專利名稱:提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法。
技術(shù)背景農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法所具有的優(yōu)點(diǎn)是，轉(zhuǎn)基因效率高，基因拷貝數(shù)少，而且不會(huì)使T-DNA特定區(qū)域片斷化，由于培養(yǎng)時(shí)間短，所以獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)體變異小。故此，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法被廣泛應(yīng)用于各種植物，它是植物轉(zhuǎn)基因的最有效方法。
雖然農(nóng)桿菌法是非常好的植物轉(zhuǎn)基因方法，但是實(shí)際上這種轉(zhuǎn)基因是否能成功以及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率如何均依賴于植物的種類、基因型以及所使用的植物組織，由于這些要素的原因它們會(huì)產(chǎn)生很大的差異(Potrykus etal.1998(參考文獻(xiàn)(33)))。也就是說，除了有的植物在轉(zhuǎn)基因中沒有成功外，還有很多植物僅有極少部分的品種可以轉(zhuǎn)導(dǎo)。有的植物其可利用的組織非常有限不能大量地用作植物材料。通過基因重組培育更為實(shí)用的品種，在培育很多轉(zhuǎn)基因植物之后，必需篩選能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的系統(tǒng)。然而，容易得到轉(zhuǎn)導(dǎo)體的作物其種類還是有限。因此，現(xiàn)在亟需開發(fā)能夠解決上述問題的改進(jìn)技術(shù)方案。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法盡管由于植物種類不同所提供的實(shí)驗(yàn)材料和培養(yǎng)基的組成等有差異，但是在下面所述的操作中幾乎完全一樣，即將植物組織加入農(nóng)桿菌懸浮液中，經(jīng)共培養(yǎng)后，篩選轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，培育轉(zhuǎn)基因植物。通常根據(jù)需要對(duì)植物組織進(jìn)行滅菌處理，使農(nóng)桿菌感染植物，除此之外不做特別處理(Rogers et al.1988(參考文獻(xiàn)(34))、Visser 1991(參考文獻(xiàn)(38))、McCormick 1991(參考文獻(xiàn)(29)))、Lindsey et al.1991(參考文獻(xiàn)(28)))。從而，以農(nóng)桿菌的菌系、載體類型、培養(yǎng)基組成、選擇性標(biāo)記基因和啟動(dòng)子類型以及組織材料的種類為中心開展了轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的改良研究。
對(duì)此，基于這樣一種考慮，在沒有接種農(nóng)桿菌之前使植物組織處于易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的生理狀態(tài)，但是這項(xiàng)研究還沒有人做。通過一種處理方式如果能改變其生理狀態(tài)其利用價(jià)值是非?？捎^的，除了提高轉(zhuǎn)基因效率外，還能夠?qū)⒁郧昂茈y實(shí)施的植物種類和基因類型經(jīng)過轉(zhuǎn)基因而獲得顯著的效果。關(guān)于對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理的研究，如粒子槍法(Bidney et al.，1992(參考文獻(xiàn)(5)))及超聲處理(Trick et al.，1997(參考文獻(xiàn)(37)))。這種預(yù)處理的目的是為了通過物理性損傷植物組織使細(xì)菌進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)，來增加植物細(xì)胞感染的數(shù)量。但是這種方法只不過比從前廣泛使用的盤片法(Horsch et al.，1985(參考文獻(xiàn)(17)))向前發(fā)展了一步，它并不是改進(jìn)的新方法。另外該方法的效果和推廣性至今還不清楚，它不能作為一般的方法來使用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，基于上述的技術(shù)背景，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法，該方法比從前的農(nóng)桿菌法的轉(zhuǎn)基因效率高并對(duì)組織沒有傷害又很容易轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
本發(fā)明人經(jīng)過刻苦鉆研終于完成了本發(fā)明任務(wù)，即在使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的方面，通過對(duì)用于轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞或植物組織進(jìn)行離心處理，可以有效地提高轉(zhuǎn)基因的效率。
