或注射該ES細胞)。這產生其細胞部分來自克隆胚胎、部分來自培養(yǎng)ES細胞的注射/聚集細胞的胚胎。這些聚集和注射的方法是本領域熟練技術人員中建立成熟的，并且原則上與在標準基因尋靶方法中用于產生嵌合胚胎的相同(Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，189-216頁
；Joyner[ed]，Gene targeting.[Oxford University Press]，107-146頁
)。然而，現在公開的本發(fā)明的方法產生的胚胎的核基因組不是嵌合的，因為所得活后代來自遺傳上等同的ES細胞。該方法的這個實施方案提高了由ES細胞生產克隆活后代的效率。
在進一步的實施方案中，用本發(fā)明方法克隆得到的桑椹胚或胚泡可用作干細胞如胚泡的內細胞團(ICM)細胞的來源。這種細胞能夠按照本領域熟練技術人員已知的方法沿著指定的途徑進行分化。因此，本發(fā)明的這個實施方案從任何核供體細胞的培養(yǎng)群產生給定類型的分化細胞。能用這個方法產生的細胞類型包括，但不限于，分布廣泛的解剖學部位中存在的細胞類型，如上皮細胞、血細胞和成纖維細胞等，以及顯示較多解剖學限制的細胞，如心肌細胞、造血細胞、神經元細胞、神經膠質細胞、角化細胞等。
這里我們示范了由來自F1和近交鼠品系的已構建ES細胞系的ES細胞核克隆的活后代的產生。在本發(fā)明的一個實施方案中，克隆的活后代是由‘2C’ES細胞核產生的；即，它們擁有基因組DNA的二倍體含量，如在細胞周期G0或G1期的S期前細胞中所見。
本發(fā)明的另一個實施方案中，供體ES細胞核是‘2-4C’。盡管對于分裂中細胞的大多數生活史中，它包含2C DNA，表現為2n染色體，在細胞周期的S期之后的一個時期，染色體數目保持不變，但DNA含量已經由DNA合成復制循環(huán)而加倍；因此這種細胞是2n，但為4C，直到有絲分裂末期二價染色體的姐妹染色單體分離。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用4C核生產活克隆后代。這證明(ES)細胞處于細胞周期的G0或G1期，對于為了它們的核指導任何細胞類型的發(fā)育，并不是必要的。
在一個實施方案中，已經經遺傳改變使ES細胞核供體含有期望的突變。因此，用本發(fā)明的方法從遺傳改變的ES細胞克隆的動物或細胞群將擁有該突變。ES細胞中的遺傳改變可以是非定向突變、接觸誘變劑造成突變、或由已知方法(如電穿孔、逆轉錄病毒感染等)將外源核酸或核酸衍生物導入到細胞中的結果。更優(yōu)選，用作核供體的ES細胞已經通過基因尋靶進行遺傳改變，以致一個或多個特定基因的一部分或全部以精確的和可控制的方式被修飾。
因此，本發(fā)明提供了一種在一代中從細胞系(包括但不限于ES細胞系)產生克隆的、遺傳改變的活后代的方法，該細胞系在核轉移前能在體外被遺傳操作和表征。因此，本發(fā)明的方法提高了從相應細胞系產生基因打靶動物的速度和效率。
圖2是包含其中去核卵母細胞接受E14核，但沒有接受活化刺激的實驗的結果的表。
圖3是包含其中去核卵母細胞接受E14核，并在核轉移后用鍶離子活化的實驗的結果的表。
圖4是用來自不同大小并與不同濃度FCS一起生長的E14細胞的核重建1765個卵母細胞的實驗的結果總結表。
圖5是包含用來自F1雜種129/SV × 129/SV-CP的細胞系R1實施的1087個核轉移實驗的結果的表。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了通過將胚胎干(ES)細胞的核組分(包括染色體)插入去核卵母細胞中，并促使所得重建細胞發(fā)育至足月，可獲得可存活的活產后代。在用于核轉移前，ES細胞可培養(yǎng)或長期深低溫保存。小鼠ES細胞的分離、培養(yǎng)和操作-包括通過同源重組基因尋靶-在Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.(Cold Spring HarborLaboratory Press)，253-290頁(1994)中描述。關于牛、倉鼠、人和兔的建立ES細胞或類似ES細胞的細胞(ES細胞樣細胞)的方法，已分別在Cibelli等，Theriogenology 47，241
；Doetschman等，Dev.Biol.127，224
；Thomson等，Science 282，1145
和Schoonjans等，Mol.Reprod Dev.45，439
中描述。
來自根據本發(fā)明的ES細胞核的后代是基因組克隆，其中后代的每個細胞的染色體均來自起源核供體ES細胞的染色體。
優(yōu)選地，ES細胞來自ES細胞系，該ES細胞系的干細胞性能已經通過在本領域普通技術人員已知的標準胚泡注射步驟(Bradley等，Nature，309，255
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，196-204頁
)后，嵌合后代中種系貢獻和傳遞而被證明。這個過程通常包括將ES細胞注射到受精產生的胚泡的腔中。在這個細胞背景中，ES細胞能夠參與形成部分來自宿主胚泡、部分來自注射的ES細胞的嵌合動物的發(fā)育過程。ES細胞能在嵌合體中產生軀體組織并能形成所有細胞類型，包括嵌合體的種系。ES細胞形成多方面細胞類型的能力被稱為“多能性”。證明ES在種系傳遞中的多潛能限于小鼠和牛，盡管沒有已知的理由相信該現象限于這些物種。ES細胞系被認為為哺乳動物遺傳學、發(fā)育生物學和醫(yī)學的研究提供了一個有力的工具。
ES細胞可以來自已建立的ES細胞系。這種ES細胞系是熟知的，包括但不限于，來自F1雜種系和近交小鼠系的那些。來自F1雜種系的ES細胞系的實例包括R1(Nagy，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國，90，8424
)(見實施例2)。來自近交系的ES細胞系的實例包括129/01a來源的雄性系E14(Hooper，M.等，Nature 326，292
)(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Bethesda，MD獲得，[ATCC]號CRL-11632)、D3(ATCC號CRL-1934)和可從Lexicon Genetics購買得到的AB1和AB2.2。
除了小鼠ES細胞系，ES細胞樣細胞已從牛(Cibelli等，Tlaeriogenology 47，241
)、倉鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224
)、人(Thomson等，Science 282，1145
)和兔(Schoonjans等，Mol.Reprod.Dev.45，439
)獲得。技術障礙妨礙將和鼠相同的嚴格條件應用于來自這些動物的ES細胞，即它們是廣泛多潛能的并能夠對大多數或全部細胞命運(包括種系)有貢獻?？梢灶A期，對于小鼠以外的物種，將會證明實驗證實能達到所有ES細胞限定標準的ES細胞系。
ES細胞(或來自ICM的細胞)以外的細胞可在體外充分培養(yǎng)以在完整動物的克隆步驟中進行基因組操作和/或用作核供體。這種細胞類型不是物種限制的，其實例有人成纖維細胞系、豬胚胎生殖(EG)細胞(REF)，以及鼠胚胎癌性(EC)細胞(Stewart和Mintz，J Exp.Zoot.224，465
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.[ColdSpring Harbor Laboratory Press]，p92
)。適于在體外長期培養(yǎng)和遺傳操作的細胞種類可能增加；所有這些細胞是本發(fā)明方法中潛在的核供體。
確然，ES細胞系能被基因組改造。實施的方法現在已經建立成熟并且在改造ES細胞系以使它們具有給定遺傳(且常常是相應的表型)性狀的文獻(Mombaerts等，Proc.Nad.Acad Sci.美國，88，3084
；Mombaerts等，Nature 360，225
；Itohara等，Cell 72，337
)中有許多報道。這又是通過采用如電穿孔或脂質轉染法導入重組DNA實現的。突變ES細胞也可以在培養(yǎng)物中自發(fā)產生并可以在選擇性培養(yǎng)基存在下富集。例如，據報道通過變異體ES細胞抵抗嘌呤類似物6-巰基鳥嘌呤，可從培養(yǎng)物中選擇次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)缺陷的變異體ES細胞，而且這些突變ES細胞用于生產導致HPRT缺陷的雄性后代的種系嵌合體(Hooper等，Nature 326，292
)。
ES細胞技術的一個關鍵特征是它們允許在整個基因組環(huán)境中DNA序列的定向改變。這依賴于被稱為同源重組的現象，其中在細胞內，DNA序列與它們的互補(匹配，或接近等同的)基因組序列對準。該互補序列被稱為同源序列。然后該序列可以進行交換反應(互換)，產生有效替代染色體上存在序列的新來序列。如果新來序列與其基因組對應物接近等同，或如果它被另外無關序列點綴，則該替代使新序列定向導入。該替代利用細胞酶，據認為該酶的正常作用是在DNA修復和維持方面。由于目前未知的原因，ES細胞是這種酶的豐富來源，并且是已知易于支持同源(即定向)重組的唯一被很好表征的哺乳動物細胞。然后，基因尋靶導致產生一個或多個特定位點以精確指定方式修飾的ES細胞?；驅ぐ械膶嵗ㄓ米鳛橐徊糠窒鄬Χ?＜約25千堿基對[kbp])重組DNA片段的新來DNA序列來產生“剔除”和“引入”鼠。預期ES細胞樣細胞也可以使用與基因尋靶ES細胞類似的技術進行基因打靶。
目前使用基因打靶ES細胞系來產生遺傳改變鼠的方法涉及將改造的ES細胞分別與桑椹胚(大約8個細胞)或胚泡(16個細胞以上)一起聚集或注射至其中。植入后，這種胚胎可以產生嵌合親本(F0)動物，其隨后與野生型動物繁殖使來自ES細胞的基因組以可變的頻率(常常等于零)進行種系傳遞。對已經傳遞了定向基因修飾的任何第一代(F1)后代進行表型(例如，它們的毛色)鑒定，且通過分析它們的基因組DNA進行鑒定(Joyner[主編]，Gene targeting.[Oxford University Press]，52-59頁
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，291-324頁
)。
F1雜合體的繁殖常常是必要的，且在一些情況下，能產生突變純合的第二代(F2)動物。因此，產生定向基因突變純合的動物的當前程序至少涉及三代動物。對于小鼠，這需要大約至少六個月來建立給定的突變等位基因純合的純育系。然而，對于大多數哺乳動物，包括可購買到的有價值品種，具有長得多的妊娠/成熟期，產生純育系所需的時間將遠遠更長。例如，對于牛，三代需要至少3×280天，或大約2.3年。
由于ES細胞系是克隆的(在細胞克隆的意義上，不是完整動物克隆)，它們在完整動物克隆中的應用允許相對較快地產生本質上無限數量的等同動物。因此，通過使用單一ES細胞群作為核供體以產生相應數量的能夠發(fā)育至足月的重建細胞，來生產大量等同動物將成為可能。預期接近等同的、遺傳改造的動物的增殖為人醫(yī)學和獸醫(yī)學及農業(yè)帶來巨大的益處。例如，通過在乳汁或其它液體或組織，通常是分泌性組織，產生有價值的藥物劑，遺傳改變的動物(包括較大的動物)能作為活的制藥“工廠”。這個生產方法有時稱作“制藥法(pharming)”。
大量的等同研究動物，如小鼠、豚鼠、大鼠和倉鼠的產生也是令人期望的，因為它們在藥物發(fā)現和篩選中有用。接近等同的小鼠的群體的可利用性在例如發(fā)育、人類疾病的分析中，和在新藥測試中非常有益；個體間固有的可變性最小，利于對比研究。
本發(fā)明描述了一種通過核轉移產生分化細胞群，例如來自培養(yǎng)細胞如ES細胞的動物克隆的方法。在該方法中，克隆來源的細胞從接受ES細胞(如來自建立的ES細胞系)核(或其一部分，至少包括染色體)的去核卵母細胞開始發(fā)育。在本發(fā)明的一個實施方案中，在用本發(fā)明的方法將ES細胞核顯微注射到去核卵母細胞后可以產生克隆小鼠。在進一步的實施方案中，ES細胞核供體可以來自ES細胞系，E14。從ES細胞克隆的后代可以在出生幾天后，通過它們的毛色來識別，毛色反映了核供體細胞系所來源的小鼠品系的表型。目前可獲得的許多ES細胞系來自Jackson實驗室Leroy Stevens博士的129小鼠品系，129/Sv。
本發(fā)明可用于克隆能夠或可能從中分離ES細胞并培養(yǎng)形成ES細胞系的所有動物，包括兩棲動物、魚、鳥(如家雞、火雞、鵝等)和哺乳動物，如靈長類、綿羊、牛、豬、熊、貓、犬、馬、山羊、鼠等。
本發(fā)明方法的一個實施方案包括步驟(i)在ES細胞核插入卵母細胞后，但在發(fā)育活化之前，允許ES細胞核與去核卵母細胞的細胞質接觸一段時間(如不超過大約6小時)，和(ii)活化重建細胞以啟動發(fā)育。
在一個實施方案中，使用具有2C基因組含量的供體核。當核供體是2C時，為了抑制假極體(pseudo-polar body)中染色體的擠出，優(yōu)選在微管和/或微絲組裝抑制劑存在下進行活化。當例如使用4C供體核時，在缺乏微管/微絲抑制劑下活化之前，重建細胞可以培養(yǎng)不超過大約6小時；在這種情況下，假極體被擠出，以致重建細胞的倍性可恢復到2n。(形式上的2n倍體通常是指導原腸胚形成以上胚胎發(fā)育的先決條件。)在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，用顯微注射法將ES細胞核插入去核卵母細胞的細胞質中，并且，更優(yōu)選用壓電驅動(piezo-electrically-actuated)顯微注射法。使用壓電顯微操作器允許用單針收獲和注射來自ES細胞的核供體。而且，卵母細胞的去核和供體ES細胞核的注射可快速、高效完成，并且與以前報道的方法(如，用融合促進化學制劑、放電或融合病毒誘導供體細胞和卵母細胞的融合)相比，降低了對卵母細胞的創(chuàng)傷。
用顯微注射法導入核物質的方法與用細胞融合導入核物質的方法在時間和拓撲上明顯不同。在本發(fā)明的顯微注射法中，首先供體ES細胞的質膜被穿孔，隨后，去核卵母細胞的質膜被穿孔。因此，從供體細胞提取核(或其一部分，至少包括染色體)與該核送遞到受體細胞在時間上是分開的。核內容物的分離和送遞在時間和空間上分離不是細胞融合的特征，在細胞融合中使兩個細胞并列，然后在單個步驟中發(fā)生融合。
而且，本發(fā)明方法的核取出和導入的時間空間分離允許有控制地導入除核之外的物質?？赡芊浅Ｆ谕コ鈦砦镔|(如細胞質和核質)和導入額外物質和試劑的工具。例如添加劑可能很好地影響隨后的發(fā)育。這種試劑可以包含抗體、藥理學上信號轉導抑制劑，或其組合，其中抗體和/或抑制劑直接對抗和/或抑制在細胞分裂或胚胎發(fā)育中起負調節(jié)作用的蛋白或其它分子的作用。該試劑可以包括核酸序列，如重組質粒或轉化載體構建體，它們可以在胚胎發(fā)育過程中表達以編碼對發(fā)育具有潛在正作用的蛋白和/或核酸序列，可以在核與去核卵母細胞結合前、結合過程中或結合后，將試劑導入細胞。
本發(fā)明方法的一個實施方案中，通過核轉移從培養(yǎng)ES細胞克隆產生分化細胞群的步驟和分步在
圖1中圖解。
概括地說，從卵母細胞供體動物收獲(1)卵母細胞，優(yōu)選中期I階段卵母細胞，并除去每一個卵母細胞的中期II(mII)板(plate)(含mII染色體)(2)形成去核卵母細胞(缺乏母系來源的染色體)?？梢栽隗w外用已知步驟或在體內用其他研究者已經描述的步驟使受體卵母細胞成熟。如本發(fā)明中不同實施方案提供的，從含有直徑或小(典型地10μm)或大(典型地18μm)的細胞的體外培養(yǎng)物中選擇外貌健康ES細胞(3，4)。單一核被注射到(5)去核卵母細胞的細胞質中。允許核在去核卵母細胞細胞質中停留(6)不超過6小時。在一個實施方案中，這個時期最小大約0-5分鐘。在一個更優(yōu)選實施方案中，這個時期是1-3小時。
然后，在微管和/或微絲組裝抑制劑存在或缺乏下，活化卵母細胞(7)，抑制劑存在與否依賴于新來核的倍性或基因組當量(genomeequivalence)，其部分由供體核在轉移時所處細胞周期階段反映。有絲分裂細胞周期確保在DNA復制的一個復制循環(huán)后，活躍分裂的細胞將相等的遺傳物質分給兩個子細胞。DNA合成并不是貫穿整個細胞周期，而是限于細胞周期的一部分合成期，S期。其后是間期，G2期，這期間細胞在進入有絲分裂(M期)前為分裂作進一步準備。初生子細胞從那時起遞送到另一個間期，G1期。明顯地，某些非分裂細胞，例如在體內終末分化細胞，在周期中的這個階段-相當于分裂細胞G1期并在S期前的階段-懸置。這種細胞通常稱作“靜止的”，從細胞周期中退出進入G0期。細胞周期的G0或G1期的細胞核是二倍體，帶有相應于這種情況下2C DNA含量的2n染色體；它們具有每條形態(tài)學明顯不同的常染色體(非X，非Y)的兩個拷貝，和依賴于物種，或XX(雌性)或XY對。細胞周期G2期的細胞核經歷了一輪DNA復制，染色體數量仍是2n，但此時含有4C DNA含量。在S期期間，每條不同的染色體的兩個拷貝中每一個的DNA都被復制，但這些拷貝(單價姐妹染色單體)連接在每個染色體的著絲粒處。在非同步分裂的ES細胞培養(yǎng)物中，可期望，根據定義，表現出細胞周期的所有階段。所以，ES細胞培養(yǎng)物中含有由一個直徑范圍反映的細胞混合物；這個范圍可以從大約10μm到大約18μm。相對小的細胞(直徑大約10μm)有可能是二倍體(2n)并有2C的基因組DNA，因為這些細胞相對較近分裂，細胞質體積后來增加相對較小。趨向最大大小的細胞(直徑大約18μm)更有可能前進到S期后。
當ES細胞供體核是二倍體和2C時，在核轉移后，在胞質分裂抑制劑存在下活化重建細胞(7)。這抑制假極體的形成并防止染色體遺失，以此維持重建細胞的2n二倍性。當認為核可能處于S期后(因為它存在于較大細胞中)時，在胞質分裂抑制劑缺失下，活化卵母細胞，這樣假極體形成能同時使卵母細胞的二倍性減少到2n，2C。在活化期間，可觀察到假前核(pseudo-pronuclei)形成。
ES核供體細胞培養(yǎng)基中胎牛血清(FCS)濃度可以在廣泛范圍內變化；認為FCS濃度對來自培養(yǎng)的ES細胞的核支持用本發(fā)明方法克隆的活后代發(fā)育的能力沒有明顯的影響。
或小或大細胞的核轉移后，將形成假前核的重建卵母細胞(8)轉移到新鮮培養(yǎng)基，胚胎培養(yǎng)1到大約3.5天(9)。培養(yǎng)后，胚胎可以轉移(10)到替代母親以允許活后代的發(fā)育和出生(11)?？晒┻x擇地，(9)產生的胚胎可用作ES細胞樣細胞培養(yǎng)物的后續(xù)衍生中ICM細胞的來源。
因此，本發(fā)明方法的一個實施方案描述了哺乳動物的克隆，包括步驟(a)收集細胞如ES細胞的核的全部或一部分，至少包括染色體；(b)將其插入去核卵母細胞中；(c)允許重建細胞發(fā)育為胚胎；和(d)允許胚胎發(fā)育為胎兒和隨后發(fā)育為活后代，或使胚胎的細胞在體外培養(yǎng)。這些步驟中的每一步在下面進行詳細描述，以ES細胞核供體作為范例。
可以從ES細胞收集ES細胞核(或包含染色體的核組分)，該ES細胞具有如上所述的2-4C的基因組DNA含量。優(yōu)選，ES細胞核插入到去核卵母細胞的細胞質中。優(yōu)選通過顯微注射法進行核插入，并且更優(yōu)選通過壓電驅動顯微注射法進行。在進一步的方案中，可以通過允許核供體細胞與受體去核卵母細胞融合的方法將核導入(Willadsen，Nature320，63
)。
可以在ES細胞核插入前、插入過程中或插入后，活化重建細胞。在一個實施方案中，在ES細胞核插入零小時到大約六小時后，實施活化步驟。在活化前的時間內，核與mII卵母細胞(可能被新來的成分修飾)的居住(resident)細胞質接觸?；罨梢酝ㄟ^多種方式實施，包括但不限于，電活化，或接觸乙醇、精子胞質因子(sperm cytoplasmic factors)、卵母細胞受體配體肽模擬物、Ca2+釋放的藥理學刺激劑(如咖啡因)、Ca2+離子載體(如A2318，離子霉素)、磷蛋白信號傳導(signaling)調節(jié)劑、蛋白合成抑制劑等，或它們的組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過使細胞接觸鍶離子(Sr2+)進行活化。
優(yōu)選通過接觸微管和/或微絲組裝的抑制劑以防止極體形成(見下)，來實施已經用含有2C DNA的核注射的重建細胞的活化。這有利于在重建細胞內保留來自供體核的所有染色體。優(yōu)選在這種抑制劑缺乏時，活化已接受2-4C核的重建細胞，以允許假極體的形成，從而使基因組含量降為2C。在一個實施方案中，2C基因組含量對應于2n染色體。
允許胚胎發(fā)育的步驟可包括將胚胎轉移給受體替代母親，在那里胚胎發(fā)育為存活胎兒(即，足以正常發(fā)育至足月的成功植入的胎兒)的分步。如本領域技術人員所知，胚胎可以在體外發(fā)育的任何階段，從兩細胞到桑椹胚/胚泡，進行轉移。