也就是說，本發(fā)明提供一種通過離心處理植物細(xì)胞或植物組織來提高農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法。
本發(fā)明提供的提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法，要比從前農(nóng)桿菌法的轉(zhuǎn)基因效率高并對(duì)組織沒有傷害又可簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。本發(fā)明方法既適用于單子葉植物又適用于雙子葉植物。



圖1表示本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的超二元載體pTOK233的構(gòu)建方法。
圖2表示本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的超二元載體pSB133的基因圖。
圖3表示農(nóng)桿菌屬細(xì)菌中2種主要載體系統(tǒng)即中間載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng)的構(gòu)建過程的模式圖。
圖4表示來源于農(nóng)桿菌強(qiáng)病原性菌系A(chǔ)281的2種二元載體系統(tǒng)的模式圖。
另外，在上述各圖中，其符號(hào)意義表示如下virB 存在于根癌農(nóng)桿菌A281上的Ti質(zhì)粒pTiBo542致毒區(qū)中的virB基因virC 存在于根癌農(nóng)桿菌A281上的Ti質(zhì)粒pTiBo542致毒區(qū)中的virC基因virG 存在于根癌農(nóng)桿菌A281上的Ti質(zhì)粒pTiBo542致毒區(qū)中的virG基因BL 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌T-DNA的左側(cè)基本序列BR 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌T-DNA的左側(cè)基本序列TC 抗四環(huán)素藥性基因SP 抗大觀霉素藥性基因IG 內(nèi)含子GUS基因HPT 抗潮霉素藥性基因K 限制酶Kpn I位點(diǎn)H 限制酶Hind III位點(diǎn)Ampr 抗氨芐青霉素藥性基因BAR bar基因Pnos 胭脂堿合酶基因的啟動(dòng)子Tnos 胭脂堿合酶基因的終止子P35S CaMV 35S啟動(dòng)子COS，cos λ噬菌體COS位點(diǎn)ORI，ori CoIE1復(fù)制起始點(diǎn)NPI，NPTII 抗卡那霉素藥性基因Vir 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌Ti質(zhì)粒的完整vir區(qū)域S Vir 強(qiáng)病原性農(nóng)桿菌屬細(xì)菌Ti質(zhì)粒pTiBo542的完整vir區(qū)域s vir*Ti質(zhì)粒pTiBo542vir區(qū)域的部分片斷本發(fā)明的
具體實(shí)施方式
本發(fā)明方法在使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的同時(shí)還對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的植物細(xì)胞或植物組織進(jìn)行離心處理。植物細(xì)胞或植物組織經(jīng)離心后，在通常的重力下可與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸，也可以邊離心邊與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸。優(yōu)選植物細(xì)胞或植物組織經(jīng)離心后在通常重力下與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸。
根據(jù)植物種類的不同，選擇不同離心條件，但通常離心速度的范圍為100G-25萬G，優(yōu)選500G-20萬G，更優(yōu)選1000G-15萬G。離心處理時(shí)間可根據(jù)離心速度及植物種類等適當(dāng)?shù)剡x擇，但通常優(yōu)選1秒鐘以上。雖然沒有離心的上限，但是通常以10分鐘左右為宜。離心處理時(shí)間的選擇應(yīng)考慮，當(dāng)加大離心速度時(shí)，所需時(shí)間極短，例如即使在1秒鐘以下也可以提高轉(zhuǎn)基因的效率。當(dāng)減少離心速度時(shí)，由于延長(zhǎng)離心時(shí)間也可以有效地提高轉(zhuǎn)基因效率。在大多數(shù)情況下，特別優(yōu)選離心處理?xiàng)l件為500G-20萬G，更優(yōu)選1000G-15萬G，時(shí)間為1秒鐘-2小時(shí)，對(duì)植物細(xì)胞或植物組織來說適宜的離心條件可以根據(jù)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