根據圖1的步驟(1)到(10)，本發(fā)明另外實施方案的前十步產生了克隆的桑椹胚或胚泡(胚胎)。在一個實施方案中，在此之后，在克隆胚胎轉移給替代受體雌性動物前，根據本領域普通技術人員所知的方法，用聚集技術或胚泡注射將至少一個，通常5-15個ES細胞導入克隆胚胎中。這些“第二”ES細胞被完整導入并可以來自與核供體來源的培養(yǎng)物相同的培養(yǎng)物，或那個培養(yǎng)物的繼續(xù)，或不同的培養(yǎng)物，或混合物。第二ES細胞的一個功能是拯救或增強克隆胚胎的發(fā)育潛力，這樣使其完全發(fā)育的可能性更大。所得胚胎現在含有來自克隆來源胚胎和第二導入的ES細胞的細胞混合物。接著將混合細胞胚胎轉移到雌性替代受體中，在那里胚胎發(fā)育為成活胎兒。當核供體和第二ES細胞采用相同的ES細胞培養(yǎng)物時，所得胚胎不是遺傳嵌合的。當采用不同的ES細胞培養(yǎng)物時，所得胚胎可以是遺傳上嵌合的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在核組分轉移到去核卵母細胞后重建的細胞接受一個信號，從而活化胚胎在體外的發(fā)育，并如所述進行培養(yǎng)。然而，得到的胚胎在體外進一步培養(yǎng)，用于衍生細胞系。在一個優(yōu)選方案中，根據本領域技術人員已知的方法，將胚胎培養(yǎng)到胚泡期并用于衍生胚胎干(ES)細胞系或ES細胞樣系。在進一步的實施方案中，通過變化體外培養(yǎng)條件，誘導用這種方法來源的細胞系的細胞沿著指定的途徑進行分化。本領域技術人員能夠誘導ES細胞或ES樣細胞分化產生各種細胞類型的群體，包括但不限于心肌細胞(Klug等，J.Clin.Invest.98，216
)，神經元細胞(Bain等，Dev.Biol.168，342
)或血細胞(Wiles和Keller，Development 111，259
)。這種細胞有巨大的用途，如在組織工程的新興領域(描述在Kaihara和Vacanti，Arch.Surg.134，1184
)。
顯微注射法具有許多優(yōu)點，涉及ES細胞送遞到去核卵母細胞中和ES細胞的隨后重建方面，包括下列優(yōu)點。第一，采用顯微注射法實施全部或部分核送遞(即部分送遞到去核卵母細胞和包含核組分(包括染色體組分)的ES核的隨后重建)，可應用于大量各種細胞類型，無論在體外或在體內生長，不論其大小、形態(tài)、核供體的發(fā)育階段等。第二，顯微注射法送遞核能夠仔細控制在核注射時，共導入到去核卵母細胞的核供體細胞的細胞質和核質體積。當外來物質對發(fā)育潛能有不利影響時，這是特別恰當的。第三，顯微注射法送遞核允許仔細控制在核注射時，另外的試劑共注射(與供體核共同注射)到卵母細胞中這些試劑在下示例。第四，顯微注射法送遞核易于允許在活化前，使供體核與去核卵母細胞的細胞質接觸一段時間。這種接觸可便于染色質改型(remodeling)、重編程或其它轉移染色質的改變(如母系來源的轉錄因子的募集)，這將利于胚胎隨后的發(fā)育。第五，顯微注射法送遞核使隨后活化方案的選擇范圍廣(在一個實施方案中，使用Sr2+)；不同的活化方案可能對發(fā)育潛能產生不同的影響。第六，活化可以在微絲干擾劑(在一個實施方案中，細胞松弛素B)存在下進行以防止染色體擠出，和在細胞分化調節(jié)物(在不同的實施方案中，二甲基亞砜或9-順-視黃酸)存在下進行以促進有利的發(fā)育結果。第七，在一個方案中，用壓電驅動的顯微注射法進行核送遞，允許快速和有效地處理樣品并因此降低對進行操作的細胞的損傷。損傷降低部分是因為供體細胞核的制備和導入去核卵母細胞的過程是用相同的注射針實施的；相比之下，使用傳統顯微注射針，在透明帶取核和卵母細胞質膜穿刺之間至少需要更換一次針。第八，不僅各單個步驟，而且其相互關系，是本發(fā)明方法的一個特征?，F在我們更詳細地提供這些單個的步驟并顯示它們在本發(fā)明中彼此之間是如何安排的。
詳細描述1受體卵母細胞。卵母細胞在收獲用于去核和制備用作核轉移的受體前，在體內的成熟階段對克隆方法的結果有潛在的影響。供體核可以注射到任何發(fā)育階段的卵母細胞或它們的祖先細胞中。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，將核轉移到成熟的mII卵母細胞受體中；這種mII卵母細胞是被受精精子正?；罨念愋汀Ｂ涯讣毎毎|的化學變化貫穿成熟的過程。這可被中期促進因子(MPF)-細胞周期蛋白B2和cdc2蛋白激酶的二聚復合體例證。MPF活性高的細胞處于細胞周期的中期。例如，在小鼠中，與MPF有關的細胞質活性在那些停滯在第一次減數分裂中期(中期I，mI)的未成熟卵母細胞中最高。然后，隨著第一極體(Pb1)的擠出，MFF活性下降，在第二中期，mII時再次達到高水平。在mII期，這些高水平保持不變并使卵母細胞滯留在mII期，當卵母細胞接受重新開始細胞周期(活化)的信號，如由受精精子或Sr2+傳遞的信號時，它快速減少。當ES細胞核注射到mII卵母細胞的細胞質時，高MPF活性破裂其核被膜，伴隨染色質凝聚，導致來自ES細胞的中期染色體的形成。
可用于本發(fā)明方法的卵母細胞包括未成熟期卵母細胞(如帶有完整核，即稱為生發(fā)泡的那些)和成熟期卵母細胞(即，那些在mII的卵母細胞)。成熟卵母細胞可通過，如注射促性腺或其它激素(例如，連續(xù)給予馬和人絨毛膜促性腺激素)來誘導動物超排卵并在排卵后不久(例如，在小鼠動情期開始后13-15小時，母牛動情期開始后72-96小時和家貓動情期開始后80-84小時)手術收獲卵細胞而得到。
當可獲得的卵母細胞限于未成熟卵母細胞時，可以在促進成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，直到它們進展到mII；這是已知的體外成熟(IVM)。未成熟牛卵母細胞的IVM方法在WO 98/07841中描述，對于未成熟小鼠卵母細胞在Eppig和Telfer(Mets.Enzymol.[Academic Press]225，pp.77-84，
)中描述。在本發(fā)明的進一步實施方案中，未成熟卵母細胞可以不經IVM用作受體細胞，如卵母細胞在去核前可以在體外成熟。
詳細描述2卵母細胞去核?？梢杂帽绢I域已知的方法實施卵母細胞的去核。優(yōu)選，卵母細胞在去核前和去核過程中接觸含有微管和/或微絲組裝抑制劑的培養(yǎng)基。含肌動蛋白的微絲或含微管蛋白的微管的破壞給予了細胞膜和/或下面的皮層細胞質相對的流動性，這樣能夠很容易地將裝在膜內的一部分卵母細胞吸出到移液管中，伴有亞細胞結構最低限度的破壞。一個微絲干擾劑的選擇是細胞松弛素B(5μ/ml)。合適的微管干擾劑，如諾考達唑、6-二甲氨基嘌呤和秋水仙堿，也是本領域技術人員已知的。另外的微絲干擾劑包括但不限于，細胞松弛素D、jasplakinolide、拉春庫林A(latrunculin A)等。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，采用壓電驅動微量移液管吸引實施mII卵母細胞的去核。去核顯微外科術過程中，用常規(guī)固定微量移液管錨定mII卵母細胞。壓電驅動去核微量移液管(內徑約等于7μm)的平頭尖端接觸透明帶。合適的壓電驅動裝置在Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，日本)以Piezo Micromanipulator/Piezo Impact DriveUnit的名稱出售。該單位利用壓電效果來以高度可控、快速的方式使顯微注射微管尖前進一個短距離(大約0.5μm)。每一脈沖的強度和脈沖間的間隔可被控制單元改變和調節(jié)。應用壓電脈沖(例如，強度＝1-5，速度＝4-16)使微量移液管前進(或鉆過)通過透明帶，同時保持其內小的負壓。這樣，微量移液管尖快速通過透明帶，并前進到臨近mII板的位置(它含有染色體-紡錘體復合體，在幾個物種的mII卵母細胞的細胞質中可分辯為半透明區(qū)，通常位于第一極體附近)。然后輕輕地敏捷地將含有中期板的卵母細胞細胞質以最小體積吸出到顯微注射移液管中，抽出注射移液管(此時含有mII染色體)。這步的作用是使部分含有mII染色體的卵母細胞細胞質被吸出。接著顯微注射移液管被抽出脫離透明帶，在從下一個卵母細胞手術取出染色體前，將染色體釋放到周圍培養(yǎng)基中。適當地，成批卵母細胞可篩選證實完全去核。對于顆粒狀細胞質的卵母細胞(如豬、綿羊和貓卵母細胞)，用DNA特異性熒光染料(例如，Hoeschst 33342)染色并在低強度UV照明下簡單檢測(在一些情況下，用圖像加強視頻監(jiān)視器增強)在確定去核效率中是有利的。
mII卵母細胞的去核可通過其它方法實施，如在美國專利4,994,384中描述的方法。例如，用與壓電驅動微量移液管相對的常規(guī)微量移液管顯微手術進行去核。可通過首先用玻璃針沿著10-20％的周緣和接近mII染色體的位置切開卵母細胞的透明帶來實施去核。卵母細胞存在于顯微鏡載物臺上含有細胞松弛素B的培養(yǎng)基懸滴中。用不銳利傾斜尖的去核移液管取出染色體。
去核后，卵母細胞等待接受ES細胞核。優(yōu)選在供體核插入前大約2小時內制備去核細胞。
詳細描述3ES細胞系的制備和維持。ES細胞的分離、培養(yǎng)和操作在如Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(1994)中描述。在這里總結了該描述的要素。
原代小鼠ES細胞可以從發(fā)育活化(如受精)后至少大約3.5天的擴張胚泡分離。胚胎用培養(yǎng)基如DMEM(補充10％胎牛血清和25mM HEPES，pH7.4)從動物的子宮角沖洗出并分別放置到含有預制飼養(yǎng)細胞層(下面描述)和1ml ES細胞培養(yǎng)基的10mm孔組織培養(yǎng)皿中。胚胎培養(yǎng)的初期階段也可以在不含飼養(yǎng)細胞的ES培養(yǎng)基小懸滴中，少量石蠟油下培養(yǎng)。進一步培養(yǎng)1-2天后，胚胎從透明帶中“孵出”并粘附在組織培養(yǎng)皿的表面，以滋養(yǎng)外胚層(TE)譜系細胞遷移。胚胎粘附后不久，內細胞團(ICM)變得很容易與TE譜系(滋養(yǎng)層)的細胞區(qū)分并且生長快速。胚泡培養(yǎng)總共4-5天后，用末端密封的細巴斯德移液管移出來自ICM的(ES)細胞。
用胰蛋白酶處理細胞，將ES細胞團解聚為通常包含3或4個細胞的較小組。然后將這些轉移到新的飼養(yǎng)細胞組織培養(yǎng)孔中。原代ES細胞樣集落可由其形態(tài)學來辨認，如下所述。
在嚴格生長條件下培養(yǎng)ES細胞及其遺傳改造的衍生物以使它們保持正常的核型；這對確保它們具有以工作頻率貢獻給功能性生殖細胞的潛能是必需的。已知次最優(yōu)的培養(yǎng)條件可以產生發(fā)生核型改變、染色體重排和/或增加其生長速度和降低其在體內分化能力的其它突變的ES細胞變異體。最佳的培養(yǎng)條件對培養(yǎng)ES細胞領域技術人員是已知的，包括提供必需濃度的營養(yǎng)物和生長因子并避免以很高密度培養(yǎng)細胞。高密度培養(yǎng)細胞具有形成團的傾向，團表面細胞分化為多能性受限的內胚層樣細胞?？梢愿鶕藴史椒ǎ扛?-3天以1∶2到1∶6分裂培養(yǎng)物，用蛋白酶胰蛋白酶適度處理使3-4個細胞的小組進一步分成單個細胞，達到良好的培養(yǎng)密度。培養(yǎng)物中健康ES細胞典型地以輪廓“光滑”的緊密壓縮群形式生長。集落表面“粗糙”內胚層的出現，或細胞在基層鋪開，是本領域普通技術人員所知的次最優(yōu)培養(yǎng)條件的指征。
所有培養(yǎng)基、添加物等是無內毒素的。最常用的培養(yǎng)基是Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)和4.5mg/ml葡萄糖，可選擇地含有1mM的丙酮酸鈉。DMEM是設計在5％CO2的空氣中，大約35℃下，提供pH7.2-7.4的碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基。DMEM通常就在使用前補充(a)2mM谷氨酰胺；0.1mM非必需氨基酸；(c)0.1mM β-巰基乙醇；(d)50μg/ml慶大霉素，或青霉素和鏈霉素各100U/ml，或不含抗生素；(e)15％胎牛血清(FCS；見下)；并可任選，(f)白血病抑制因子(LIF)，也稱分化抑制因子(DIA)(見下)。
對于ES細胞繼代培養(yǎng)和收獲，用含胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)混合物(例如，終濃度分別為0.025％和75mM)的無Ca2+-Mg2+的磷酸緩沖鹽水處理，使其從組織培養(yǎng)皿分離下來并彼此分開。
用胎牛血清FCS補充到用于ES細胞培養(yǎng)的DMEM中。典型地，FCS以15％(v/v)使用。然而，在本發(fā)明方法中，更低濃度(如1-5％)的FCS支持ES細胞的培養(yǎng)，該細胞的核能夠指導胎兒和活后代的發(fā)育。而且，這些更低濃度的FCS支持活躍生長的培養(yǎng)物，意味著其中可呈現出處于細胞周期各個階段的細胞，并且它們在本發(fā)明方法中可使用。
白血病抑制因子(LIF)是一種抑制ES細胞自發(fā)分化的分泌性細胞因子。它是已知可用于ES細胞生長的水牛-大鼠-肝(BRL)細胞條件培養(yǎng)基的活性成分之一。在ES細胞共培養(yǎng)中，飼養(yǎng)細胞表達活性形式LIF，盡管可用純化LIF補充該培養(yǎng)基。飼養(yǎng)細胞調節(jié)的無細胞培養(yǎng)基不足以支持ES細胞培養(yǎng)，需要補充，例如純化的LIF(見下)。
盡管在缺乏飼養(yǎng)細胞的含有LIF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ES細胞是可能的，但是大多數實驗室依賴飼養(yǎng)層來提供增強ES細胞的增殖和維持未分化狀態(tài)的因子。最常用的兩種飼養(yǎng)細胞是用本領域技術人員已知的方法從12.5到14.5dpc胚胎中收獲的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的原代培養(yǎng)物，和STO小鼠成纖維細胞系，它是SIM小鼠成纖維細胞的抗硫代鳥嘌呤和烏本苷的亞系。用絲裂霉素C處理或用γ射線輻射制備不有絲分裂的飼養(yǎng)細胞。
已經描述了其它物種的得到ES細胞樣細胞的方法，包括牛(Cibelli等，Theriogenology 47，241
)、倉鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224
)、人(Thomson等，Science 282，1145
)和兔(Schoonjans等，Mol.Reprod.Dev.45，439
)。本領域技術人員可將這些方法應用于任何適當的物種以得到ES細胞樣細胞。
詳細描述4遺傳修飾或基因打靶ES細胞的制備?？捎帽绢I域已知技術對ES細胞進行遺傳修飾。優(yōu)選用“基因尋靶”對ES細胞進行修飾?；驅ぐ忻枋隽艘环N將基因組突變以定向非隨機方式導入的方法。這樣，特定的突變可以被導入到整個基因組內。由于ES細胞可以用來產生個體，所以含有定向改變基因的ES細胞能夠產生包含該定向突變的完整動物。該方法的一個重要特征-“尋靶構建體”的設計和構建-是本領域普通技術人員已知的。尋靶構建體典型地包括至少一個非宿主基因組天然的核苷酸序列。非天然序列相當于待導入的突變，側翼有相比之下與宿主基因組中那些區(qū)域高度保守的，如果不等同的話，較大區(qū)域(典型地＞5kbp)。這意味著一旦進入細胞內，該保守/等同序列能夠與靶基因組中存在的它們的互補對應物發(fā)生同源重組。
為了將突變導入給定ES細胞類型的基因組中，制備相對純形式的尋靶構建體DNA并用下列方法，包括用野生型或重組逆轉錄病毒感染、脂質轉染、轉染等，并優(yōu)選電穿孔(Hogan等，Manipulating the mouseembryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，277-278頁
；Joyner[ed]，Gene targeting.[Oxford University Press]
)，使ES細胞攝取該DNA。
基因尋靶的效率依賴于可能是每個尋靶構建體序列、DNA制品或ES細胞系獨特的變量的組合。然而，這些僅需要本領域技術內的常規(guī)實驗。例如，效率可受等基因對非等基因DNA的使用、尋靶構建體內的互補序列的長度、尋靶DNA和內源基因之間序列連續(xù)片段的等同程度、尋靶DNA的每一側的互補的長度等的影響。產生基因打靶ES細胞的方法是本領域技術人員熟知的。適合用于本發(fā)明的示范基因打靶ES細胞包括但不限于Mombaerts等，Proc.Nad.Acad.Sci.美國，88，3084(1991)；Mombaerts等，Nature 360，225(1992)；Itohara等，Cell 72，337(1993)；美國專利5,859,307等中描述的那些。
詳細描述5ES細胞供體核的制備。培養(yǎng)后，用含胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)(例如，分別以0.025％和75mM的終濃度)混合物的無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽水處理從組織培養(yǎng)皿中分離ES細胞未匯合培養(yǎng)物并使它們彼此分開。然后將細胞懸液轉移至顯微鏡載物臺上含有12％聚乙烯吡咯烷酮的CZB·H培養(yǎng)基懸滴中。
詳細描述6供體核插入去核卵母細胞中。可以采用顯微注射技術將核(或至少包括染色體的核組分)直接注射到去核卵母細胞的細胞質中。在一個將來自ES細胞的核注射到去核卵母細胞的優(yōu)選方法中，使用壓電驅動微量移液管，其中可基本使用帶有這里詳述改進的上述裝置和技術(有關卵母細胞的去核)。
例如，如前所述制備顯微注射針，使其具有一個內徑大約5μm的平頭尖端。根據供應商的說明，該針在它的針尖附近可以含有汞并位于壓電驅動裝置中。顯微注射移液管尖部附近存在汞小滴能增加尖部前進固有的動量，因此能以可控制方式增加尖穿透能力。含有各自選擇核的顯微注射移液管尖部緊密接觸去核卵母細胞的透明帶，應用幾個壓電脈沖(應用時用控制器設置尺度調節(jié)，可以是強度1-5、速度4-6)來推進微量移液管，同時可選地使其內部保持輕微負壓。當移液管尖部通過透明帶，所得帶“核心”被逐至卵周隙，微量移液管中預選的核前進到尖部附近。然后移液管尖部置于質膜(卵膜)附近并推進(朝向卵母細胞的相反面)直到幾乎位于卵母細胞皮質的對側。此時卵母細胞質膜深深凹入包繞在注射針的尖部。應用一到兩個壓電脈沖(例如，強度1-2、速度1)后，卵膜快速和典型可辨的松弛指示質膜在尖部被穿刺。核被排到卵質中，帶有最少量(小于等于約1pl)伴隨介質。接著，小心撤回微量移液管，在卵母細胞的細胞質中留下了新導入的核。該方法輕快、典型地批處理15-20個去核卵母細胞，該卵母細胞在其它所有時間保持在培養(yǎng)條件下。
可以使用可供選擇的變型通過常規(guī)顯微注射插入供體核。這種使用常規(guī)顯微注射將精子核插入倉鼠卵母細胞的一個方法的描述，在Yanagida，Biol.Reprod.44，440(1991)中描述，其中涉及這種方法的公開在此引入作為參考。
詳細描述7與核供體共插入發(fā)育調節(jié)性因子。在本發(fā)明的一個實施方案中，在供體核與去核卵母細胞結合前、結合過程中或結合后，可以導入一個或多個具有改變胚胎發(fā)育結果潛能的試劑。例如，核可以與對抗具有假定或已知影響本發(fā)明方法結果潛能的蛋白的功能調節(jié)型抗體共同注射。這種分子可以包括但不限于，參與囊泡轉運的蛋白(如突觸結合蛋白)，那些可以介導染色質-卵質通訊的蛋白(如DNA破壞細胞周期關卡分子如Chk1)，那些在卵母細胞信號傳導中有推定作用的蛋白(如轉錄因子，STAT3)或修飾DNA的蛋白(如DNA甲基轉移酶)。這類分子中的成員也可以是用本發(fā)明方法中顯微注射法導入、并且具有與抗體類似的功能調節(jié)作用的調節(jié)性藥理學試劑的(間接)靶標?？贵w和藥理學試劑通過與它們各自的靶分子或它們各自靶分子的配體結合來發(fā)揮作用。當該靶對發(fā)育結果具有抑制性作用時，這種結合降低靶的功能，當該靶對發(fā)育結果有正作用時，結合能促進那個功能。作為替代，在克隆方法中重要功能的調節(jié)可以直接通過注射這些因子(或具有類似活性的因子)，而不是注射與它們結合的試劑來達到。
在本發(fā)明進一步的實施方案中，可以在供體核插入前或后，通過顯微注射將核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)導入卵母細胞中。例如，注射帶有必需的順式作用信號的重組DNA可使居住或共同注射的轉錄因子引起重組DNA上存在的序列發(fā)生轉錄；編碼蛋白的隨后表達可以對抑制胚胎發(fā)育的因子具有拮抗作用，或對正性作用的因子具有增強作用。而且，轉錄本可以對編碼減少發(fā)育潛能的蛋白的mRNA具有反義調節(jié)活性?？晒┻x擇地，這種調節(jié)可以通過直接送遞具有反義功能(如反義mRNA)的核酸(或其衍生物)來達到；這排除了在卵母細胞內轉錄產生反義調節(jié)分子的需要。在一個有利實施方案中，通過顯微注射進行送遞。最后，轉錄本可以對早期胚胎中基因表達的轉錄調節(jié)起關鍵的影響。這種影響也可能被顯微注射能夠影響翻譯的另外分子種類介導。