本發(fā)明方法的特征為，使與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸的植物細(xì)胞或植物組織作為離心處理的材料，或者邊離心邊與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸，通過使用常規(guī)方法介導(dǎo)農(nóng)桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或其原有轉(zhuǎn)基因法也是適用的。
在本領(lǐng)域通常廣泛使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)的植物的轉(zhuǎn)導(dǎo)基因或轉(zhuǎn)基因法。
自古以來，人們已知根癌農(nóng)桿菌在很多雙子葉植物中引起冠癭病(crown gall disease)，在七十年代，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒與病原性有關(guān)，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒中的一段致瘤基因T-DNA被整合至植物的染色體上。還得知在T-DNA上有誘發(fā)腫瘤所必需的與激素(細(xì)胞因子和植物生長(zhǎng)激素)合成相關(guān)的基因，同時(shí)在植物中還發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌基因。T-DNA的切除對(duì)植物的轉(zhuǎn)導(dǎo)在Ti質(zhì)粒上都需要致毒區(qū)域(vir區(qū)域)的基因群，由于T-DNA被切除而T-DNA兩端都需要基本序列。其它農(nóng)桿菌屬細(xì)菌發(fā)根植物單胞菌的Ri質(zhì)粒上也具有同樣的系統(tǒng)(圖3和圖4)。
T-DNA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)可以整合到植物染色體上，因此希望在T-DNA上插入所要的基因也能被整合到植物染色體上。但是Ti質(zhì)粒是一個(gè)很大的分子，其分子量超過190kb以上，所以用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程學(xué)技術(shù)很難將基因插入到質(zhì)粒T-DNA之上。由此，本發(fā)明人開發(fā)了將外源基因插入T-DNA上的方法。
首先，從腫瘤Ti質(zhì)粒T-DNA中切除并制備激素合成基因的disarm型菌系LBA4404(Hoekema et al.，1983(參考文獻(xiàn)(12))、C58C1(pGV3850)(Zambryski et al.，1983(參考文獻(xiàn)(40)，GV3Ti11SE(Fraley etal.，1985(參考文獻(xiàn)(9))等(圖3)。在這個(gè)菌系里開發(fā)了2種轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，它包括將所要的基因?qū)朕r(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA，或者將具有所要基因的T-DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌。其中一個(gè)基因操作方法很容易地把所要的基因插入目的對(duì)象中，用大腸桿菌將可以復(fù)制的中間載體通過三親雜交法(triparentalmating)(Ditta et al.，1980(參考文獻(xiàn)(8)))的同源重組導(dǎo)入至農(nóng)桿菌disarm型Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域，把這中間載體稱其為中間載體法(Fraleyet al.，1985(參考文獻(xiàn)(9))；Fraley et al.，1983(參考文獻(xiàn)(10))；Zambryski et al.，1983(參考文獻(xiàn)(40))、特開昭59-140885號(hào)(EP116718))。另一個(gè)基因操作方法是基于被稱為二元載體法(binary vector)(圖3)，T-DNA整合至植物需要vir區(qū)域，但是由于它們的功能相同無須在同一質(zhì)粒上(Hoekema et al.，1983)。在這個(gè)vir區(qū)域上有virA、virB、virC、virD、virE及virG(植物生物技術(shù)事典(エンタプライズ株式會(huì)社出版1989))，所說vir區(qū)域是指該區(qū)域包括全部的virA、virB、virC、virD、virE及virG。因此，二元載體把T-DNA整合至農(nóng)桿菌和大腸桿菌里可復(fù)制的很小的質(zhì)粒上，再把它導(dǎo)入農(nóng)桿菌disarm型Ti質(zhì)粒上。所述將二元載體導(dǎo)入至農(nóng)桿菌可利用電穿孔法和三親雜交法。二元載體包括pBIN19(Bevan，1984(參考文獻(xiàn)(4)))，pBI121(Jefferson，1987(參考文獻(xiàn)(19)))，pGA482(An et al.，1988(參考文獻(xiàn)(2))，特開昭60-70080號(hào)(EP120516))等，再以這些二元載體為基礎(chǔ)構(gòu)建很多新的二元載體，并用于轉(zhuǎn)基因植物。在Ri質(zhì)粒系統(tǒng)中用同樣的載體也構(gòu)建了轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。