本發(fā)明方法導入的重組DNA(或環(huán)狀或線性)可以包含含有一個或多個表達的功能性基因的功能性復制子。該基因可以在一個或多個啟動子的控制之下，啟動子的活性可以表現狹窄、寬廣或中等的發(fā)育表達范圍。例如，僅在早期合子中有活性的啟動子會指導其關聯基因立即但短暫的表達。導入的DNA可以在胚胎發(fā)育期間丟失，或整合在一個或多個基因組座位，在所得轉基因個體的整個生活史中穩(wěn)定復制。在一個實施方案中，可以通過顯微注射法將編碼推斷的“抗老化”蛋白，如端粒酶、過氧化物歧化酶或其它氧化保護蛋白的DNA構建體，導入卵母細胞?？晒┻x擇地，可以直接在那里注射蛋白，如精子因子蛋白。
詳細描述8重建細胞發(fā)育的活化。在本發(fā)明的一個實施方案中，接受了供體核的去核卵母細胞，在活化前，重回培養(yǎng)條件培養(yǎng)0-6個小時；這樣，卵母細胞可以在供體核插入去核卵母細胞后不超過大約6小時的任何時間進行活化。我們這里將這個間隔稱作“潛伏期”。在一個優(yōu)選實施方案中，潛伏期是1-3個小時。活化可以，但不限于，以電的方式，通過注射一種或多種卵母細胞活化物質，或將卵母細胞轉移至含有一種或多種卵母細胞活化物質的介質中來進行。
能夠提供活化刺激(或活化刺激的組合)的試劑包括，但不限于，來自精子的胞質因子(例如負責溶解活性(soluble artivity)的蛋白，oscillogen)和某些藥理學化合物(例如6-二甲氨基嘌呤[DMAP]、IP3和其它信號轉導調節(jié)劑)；可以在由供體核插入的細胞重建前、與重建同時或重建后，通過顯微注射將這些導入。一種或多種活化刺激可以在重建細胞轉移到含有活化化合物子集一或多個成員的介質后(立即或潛伏期后)提供。這個子集包括但不限于，Ca2+釋放刺激劑(如咖啡因、乙醇和Ca2+離子載體如A23187和離子霉素)、磷蛋白信號傳導調節(jié)劑(如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成抑制劑(如A23187和環(huán)己酰胺(cyclohexamide))、DMAP或前述的組合(如DMAP加離子霉素)。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過在含有10mM SrCl2提供的二價鍶離子Sr2+的無Ca2+CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-6個小時達到重建細胞的活化。
本發(fā)明的活化刺激與供體核的插入同時或在其后應用的實施方案中，重建細胞可以在進行活化刺激時或刺激后很快被轉移到含有一種或多種微絲干擾劑如含5μg/ml細胞松弛素B的二甲基亞砜的培養(yǎng)基中；這能抑制胞質分裂并因此抑制通過假極體造成的染色體損失。在胞質分裂抑制劑存在下培養(yǎng)4-12小時，但更優(yōu)選6個小時。這個方案優(yōu)選應用于含有2C DNA的供體核。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，去核卵母細胞可以在供體核插入前用上述活化方法活化。接觸活化刺激后，如上所述在2C核注射前培養(yǎng)去核卵母細胞不超過大約6小時。在這個方案中，新導入的染色體快速與前核樣結構聯合并且不期望與胞質分裂防止劑培養(yǎng)抑制假極體排出。
詳細描述9發(fā)育產生有活力胎兒和后代。重建細胞被活化產生可經體外培養(yǎng)允許發(fā)育的前核、1-細胞胚胎。當該胚胎與胞質分裂阻斷劑接觸抑制假極體排出時，將胚胎轉移到缺乏微絲或微管干擾劑的新鮮培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)到2-細胞到桑椹胚/胚泡期，在此時可將胚胎轉移到假孕替代母親的輸卵管或子宮中。
可供選擇地，為了通過增加由單一細胞重建來源的后代數量而增加產量，可以分裂胚胎和克隆擴增細胞。
在進一步的實施方案中，通過系列核轉移用本發(fā)明方法得到的胚胎產生進一步的胚胎。為了達到這點，如上所述活化重建細胞并允許體外培養(yǎng)發(fā)育。在另一個實施方案中，可以在轉移到合適的替代母親后在體內培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)幾天，優(yōu)選3-5天后，用蛋白酶如胰蛋白酶適度處理，或用本領域技術人員所知的機械方法將所得胚胎的細胞分散開。接著，來自這些胚胎的各個細胞被用作核供體；每個細胞的核可以被移出并插入到去核卵母細胞，去核卵母細胞隨后活化并允許進行發(fā)育。上面描述了供體核插入、去核、發(fā)育活化和胚胎培養(yǎng)的方法。
詳細描述10分化細胞群的產生。在另外的實施方案中，用本發(fā)明方法產生的克隆胚胎建立體外ES細胞樣細胞培養(yǎng)物。這可通過本領域技術人員已知的方法達到且在Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版。(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，265-272(1994)中描述。可以誘導這種培養(yǎng)物以指定的方式進行分化，因此產生可能無限的特定基因型的豐富細胞來源。已經描述了誘導這種分化的方法獲得豐富的神經元細胞群(Bain等，Dev.Biol.168，342
)、心肌細胞群(Klug等，J.Clin.Invest.98，216
)和造血細胞群(Wiles和Keller，Development 111，259
)。作為例子，這允許擴增免疫相容細胞用于移植。該細胞之所以可以相容，因為它們是用本發(fā)明方法從移植受體克隆得到的。在另一個實施方案中，對擴增細胞進行遺傳修飾，例如，使它們不再表達免疫監(jiān)視的分子靶標，如妨礙非靈長類來源細胞成功移植到靈長類的Galαl-3Gal部分?？寺碓醇毎隗w外基質中的生長為克隆技術和組織工程之間提供了聯系(Kaihara和Vacanti，Arch.Surg.134，1184
)。因此，本發(fā)明方法產生的細胞群在移植醫(yī)學中有用。這里使用的定義2C，4C細胞的基因組含量(genomic complement)。1C代表單位基因組，因此定義為“C”。1C代表單倍體復制前細胞的基因組，其中每個座位出現一次。
2n細胞的二倍體狀態(tài)，“n”是指染色體的單倍體(單位)數量。
分化細胞群變得逐漸特化，通常是基因表達改變的結果。
克隆動物克隆產生的動物。其核基因組來自單一細胞的非嵌合后生動物。
克隆核染色體從核供體細胞轉移到居住染色體已被移走的受體細胞后，生產分化細胞群；該方法優(yōu)選使用去核卵母細胞作為受體細胞。這可發(fā)育這樣的后代，其非線粒體DNA來自單個培養(yǎng)細胞，核供體。
卵卵母細胞或最近受精的雌性配子。
胚胎卵母細胞發(fā)育活化后的任何階段，或另一種細胞類型模擬卵母細胞活化步驟后的任何階段。
胚胎干(ES)細胞來自植入前胚胎(胚泡)內細胞團(ICM)的那些細胞，具有下列性質(i)它們能經受長期實驗室培養(yǎng)和保存，(ii)它們保持未分化狀態(tài)，(iii)它們保持2n倍性，(iv)如果與胚胎的細胞混合并培養(yǎng)形成嵌合胚胎，它們能夠重新開始它們的發(fā)育程序并分化為任何細胞類型，包括功能性生殖細胞。ES細胞展現能被操作的同源重組，如在基因尋靶中。
ES細胞樣細胞來自胚泡ICM的培養(yǎng)細胞，但ES細胞性質沒有被完全證實。
胎兒胎盤形成后和足月(后代出生或分娩)前的發(fā)育階段。
活產活后代。
微絲細胞支架聚合肌動蛋白。
微管包含錨定和定向染色體的微管蛋白亞單位的亞細胞細絲。
核整個核或其一部分，其中核內容物至少包括能夠在缺乏任何其它非線粒體基因組的細胞中指導發(fā)育的最少的物質。
后代至少發(fā)育至足月的個體。
卵母細胞已經歷了減數分裂第一個中期并停滯于第二中期(中期II)的雌性配子。因此，卵母細胞沒有受精但處于可以參與正常受精的發(fā)育階段。卵母細胞可以排卵后在體內產生，或可以是允許隨后在體外成熟的手術分離的未成熟前體成熟的結果。
多潛能分化為多種細胞類型的任何一個的能力。它典型描述干細胞。
重建細胞通過將至少包括核供體細胞中存在的指導持續(xù)發(fā)育必需的最少套染色體的另外物質插入去核卵母細胞的方法制備的細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，重建細胞是具有插入其中的ES細胞核的去核卵母細胞。
足月完整期限。已經歷了胚胎在子宮發(fā)育的全部程序，相當于妊娠期。
合子最近受精的雌性配子，也稱為1-細胞胚胎。
試劑。除非另外說明，所有有機和無機化合物是實驗室級別或更高級別的，并購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。一般地除非另外說明，卵母細胞培養(yǎng)在補充了5.56mM D-葡萄糖的CZB培養(yǎng)基中(Chatot等，1989.J.Reprod Fert.86，679-688)。CZB培養(yǎng)基是81.6mM NaCl、4.8mM KCl、1.7mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.8mM KH2PO4、25.1mM NaHCO3、0.1mM Na2EDTA、31mM乳酸鈉、0.3mM丙酮酸鈉、7U/ml青霉素G、5U/ml硫酸鏈霉素和4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。輸卵管中的排卵卵母細胞的收集和它們隨后在顯微鏡載物臺上的顯微操作是在修飾的CZB(這里稱為CZB·H)中進行的，它是補充20mM Hepes但降低了NaHCO3(5mM)和BSA(3mg/ml)濃度的CZB；CZB·H的pH是7.4。CZB·H中的BSA可以用0.1mg/ml聚乙烯醇(PVA；冷水溶解，平均相對分子量約等于103)替代；BSA和PvA的作用都是降低顯微操作過程中注射移液管壁的粘性。PVA的潤滑效果比BSA持續(xù)更長時間，這使得在單個微量移液管重復用于廣泛顯微操作的過程將其包括在內是理想的。適當的時候，卵母細胞或重建細胞在缺乏CaCl2(即Ca2+)，但補充了誘導卵母細胞活化的試劑，以及一些情況下，補充了抑制胞質分裂的試劑的CZB中培養(yǎng)。