農(nóng)桿菌A281(Watson et al.，1975(參考文獻(xiàn)(39)))是超烈性病原性菌系(super-virulent)，其宿主范圍很廣，轉(zhuǎn)基因效率也高于其它菌系(Hood et al.，1987(參考文獻(xiàn)(13))；Komari，1989(參考文獻(xiàn)(21)))。這種特性是由A281Ti的質(zhì)粒pTiBo542表現(xiàn)出來的(Hood et al.，1984(參考文獻(xiàn)(16)；Jin et al.，1987(參考文獻(xiàn)(20)；Komari et al.，1986(參考文獻(xiàn)(24)))。
迄今為止，用pTiBo542已開發(fā)了2個(gè)新系統(tǒng)。一個(gè)系統(tǒng)是使用具有pTiBo542這種disarm型Ti質(zhì)粒的菌系EHA101(Hood et al.，1986)及EHA105(Hood et al.，1993)，把該菌系應(yīng)用于上述二元載體系統(tǒng)，由此，可使轉(zhuǎn)導(dǎo)能力強(qiáng)的體系進(jìn)行各種植物的轉(zhuǎn)基因。另一個(gè)體系是超二元載體(‘super-binary’vector)(Hiei et al.，1994(參考文獻(xiàn)(11))；Ishidaet al.，1996(參考文獻(xiàn)(18))；Komari et al.，1999(參考文獻(xiàn)(26))；WO94/00977號(hào)、WO95/06722號(hào))(圖4)。該體系由兩種質(zhì)粒構(gòu)成，其中選擇一種作為超二元載體系統(tǒng)兩種質(zhì)粒構(gòu)成包括vir區(qū)域(virA、virB、virC、virD、virE及virG(以下分別將它們稱作“片斷區(qū)域”))disarm型Ti質(zhì)粒及T-DNA質(zhì)粒。其中不同的是使用了包含T-DNA的質(zhì)粒，即在二元載體vir片斷區(qū)域中，至少有一個(gè)vir片斷區(qū)域被除掉，把含有被除掉的vir區(qū)域的片斷(其中至少優(yōu)選包含virB或virG的片斷，更優(yōu)選包含virB和virG的片斷)整合至超二元載體(Komari.1990a(參考文獻(xiàn)(22))上。它們可通過三親雜交法的同源重組(Komari et al，.1996(參考文獻(xiàn)(25))把已經(jīng)整合上的所要基因T-DNA導(dǎo)入超二元載體農(nóng)桿菌上?，F(xiàn)已弄清這個(gè)超二元載體系統(tǒng)與上述的其他各種載體系統(tǒng)相比在很多植物種類中具有高效的轉(zhuǎn)基因效率(Hiei et al.，1994(參考文獻(xiàn)(11))；Ishida et al.，1996(參考文獻(xiàn)(18))；Komari.1990b(參考文獻(xiàn)(23))；Li et al.，1996(參考文獻(xiàn)(27))；Saito et al.，1992(參考文獻(xiàn)(35)))。
在本發(fā)明中雖然對(duì)農(nóng)桿菌屬細(xì)菌的宿主不作特殊的限定，但優(yōu)選使用根癌農(nóng)桿菌(如，上述的根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Hoekema et al.，1983(參考文獻(xiàn)(12)))及EHA101(Hood et al.，1986參考文獻(xiàn)(15)))。
根據(jù)本發(fā)明的方法，如果是基于農(nóng)桿菌屬細(xì)菌病原性(vir)區(qū)域基因群表達(dá)的轉(zhuǎn)基因體系，則可以獲得明顯的轉(zhuǎn)基因效果。因此，對(duì)于上述任何載體系統(tǒng)中的中間載體、二元載體、超烈性病原性二元載體、超二元載體等均適用于本發(fā)明，并且能夠達(dá)到本發(fā)明的效果。改變這些載體類型，使用不同的載體體系也會(huì)得到同樣的效果(如，把農(nóng)桿菌屬細(xì)菌vir區(qū)域的一部分或全部切除，附加整合至質(zhì)粒中，vir區(qū)域的部分或全部被切除后可以作為新的質(zhì)粒被導(dǎo)入農(nóng)桿菌里)。當(dāng)然根據(jù)本發(fā)明方法可以提高野生型農(nóng)桿菌屬細(xì)菌中的野生型T-NDA區(qū)域的植物轉(zhuǎn)基因效率，換句話說就是提高感染的效率。