ES細胞在用于ES細胞的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Specialty Media，Lavallette，NJ)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補充了0.5％-15％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS；HyClone Laboratories，Logan，UT)、100U/ml青霉素-100μg/ml鏈霉素(Specialty Media)、0.2mM L-谷氨酸(Specialty Media)、1％(v/v)非必需氨基酸混合物(SpecialtyMedia)、1％(v/v)2-β巰基乙醇(Specialty Media)、1％(v/v)核苷混合物(Specialty Media)和1000U/ml重組白血病抑制因子(LIF)(GIBCO，Grand Island，NY)。FCS使用前在56℃熱滅活25分鐘。
動物。這些實施例中使用的動物根據實驗資源國家研究委員會協會實驗動物的管理和使用委員會制定的聯合指南(DHEW公開號[NIH]80-23，1985年修訂)飼養(yǎng)。
實施例1由成熟建立的ES細胞系E14制備核供體細胞這個實施例利用成熟建立和可廣泛獲得的ES細胞系，E14作為用于顯微注射給去核小鼠卵母細胞的核來源。E14細胞系來自小鼠胚泡129/Ola株(Hooper等，Nature 326，292
)。129/Ola親本株是A(野灰色)基因純合的，具有灰鼠毛色，這反映了其cchp/cchp基因型(灰鼠毛色是柔和的黃色)。ES細胞系E14來自這種小鼠株之一；129/Ola，來自Edinburgh，UK的Martin Hooper博士的實驗室。為了通過后代毛色識別由ES細胞核克隆的后代，需要選擇卵母細胞供體并飼養(yǎng)毛色與ES細胞來自的小鼠株不同的母本株。在一個方案中，E14細胞的核(遺傳上是灰鼠)被轉移到去核B6D2F1卵母細胞(遺傳上是黑色)中，在轉移到CD-1替代母親(遺傳上是白色)中后允許重建細胞發(fā)育。
低傳代E14細胞等分試樣(即傳代少于11次的細胞)在1990年獲得并在三個不同的實驗室進一步培養(yǎng)，共進行了31-39次傳代。這里報道的實施例中E14細胞的選擇被它們在產生基因尋靶小鼠(Mombaerts等，Proc.Nad.Acad.Sci.美國，88，3084
；Mombaerts等，Nature 360，225
；Itohara等，Cell 72，337
；Rodriguez等，Cell 87，199
)中的相當大有用性所支持。因此，E14細胞被證明在種系嵌合體的產生中是有效的，從這些種系嵌合體已建立了基因尋靶小鼠品系。E14培養(yǎng)物典型地呈現從大約10μm到大約18μm的細胞直徑范圍。無理論上的限制，推測小細胞(大約10μm到大約12μm)很可能在S期前并因此含有2C基因組含量(在2n染色體中)，以及較大細胞(大約16μm到大約18μm)通常在S期后，可能含有2-4C DNA(2n染色體)。
ES細胞在“用于ES細胞的DMEM”(Specialty Media，Phillipsburg，NJ)中生長，其中補充了0.5-15％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS)(Hyclone)、1000U白血病抑制因子(LIF)/ml(Gibco)，和下列試劑(Specialty Media)1％(v/v)青霉素-鏈霉素、1％(v/v)L-谷氨酰胺、1％(v/v)非必需氨基酸、1％(v/v)核苷和1％(v/v)β巰基乙醇。每隔24小時將細胞以1∶3或1∶4分裂，這反映了大約12小時的細胞周期期限，適當的時候，在用絲裂霉素C處理的來自胚胎13.5天小鼠的原代胚胎成纖維細胞的飼養(yǎng)層上進行培養(yǎng)。在這些情況下，顯微操作前，ES細胞在無飼養(yǎng)條件下培養(yǎng)至少一周；到核轉移的時候，培養(yǎng)物中檢測不到飼養(yǎng)細胞。
在缺乏飼養(yǎng)細胞的條件下ES細胞在補充15％(v/v)FCS和1000U/mlLIF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如期望在低[FCS]中生長，則逐步降低FCS的濃度。在5％(v/v)FCS的濃度下，與在15％(v/v)時細胞幾乎同樣活躍地分裂，幾乎沒有明顯分化。然而，當FCS濃度是4％(v/v)或更低時，細胞生長明顯地緩慢。當細胞在有0.75％或0.5％(v/v)FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，發(fā)生了廣泛細胞死亡，這種條件可能造成某些類型細胞“饑餓”并使它們退出了細胞周期(即進入G0期)。
為從培養(yǎng)物中制備單個ES細胞懸液，首先用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細胞。隨后用含胰蛋白酶(0.025％[w/v])和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA；0.75mM)在無Ca2+/Mg2+PBS中的混合物使細胞彼此之間以及和培養(yǎng)容器之間分開。接著通過輕微離心(2000g，5分鐘)和重懸(兩次在DMEM中，一次在PBS中)洗滌細胞三次，并以大約107/ml的濃度重懸于PBS培養(yǎng)基中。
ES細胞核收集前不超過2天(但通常在收集前立即)，將一滴大約2μl ES細胞懸液與補充了12％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(平均相對分子量，3.6×105)的20μl CZB·H混合；這里我們稱之為CZB·H-PVP。將混合物轉移到顯微鏡載物臺上進行顯微操作。
卵母細胞的去核。卵母細胞去核是通過吸入到用MB-U型裝置(PrimeTech Ltd.，Tsukuba，Ibaralci-ken，日本)經壓電驅動(piezo-actuation)已前進通過卵母細胞透明帶的微量移液管(內徑6μm)中而完成的。這個裝置使用壓電效應來使微量移液管尖部以高速度每個脈沖前進非常短的距離(大約0.5μm)。脈沖的強度和速度由控制器來調節(jié)，對于透明帶穿刺典型設置分別是2和4。
從雌性、8-12周齡的B6D2F1小鼠的輸卵管收集成熟卵母細胞，其中5U妊娠母馬血清促性腺激素(PMSG)和5U人絨毛膜促性腺激素(hCG)分別在卵母細胞收集前64和13-16小時，腹膜內系列給予該小鼠，使其超量排卵。卵母細胞立即置于含有0.1％(w/v)牛睪丸透明質酸酶(300U/mg，ICN Biochemicals Inc.，Costa Mesa，CA)的CZB·H中，25-30℃處理5-10分鐘，使其從周圍卵丘細胞中分離出來。通過使用移液管作系列轉移在CZB·H(無透明質酸酶)中洗滌無卵丘細胞的卵母細胞四次。洗過的卵母細胞隨后保持在一滴在水飽和的4％(在空氣中v/v)CO2中37℃下平衡的CZB(10-30μl)中，置于礦物油(E.R.Squibb and Sons，Princeton，NJ)下，預備用于顯微操作。
將無卵丘卵母細胞群(通常15-20個)轉移到顯微鏡載物臺上含有5μg/ml細胞松弛素B的一小滴CZB·H中。用帶孔移液管抵住進行顯微手術的卵母細胞，向去核移液管施加幾個壓電脈沖后，透明帶被“去核”。mII染色體-紡錘體復合體(可辨認的半透明區(qū))被吸出到移液管中，帶有最少量的卵母細胞細胞質。相對高溫(達到30℃)使mII板更容易辨認，原因是其半透明度增加。一組中所有卵母細胞去核(大約花費10分鐘)后，將它們轉移到無細胞松弛素B的CZB中并在那里37℃保持不超過2小時后，再返回到顯微鏡載物臺進行進一步操作。
用顯微注射法將ES細胞核轉移到去核卵母細胞中。這里，將ES細胞核轉移到如上所述制備的去核卵母細胞中。最好使用與卵母細胞去核時相同的微量移液管進行這種轉移。
為了將供體核顯微注射給去核卵母細胞，使用塑料皿(100mm×15mm；Falcon Plastics，Oxnard，CA，catalogue no.1001)的蓋(深度大約5mm)制成顯微注射室。一排或多排液滴，每排由兩個圓形小滴以及一個延長滴組成并沿著皿中線排列。第一個小滴(大約2μl；直徑2mm)，用于顯微注射移液管洗滌，是CZB·H-PVP。第二個小滴(大約2μl；直徑2mm)含有存在于CZB·H-PVP中的核供體細胞懸液。第三個(延長的)小滴(大約6μl；2×6mm)，用于去核的卵母細胞，是CZB·H。將整個皿，包括小滴，浸于礦物油(Squibb)中。將皿放置到裝備了Hoffman對比光調節(jié)器的倒置顯微鏡的載物臺上，準備用于顯微操作。
供體細胞核顯微注射給卵母細胞是通過壓電驅動顯微注射達到的。取出ES供體細胞的核，每個核被輕輕吸入和擠出顯微注射移液管(內徑大約7μm)，直到它們的核中基本上見不到細胞質的物質。這是為了使核組分不含細胞質污染物。有些情況下，需要實施少量(典型的是1次)壓電脈沖(低強度設置下)打破供體細胞的質膜。當核膜破裂，非染色體的核質成分能被洗掉。
5-10分鐘內將分離到移液管中的每個核顯微注射到各去核卵母細胞。在微量移液管被移入含有去核卵母細胞的小滴中前，在微量移液管中收集幾個細胞(典型地多達7個)的核形成一行裸核通常能加速核轉移過程。
去核卵母細胞被置于顯微鏡載物臺上一滴含有5μg/ml細胞松弛素B的CZB中。去核卵母細胞的透明帶抵住帶孔移液管的尖部并應用輕吸力將其固定在適當位置。然后，注射移液管的尖部向透明帶前進，并使其緊密接觸透明帶。用幾個壓電脈沖(如，強度1-2，速度1-2)來推進移液管，同時保持其內部輕度負壓。當移液管尖部通過透明帶，注射移液管內產生的圓柱形核心帶物質被擠到卵周隙中。接著，注射移液管內(典型地含有多達7個快速連續(xù)收獲的核)最前的供體核被推進，直到它接近針尖。然后，移液管又被機械推進直到其尖部幾乎到達卵母細胞皮層的對側。這使去核卵母細胞質膜(卵膜)產生了一個深的凹陷。接著，應用1或2個壓電脈沖(典型的強度1-2，速度1)穿刺凹陷的卵膜，ES細胞核組分被擠到卵質中，伴隨的介質＜1pl。然后輕輕撤回移液管，核留在卵質內。每個去核卵母細胞注射一個核。用這個方法在10-15分鐘內，典型顯微注射大約15-20個去核卵母細胞。所有注射在室溫進行，通常在25-30℃的范圍。