將所要基因轉(zhuǎn)移給植物，可以通過常規(guī)的方法整合至所述質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的限制酶位點(diǎn)上，或者在該質(zhì)粒上，同時(shí)通過適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記可以篩選出已經(jīng)整合有抗卡那霉素、巴龍霉素等抗藥性的基因等，所述藥物為其它所用。大型的且具有很多限制位點(diǎn)的基因有時(shí)用常規(guī)的亞克隆方法未必能把所要的基因轉(zhuǎn)移至T-DNA質(zhì)粒上。在這種情況下，通過三親雜交法就可在農(nóng)桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組而達(dá)到導(dǎo)入DNA的目的。
把質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌等農(nóng)桿菌屬細(xì)菌可以依據(jù)已有的方法進(jìn)行，其方法包括所述的三親雜交法和電穿孔法、電子注射法、PEG法等化學(xué)方法。
即將導(dǎo)入植物的基因與現(xiàn)有方法相同，基本上使基因處于T-DNA左右序列交接之間。但是由于質(zhì)粒是環(huán)狀的，所以交接序列數(shù)目可以為1個(gè)也可以為3個(gè)以上，當(dāng)把多個(gè)基因排列在不同位置上時(shí)交接序列為3個(gè)以上。在農(nóng)桿菌屬細(xì)菌中可以把基因排列在Ti或Ri質(zhì)粒上，也可以排列在其它的質(zhì)粒上。同時(shí)也可以排列在多種質(zhì)粒上。
利用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌導(dǎo)入基因的方法可以使植物細(xì)胞或植物組織單獨(dú)與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸。例如制備農(nóng)桿菌屬細(xì)菌懸浮液，其濃度為106-1011細(xì)胞/ml，把植物細(xì)胞或植物組織浸于該懸浮液中3-10分鐘左右，然后，在固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)數(shù)日。
對(duì)供于轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或組織不作任何限定，它們可以是葉、根、莖及其它的部位，也可以是如愈傷組織一樣分化的或未分化的胚等。植物種類也不作限定但優(yōu)選被子植物，而被子植物即可以是雙子葉植物也可以是單子葉植物。
如下面將要敘述的實(shí)施例所示，本發(fā)明的方法與從前的農(nóng)桿菌法相比其轉(zhuǎn)基因效率明顯得到提高。
實(shí)施例下面，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明卻不能限定后面將要敘述的實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)農(nóng)桿菌的菌系及質(zhì)粒使用LBA4404(pBI 121)(pBI 121為購(gòu)于美國(guó)Clontech公司的產(chǎn)品，(Jefferson RA 1987(參考文獻(xiàn)(19)))、LBA4404(pIG121Hm)(Hiei，Y.etal.，1994(參考文獻(xiàn)(11))、LBA4404(pTOK233)(Hiei，Y.et al.，1994(參考文獻(xiàn)(11))及LBA4404(pSB133))(圖2)作為農(nóng)桿菌及其載體。
如下構(gòu)建pSB133。用限制酶SaI I消化pGA482(An G et al.，1985(參考文獻(xiàn)(3)))獲得6.2kb的DNA片斷，再用SaI I消化pSB11(Komari et al.，1996(參考文獻(xiàn)(25))獲得5.1kb的DNA片斷，將兩片斷結(jié)合成質(zhì)粒。然后把該質(zhì)粒用限制酶EcoRI BgIII消化得到8.6DNA片斷。對(duì)該DNA片斷進(jìn)行平滑處理，插入BgIII接頭(TaKaRa)得到pSB27質(zhì)粒。用限制酶Hind III消化該pSB27，用Hind III消化pIG221(Ohta S et al.，1990(參考文獻(xiàn)(32))得到3.1kb 35s啟動(dòng)子，以及插入包含內(nèi)顯子的GUS基因片斷，得到pSB33。把pSB33導(dǎo)入大腸桿菌菌株LE392后，根據(jù)三親雜交法(Ditta Get al.，1980(參考文獻(xiàn)(8))轉(zhuǎn)導(dǎo)含有pSB1(Komari et al.，1996(參考文獻(xiàn)(25)))的農(nóng)桿菌LBA4404菌株。在農(nóng)桿菌內(nèi)通過pSB1和pSB33之間的同源重組而獲得pSB133。在pBI 121的T-DNA區(qū)域上有由胭脂堿合酶基因(nos)的啟動(dòng)子調(diào)控的抗卡那霉素藥性基因(npt II)和由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35s啟動(dòng)子調(diào)控的GUS基因。在pIG121Hm及pTOK233的T-DNA區(qū)域上，有通過nos啟動(dòng)子調(diào)控的npt II基因和通過35s啟動(dòng)子調(diào)控的hpt基因、還有在35s啟動(dòng)子上由蓖麻過氧化氫酶基因內(nèi)含子介導(dǎo)的GUS基因。在pSB133的T-DNA區(qū)域上有由nos啟動(dòng)子調(diào)控的npt II基因、由CaMV的35s啟動(dòng)子調(diào)控的并由蓖麻過氧化氫酶基因內(nèi)含子介導(dǎo)的GUS基因(圖2)。還有，pSB133及pTOK233是一種轉(zhuǎn)基因能力很強(qiáng)的超二元載體(Komari，T.et al.，1999(參考文獻(xiàn)(26)))。