卵母細胞活化。ES細胞培養(yǎng)物典型地含有處于不同細胞周期階段的細胞，一些含有2n細胞典型的2C含量DNA，另一些已經經歷了DNA合成(S期)的復制循環(huán)，以致它們含有這個量的兩倍(4C DNA)，準備進行細胞分裂。DNA含量的差異是本發(fā)明方法預期的，因此需要在核轉移后對重建細胞進行不同的處理。處于不同細胞周期階段的細胞間的區(qū)別(如不同的DNA含量)在下面描述；這里我們將相對小直徑細胞(10-12μm，稱作“小”)與2C DNA以及相對大直徑細胞(16-18μm，稱作“大”)與4C DNA聯系起來。
相當于已接受來自小ES細胞的核的卵母細胞的重建細胞在CZB中(礦物油下，在空氣中4％v/v CO2飽和濕度，37℃下平衡)，孵育1-3個小時。接著，將這些細胞移到含10mM SrCl2和5.1/ml細胞松弛素B(從二甲基亞砜[DMSO]中的100×原液加入)的無Ca2+CZB中孵育6小時。這種處理誘導發(fā)育的活化，同時防止胞質分裂，并且因此，防止染色體以假第二極體形式損失。6小時后，細胞轉移到缺乏Sr2+/細胞松弛素B的新鮮CZB培養(yǎng)基中，并在37℃，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。因此，6小時后沒有抑制S期完成后的正常減數分裂。
相當于已接受來自大ES細胞的核的卵母細胞的重建細胞在CZB中(礦物油下，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度，37℃下平衡)，孵育多達2個小時。活化前培養(yǎng)將允許在刺激減數分裂和胞質分裂重新開始前，功能性地完成有利的大分子成分(如紡錘體微管)的合成。將細胞轉移到含10mM SrCl2的無Ca2+CZB中，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度下37℃1小時，啟動減數分裂的重新開始(活化)。注意這個培養(yǎng)基不含細胞松弛素B或任何其它阻斷胞質分裂的試劑。因此，這些活化的細胞排出了假第二極體。既然ES供體細胞的轉移核含有4C DNA，后來的姐妹染色單體分離和染色體丟失應當使胚胎恢復至2C的基因組DNA含量。
活化后，重建細胞接著被轉移到新鮮CZB中，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度下，37℃進行胚胎培養(yǎng)。這種方法產生的胚胎在活化后大約5小時，通常具有2個假前核和一個假第二極體。
基于細胞周期狀態(tài)選擇ES核供體細胞。我們推測小細胞處于G1期(2C DNA)，而大細胞相對于處于G2/M期的那些細胞(S期后，4C DNA)。這提供了一個快速和無損傷的細胞倍性的計量方法。通過使用經改造含有可無破壞性測定的報道基因衍生物(如突變的綠色熒光蛋白，EGRP)的ES細胞系(該報道基因衍生物處于指導細胞周期階段診斷性轉錄的啟動子控制之下)，能夠增強這種評定。這種啟動子的實例包括那些指導細胞周期蛋白D(限于細胞周期的G1期)或細胞周期蛋白B2(限于細胞周期的M期)轉錄的啟動子。該報道蛋白含有定向破壞序列(破壞盒)如長存于細胞周期蛋白中的序列。這確保了其半衰期短暫，且它的存在反映了啟動子活性(因此反映細胞周期階段)而不是蛋白的壽命。當報道基因是EGRP時，通過用長波長的表面熒光顯微鏡術檢查，可容易并無損傷地將處于特定細胞周期階段的細胞從非同步培養(yǎng)物中鑒定出來；只有那些細胞周期階段特異性啟動子活動的細胞具有熒光，使得可立即鑒定并選擇它們作為核轉移的供體。
最后，我們使Rl ES細胞接觸微管干擾劑諾考達唑(Sigma)3μg/ml12小時。這種方法處理的培養(yǎng)物與未處理的培養(yǎng)物相比，發(fā)生了戲劇性的改變，出現了許多圓形和漂浮的細胞。這種處理的作用是通過防止細胞完成中期，使ES細胞培養(yǎng)物同步。這種細胞的基因組含量是4C，因為它們已完成了S期無減數循環(huán)的復制DNA合成。
胚胎轉移。在一滴CAB(10-30μl)中(礦物油下(Squibb)，在水飽和的4％(在空氣中v/v)CO2中37℃下平衡)，培養(yǎng)3.5-4天后，檢測桑椹胚/胚泡，并且適當的時候，轉移到受體白化病CD1雌性小鼠的子宮角中，該小鼠在3天前與切除輸精管的CD-1雄性小鼠交配；這在胚胎發(fā)育和子宮內膜的發(fā)育間建立了協調。雌性或者允許分娩并撫養(yǎng)它們的替代后代，或者在交配(coitum)后19.5天通過剖腹產分娩幼畜并給予幼畜合適的哺乳母親的照顧。實施例2用ES細胞核克隆進行以下實驗，其中用來自各種ES細胞系的細胞核顯微注射去核卵母細胞，用最初來自小鼠自交和F1系的成熟建立的細胞系示例。我們描述了核供體ES細胞在各種條件下培養(yǎng)進行實驗所產生的后代，并進一步用不同倍性的供體細胞證明了本發(fā)明的方法。
核轉移到去核卵母細胞后ES細胞染色體的命運。在實驗系列1(圖2)中，接受E14核的去核卵母細胞沒有進行活化刺激。因此這種重建卵母細胞停滯在mII。在小細胞的核顯微注射后2-4小時我們作了檢查，51％的重建卵母細胞具有以分散形式排列的凝聚染色體。相比之下，用來自大細胞的核注射的68％卵母細胞具有以規(guī)律陣列排列的凝聚染色體，類似在成熟中期II卵母細胞中母系來源的染色體。
在實驗系列2(圖3)，我們在核轉移后給重建細胞作活化刺激(鍶離子，Sr2+)。預期小和大細胞DNA含量的潛在差異，因此我們對每種細胞型所用的核轉移方案進行了修改。用小細胞的核重建的卵母細胞在核顯微注射后約4小時，從CZB培養(yǎng)基中移走，并置于含有Sr2+(為了活化它們)和細胞松弛素B(為了防止胞質分裂)的培養(yǎng)基中。我們包括了細胞松弛素B，是因為在它缺乏時，供體染色體將被半隨機地擠出成為假第二極體，產生無活力的亞二倍體胚胎。我們由小細胞核產生的胚胎中，活化后約6小時檢測有78％含有兩個假前核(圖3)，推測是由于細胞內染色體在假前核形成前常常形成2個簇。
相比之下，用大ES細胞的核重建的每個卵母細胞的活化都在細胞松弛素B缺乏下進行，因為我們推論假第二極體的胞質分裂擠出預期會在許多這種情況下使重建細胞重新建立正常的2C DNA含量。我們注意到在細胞松弛素B缺乏下活化后，68％的1-細胞胚胎含有單一假前核并釋發(fā)出假第二極體(圖3)。
由E14細胞克隆的小鼠的足月發(fā)育。圖4總結了實驗系列3得到的結果，其中用來自不同大小的E14細胞的核重建1765個卵母細胞并在不同濃度的FCS存在下生長。我們沒有發(fā)現證據表明培養(yǎng)基中FCS的濃度對ES細胞核指導發(fā)育為桑椹胚/胚泡期的能力有顯著的影響。
小細胞的核轉移后，17％的活化卵母細胞產生了桑椹胚/胚泡。轉移到合適的替代母親后，62％的所得胚胎被植入，在活化后20天(dpa)產生了9個胎兒；通過剖腹切開分娩了4個活后代，5個胎兒在15-17dpa停止發(fā)育。
一個活產仔由于缺乏代孕母親而安樂死，2個在分娩后24小時死亡。一個小鼠(稱作“Hooper”)存活，是灰色毛色和粉紅色眼睛的雄性。這些特性是預知的，因為E14是來自雄性129/Ola小鼠品系的XY細胞系；129/Ola小鼠具有灰色毛色和粉紅色眼睛。所有發(fā)育至足月的小仔也是無著色眼睛的雄性。Hooper與CD-1雌性交配時產下三窩仔，共33只表面正常的仔。
大細胞核轉移后，37％成功活化的卵母細胞在體外培養(yǎng)3.5天后，發(fā)育至桑椹胚/胚泡期。在被轉移的胚胎中，67％植入到子宮中。在20dpa，剖腹切開將一個完全長大、表面正常仔和3個死胎兒(在15-17dpa停止發(fā)育)移出。我們從ES細胞來源克隆小鼠的胎盤和Hooper的耳活檢物分離了基因組DNA，并對樣本進行聚合酶鏈式反應(PCR)分析，尋找多態(tài)性標記和Y染色體特異性基因Zfy的存在。這些分析進一步證實了克隆仔的E14起源。
這些效率的大小意味著本發(fā)明的方法易于重復。然而，與發(fā)明的補充實施方案聯合可以進一步增強該方法的效率，在補充實施方案中胚胎是由ES細胞和根據本發(fā)明方法核轉移產生的來自ES細胞的胚胎細胞的混合物形成的。
從R1 ES細胞核轉移后胚胎的發(fā)育。在實驗系列4(圖5)中，我們用來自F1雜種129/Sv×129/Sv-CP的細胞系R1實施了1087個核轉移。FCS濃度對克隆結果沒有明顯的影響。然而，R1細胞的克隆效率明顯高于E14細胞。從314個轉移的桑椹胚/胚泡得到了26個活產克隆仔(8.3％)。PCR分析支持它們的克隆起源。
因為大E14細胞的核，在適當的實驗條件下，能夠支持轉移后的所有發(fā)育，所以在第五個實驗系列(系列5)中，我們用R1細胞進行了類似實驗。這里，代替了簡單選擇大R1細胞，在核轉移前，我們使培養(yǎng)物接觸諾考達唑12小時，使培養(yǎng)物中細胞同步處于M期，使得它們含有4CDNA。所得后代的比例與小R1細胞相應的值沒有明顯的差異。出生了三個活產克隆。這進一步提示核供體倍性或細胞周期階段都不是克隆中關鍵的參數。實施例3用基因打靶ES細胞的核進行克隆本方法的有用性通過其在從含有定向突變的ES細胞系產生后代中的用途而闡明。
基因打靶ES細胞的產生。包含定向突變的ES細胞系來自E14。該系(Zheng和Mombaerts描述；提交發(fā)表)是用M72→VRi2-IRES-tauGFP構建體電穿孔E14細胞，隨后如所描述(Mombaerts等，Cell 87，675
)進行培養(yǎng)而產生的。一個攜帶該突變的所得細胞系，T15，在胚泡注射后產生了軀體組織和種系廣泛集群的嵌合體。因此，我們估計了這個系提供本發(fā)明克隆方法中的核供體的能力。
由基因打靶E14細胞系T15克隆小鼠的發(fā)育。選擇小T15細胞(估計平均直徑大約12μm和2n倍性、2C)并如上所述將它們的核轉移產生重建細胞。T15這樣核轉移后，成功重建了252個細胞并在體外培養(yǎng)。培養(yǎng)3.5天后，91個(36％)已發(fā)育至桑椹胚/胚泡期。它們轉移到假孕代孕母親使發(fā)育繼續(xù)。
剖腹切開交配(coitum)后19.5天的代孕母親，顯示8個死胎(轉移胚胎的9％)和一個活產克隆。這表明來自含有定向突變的細胞的核可用來通過這里描述的本發(fā)明的方法克隆產生后代。實施例4ES細胞樣細胞的獲得胚胎可以通過體外受精或自然交配和收獲而產生。植入前胚胎在體外至胚泡期的發(fā)育是在Gardner等，Fertil.Steril.69，84(1998)描述的G1.2或G2.2培養(yǎng)基中進行。用兔抗BeWo細胞的抗血清免疫外科分離所選胚泡的ICM的細胞，如前所述(Thomson等，Proc.Nad.Acad.Sci.美國92，7844
；Solter和Knowles，Proc.Nad.Acad Sci.美國72，5099