(2)供試品種及供試組織作為供試品種使用日本水稻品種「越光」及「月之光」。開花第8-14天后除去未成熟種子的穎，用70％乙醇固定數(shù)秒鐘，用含有Tween20的1％次氯酸鈉溶液進(jìn)行15分鐘無菌處理。用無菌水溶液清洗數(shù)次，取1.5-2mm大小的未成熟胚以供試驗(yàn)。
(3)離心處理把未成熟水稻胚放入無菌水溶液的離心管里，使用微量高速離心機(jī)、大型離心機(jī)或超高速離心機(jī)，在760G-150,000G轉(zhuǎn)速下離心。離心后把農(nóng)桿菌接種于未成熟胚里。
(4)接種與其培養(yǎng)未成熟胚的接種與共培養(yǎng)的方法依據(jù)Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(26)。也就是說，離心后除去離心管內(nèi)的無菌水溶液，加入農(nóng)桿菌懸浮液，用渦流攪拌機(jī)攪拌5-30秒。在AB培養(yǎng)基(Chilton，M-D et al.，1974(參考文獻(xiàn)(6)))上培養(yǎng)農(nóng)桿菌3-10天，用鉑片記錄農(nóng)桿菌的菌落，并懸浮于AA調(diào)整培養(yǎng)基(AA主要無機(jī)鹽類、AA氨基酸及AA維生素類(Toriyama K.et al.，1985((參考文獻(xiàn)(36))、MS微量鹽(Murashige，T et al.，1962(參考文獻(xiàn)(30))、1.0g/l酪蛋白氨基酸、100μM乙酰丁香酮、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖)來制備農(nóng)桿菌懸浮液。室溫下靜置約5分鐘，在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上接種。所述共培養(yǎng)基是將2N6-AS培養(yǎng)基(Hiei etal.(1994)(參考文獻(xiàn)(11)))的無機(jī)鹽類換成R2培養(yǎng)基(Ohira et al.1973(參考文獻(xiàn)(31)))的組分。然而主要無機(jī)鹽類(KNO3，KH2PO4，CaCl22H2O，MgSO47H2O)均以1/2的濃度加入培養(yǎng)基中。調(diào)整菌的接種濃度為1×108-1×109cfu/ml。共培養(yǎng)3-13天，對(duì)于部分未成熟的胚用X-Gluc處理并研究GUS的表達(dá)(Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(11))。即共培養(yǎng)處理后，把組織浸入含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)，在37℃下靜置1小時(shí)。用磷酸緩沖液除去農(nóng)桿菌后，再加入1.0mM 5-溴-4氯-3-吲哚-葡糖醛酸(X-gluc)及含有20％甲醇的磷酸緩沖液。在37℃下靜置24個(gè)小時(shí)。用顯微鏡觀察被染成藍(lán)色的細(xì)胞組織。
(5)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選經(jīng)過共培養(yǎng)后，把未成熟胚及愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有250mg/l羧芐青霉素及250mg/l頭孢噻肟、200mg/l巴龍霉素或10-30mg/l潮霉素的第一次篩選培養(yǎng)基，30℃連續(xù)光照，培養(yǎng)1-2周。在第一次篩選培養(yǎng)基里，又在(Hieiet al.(1994)(參考文獻(xiàn)(11))的2N6K培養(yǎng)基里加入30g/l的D-山梨糖醇(K培養(yǎng)基)。另外，把Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(11))的2N6培養(yǎng)基(N6的無機(jī)鹽及維生素類(Chu C.C.1978(參考文獻(xiàn)(7)))、1g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l的2，4-D)中的(NH4)2SO4量設(shè)為232mg/l并添加含有氨基酸類的AA培養(yǎng)基(Toriyama et al.，1985(參考文獻(xiàn)(36))用作試驗(yàn)(N培養(yǎng)基)。