)。細胞各自鋪到含有預先形成的輻射小鼠胚胎成纖維細胞層和1ml培養(yǎng)基的10mm孔組織培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基由80％Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基(無丙酮酸鹽，高葡糖配方；Gibco-BRL)，補充20％FCS(Hyclone)、1mM谷氨酰胺、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸貯液(GIBCO-BRL)組成。
進一步培養(yǎng)9-15天后，通過接觸含有1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽水，或接觸分散酶，或用巴斯德移液管機械分散，把來自內細胞團的生長暈分成含有3或4個細胞的小團。該較小的團轉移到新鮮飼養(yǎng)細胞組織培養(yǎng)孔中。進一步生長后，選擇形態(tài)均勻未分化的獨立集落并重新鋪板如前所述。
據其形態(tài)學可鑒定的原代ES細胞樣集落，通過接觸IV型膠原酶(1mg/ml；GIBCO-BRL)或用巴斯德移液管選擇單個集落后進行傳代和擴增。
已知次最優(yōu)培養(yǎng)條件可產生經歷核型改變、染色體重排和/或增加其生長速率并減少其在體內分化能力的其它突變的ES細胞變異體。傳代2-7次時對每個ES細胞樣系進行核型分析，丟棄核型異常的那些系。
最佳培養(yǎng)條件是本領域技術人員已知的。所有培養(yǎng)基、補充物、塑料器具等應該不含內毒素。已經描述了牛(Cibelli等，Theriogenology47，241
)、倉鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224
)、人(Thomson等，Science 282，1145
)和兔(Schoonjans et al.，Mol.Reprod.Dev.45，439
)的ES細胞樣培養(yǎng)物的衍生。
這里引用的所有專利和參考文獻通過參考文獻的方式引入。我們進一步通過參考文獻的方式特別引入了Wakayama等，ProceedingNational Academy of Sciences，美國，96(26)14984-14989(1999年12月21日)的全部。
權利要求
1.克隆胚胎的方法，包括步驟(a)收集培養(yǎng)細胞的核；(b)將(a)的核或其包括染色體的至少一部分顯微注射到去核卵母細胞中，重建細胞；和(c)允許重建細胞進行胚胎發(fā)育。
2.權利要求
1的方法，其中顯微注射是壓電驅動的顯微注射。
3.權利要求
1的方法，其中允許胚胎發(fā)育為活后代。
4.權利要求
3的方法，其中允許所得胚胎發(fā)育為活后代的步驟進一步包括將該胚胎轉移給雌性替代受體的分步。
5.權利要求
1的方法，其中培養(yǎng)細胞是胚胎干(ES)細胞。
6.權利要求
5的方法，其中ES細胞來自ES細胞系。
7.權利要求
6的方法，其中ES細胞系來自F1小鼠系。
8.權利要求
7的方法，其中ES細胞系是R1。
9.權利要求
6的方法，其中ES細胞系來自近交小鼠系。
10.權利要求
9的方法，其中ES細胞系是E14。
11.權利要求
1的方法，其中培養(yǎng)細胞是ES細胞樣細胞。
12.權利要求
9的方法，其中ES細胞樣細胞來自選自靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids、嚙齒類動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物和魚類的動物。
13.權利要求
1的方法，其中培養(yǎng)細胞是胚胎生殖(EG)細胞。
14.權利要求
12的方法，其中EG細胞來自選自靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids和嚙齒類動物如鼠的哺乳動物。
15.權利要求
15的方法，其中哺乳動物是豬。
16.權利要求
1的方法，其中步驟(a)中的細胞核具有2n染色體。
17.權利要求
1的方法，其中步驟(a)中的細胞核含有2-4C基因組DNA。
18.權利要求
1的方法，其中步驟(a)中的細胞被遺傳改變。
19.權利要求
18的方法，其中遺傳改變是通過基因尋靶進行的。
20.權利要求
16的方法，其中細胞核來自ES細胞。
21.權利要求
17的方法，其中細胞核來自ES細胞。
22.權利要求
18的方法，其中遺傳改變的細胞是ES細胞。
23.權利要求
22的方法，其中遺傳改變是通過基因尋靶進行的。
24.權利要求
1的方法，其中步驟(b)中的去核卵母細胞停滯在第二次減數分裂的中期。
25.權利要求
1的方法，進一步包括在細胞核或其一部分插入前、或插入過程中、或插入后活化卵母細胞的步驟。
26.權利要求
25的方法，其中活化步驟發(fā)生在插入步驟后大約0-6小時。
27.權利要求
25的方法，其中活化步驟發(fā)生在細胞核或其一部分插入后大約1-3小時。
28.權利要求
25的方法，其中活化步驟包括電活化或接觸化學活化劑。
29.權利要求
28的方法，其中化學活化劑選自乙醇、精子胞質因子、卵母細胞受體配體肽模擬物、Ca2+釋放藥理學刺激劑、Ca2+離子載體、鍶離子、磷蛋白信號傳導調節(jié)劑、蛋白合成抑制劑或它們的組合。
30.權利要求
28的方法，其中化學活化劑選自咖啡因、Ca2+離子載體A23187、乙醇、2-氨基嘌呤、星形孢菌素、鞘氨醇、環(huán)己酰胺、離子霉素、6-二甲氨基嘌呤、精子攜帶的可溶性卵母細胞活化因子-I(SOAF-Is)或它們的組合。
31.權利要求
28的方法，其中活化劑包含Sr2+。
32.權利要求
1的方法，進一步包括在插入步驟(b)前或后一段時間間隔中，干擾卵母細胞中微管和/或微絲組裝的步驟。
33.權利要求
32的方法，其中時間間隔是大約0-6小時。
34.權利要求
32的方法，其中微管組裝被諾考達唑或二甲氨基嘌呤抑制。
35.權利要求
32的方法，其中微絲組裝被細胞松弛素B、細胞松弛素D、jasplakinolide、拉春庫林A或它們的組合干擾。
36.權利要求
1的方法，其中步驟(b)進一步包括將除了細胞核部分以外的試劑插入到所述卵母細胞的細胞質中。
37.權利要求
34的方法，其中試劑選自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗體、藥理學試劑和它們的組合。
38.權利要求
37的方法，其中試劑是外源核酸或核酸衍生物。
39.克隆得到分化細胞的方法，包括步驟(a)收集ES細胞的核；(b)將包括染色體的ES細胞核的至少一部分顯微注射到去核卵母細胞中，形成重建細胞；(c)活化前，培養(yǎng)重建細胞0-6小時；(d)活化重建細胞的發(fā)育；和(e)允許重建細胞發(fā)育。
40.權利要求
39的方法，其中步驟(a)的核是2C。
41.權利要求
39的方法，其中步驟(a)的核是2-4C。
42.權利要求
39的方法，其中進一步允許步驟(e)的重建細胞發(fā)育為胚胎。
43.權利要求
39的方法，其中活化步驟(d)包括接觸化學活化劑。
44.權利要求
43的方法，其中活化劑包括Sr2+。
45.權利要求
43的方法，其中接觸進行不超過大約6小時的一段時間。
46.權利要求
39的方法，其中活化步驟(d)在微管和/或微絲組裝抑制劑存在下進行。
47.權利要求
45的方法，其中微管和/或微絲組裝抑制劑包含細胞松弛素B。
48.克隆得到分化細胞的方法，包括步驟(a)收集細胞的核；(b)將包括染色體的(a)的細胞核的至少一部分顯微注射到去核卵母細胞中，形成重建細胞；(c)允許重建細胞發(fā)育為桑椹胚/胚泡；(d)收集ES細胞；(e)將(d)的ES細胞導入(c)的桑椹胚/胚泡中；(f)允許(e)的重建胚胎發(fā)育。
49.權利要求
48的方法，其中進一步允許步驟(f)的重建細胞發(fā)育為成活胚胎。
50.權利要求
48的方法，其中步驟(a)的細胞是ES細胞。
51.權利要求
50的方法，其中ES細胞是在體外培養(yǎng)的。
52.權利要求
48的方法，其中步驟(a)的細胞是與步驟(d)的ES細胞來自相同培養(yǎng)物的ES細胞。
53.權利要求
1的方法產生的分化細胞。
54.權利要求
1的方法產生的動物，其核染色體來自培養(yǎng)細胞的核。
55.權利要求
54的方法產生的動物，其中培養(yǎng)細胞是ES細胞。
56.權利要求
54的動物，其中ES細胞包含重組DNA且所得動物包含該重組DNA。
57.權利要求
54的動物，其中重組DNA是基因組整合的。
58.權利要求
57的動物，其中重組DNA通過基因尋靶導入。
59.權利要求
57的動物，其中動物選自哺乳動物、兩棲動物、魚類和鳥類。
60.權利要求
57的動物，其中動物是哺乳動物。
61.權利要求
60的動物，其中哺乳動物選自靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids和鼠。
62.權利要求
61的動物，其中哺乳動物是小鼠。
63.權利要求
61的動物，其中哺乳動物是豬。
64.權利要求
61的動物，其中哺乳動物是母牛。
65.調節(jié)胚胎學發(fā)育的方法，包括步驟(a)將ES細胞的核與去核卵母細胞組合形成重建細胞；(b)在組合步驟之前、或過程中、或之后，將試劑插入到卵母細胞的細胞質中；和(c)允許試劑處理的重建細胞發(fā)育。
66.權利要求
65的方法，其中進一步允許步驟(c)的重建細胞發(fā)育為成活胚胎。
67.權利要求
65的方法，其中步驟(b)的試劑選自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗體、藥理學試劑、和外源核酸、外源核酸的衍生物，或它們的組合。
68.權利要求
65的方法，其中ES細胞含有正常DNA量的兩倍。
69.權利要求
68的方法，其中顯微注射是壓電驅動的顯微注射。
70.權利要求
1的方法，其中將所得胚胎解離，并允許其細胞分化成一個或多個細胞系。
71.權利要求
1的方法，其中細胞系是心肌細胞、神經元細胞或造血細胞。
72.權利要求
70的方法產生的細胞。
專利摘要
提供了一種核轉移方法,其中核DNA整個或部分被注射到去核卵母細胞中。該方法適合于不同的供體核,并優(yōu)選ES細胞。
文檔編號C12N5/10GKCN1423522SQ00818200
公開日2003年6月11日 申請日期2000年12月20日
發(fā)明者安東尼·C·F·佩里, 彼得·蒙伯特斯, 和歌山輝彥 申請人:安東尼·C·F·佩里, 彼得·蒙伯特斯, 和歌山輝彥導出引文