把第一次篩選培養(yǎng)基上形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有250mg/l頭孢噻肟及250mg/l羧芐青霉素、200mg/l巴龍霉素或80mg/l潮霉素的第二次篩選培養(yǎng)基上，30℃連續(xù)光照，培養(yǎng)1-2周。在第二次篩選培養(yǎng)基里，又將(Hieiet al.(1994)(參考文獻(xiàn)(11))N6-7培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4量設(shè)為232mg/l并添加至含有氨基酸類的AA培養(yǎng)基(Toriyama et al.，1985((參考文獻(xiàn)(36))。另外，在上述第一次和第二次篩選培養(yǎng)基中均含有巴龍霉素，在這兩種培養(yǎng)基中使用了8g/l培養(yǎng)基固化劑。經(jīng)二次篩選后分析了愈傷組織抗藥性的出現(xiàn)頻率。
(6)轉(zhuǎn)導(dǎo)體的再分化把來自未成熟胚的盤片選擇性抗藥愈傷組織接種至含有250mg/l羧芐青霉素及250mg/l頭孢噻肟、100mg/l巴龍霉素或50mg/l潮霉素的再分化培養(yǎng)基N6S3(Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(11)))。
(7)分析再分化個(gè)體GUS的表達(dá)在25℃連續(xù)光照下，再分化培養(yǎng)4-5周得到各種抗藥性再分化植物的葉片，把該葉片如上述一樣用X-Gluc處理，并分析GUS的表達(dá)(Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(11)))。把再分化個(gè)體轉(zhuǎn)移至稀釋500倍的Hyponex水溶液中，25℃連續(xù)光照下，育苗約2周后，再移至室溫內(nèi)的離心罐中。
(8)結(jié)果(i)離心效果的考察使用微量高速離心機(jī)、大型高速離心機(jī)以及超高速離心機(jī)分析未成熟水稻胚的離心效果，其結(jié)果是，從10KG到100KG范圍的離心處理，其轉(zhuǎn)基因效率得到提高(表1，2，3，6)。所處理的時(shí)間以10分鐘效果最佳(表4，5)。在「越光」和「月之光」的品種里其GUS瞬間表達(dá)頻率沒有發(fā)現(xiàn)不同。結(jié)果表明，離心處理不僅提高了轉(zhuǎn)基因效率而且促進(jìn)了愈傷組織的誘導(dǎo)，因此離心處理預(yù)示著包括其他植物種類在內(nèi)的有利于誘導(dǎo)組培中的愈傷組織及其增殖。
從表6上來看，使用250KG的超高速離心機(jī)，處理60分鐘沒有觀察到「月之光」的未成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)。但是在110KG離心處理60分鐘時(shí)卻觀察到愈傷組織的誘導(dǎo)，GUS的表達(dá)效率也很高。對(duì)于「越光」，使用250KG的超高速離心機(jī)，處理60分鐘同樣沒有觀察到未成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)。從以上結(jié)果可知，未成熟水稻胚的離心處理，其離心處理效果在5KG-200KG之間比較合適，從處理方法上來看，使用微量高速離心機(jī)及大型高速離心機(jī)時(shí)認(rèn)為20KG、40KG比較合適。從表9，10，11的結(jié)果來看，表明不管超二元載體LBA4404(pSB133)轉(zhuǎn)基因能力有多么高，通常在二元載體LBA4404(pIG121Hm)上使用未成熟胚通過20KG60分鐘處理同樣也能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。
(ii)離心處理和共培養(yǎng)的考察在表-7，8里，共培養(yǎng)3天，6天，13天在瞬時(shí)表達(dá)分析儀上顯示了GUS高效表達(dá)。9天的共培養(yǎng)也比其它實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出GUS的更高效表達(dá)。目前正在第一次篩選培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)(10ppm潮霉素、200ppm巴龍霉素)，對(duì)其設(shè)定時(shí)間不同的各種未成熟胚，在9天和13天共同區(qū)域上，與3天和6天共同區(qū)域上比較，表現(xiàn)出愈傷組織抗藥性出現(xiàn)頻率低的現(xiàn)象。
(iii)對(duì)離心轉(zhuǎn)基因效率的研究目前，正在把如上所述培養(yǎng)的GUS陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)體(表4，5)各自地馴化培養(yǎng)。一部分的系統(tǒng)采集種子研究結(jié)實(shí)情況。其研究結(jié)果是，經(jīng)過離心處理的轉(zhuǎn)導(dǎo)體與未處理的轉(zhuǎn)導(dǎo)體(「越光」、「月之光」)相比其形態(tài)及結(jié)實(shí)沒有發(fā)現(xiàn)差異。
Hiei et al.(1994(參考文獻(xiàn)(11)))曾報(bào)道以水稻愈傷組織為材料可以進(jìn)行較高效率的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。Aldimita RR et al.1996(參考文獻(xiàn)(1))報(bào)導(dǎo)了未成熟水稻胚的轉(zhuǎn)基因的例子。為了更有效穩(wěn)定地實(shí)施這些轉(zhuǎn)基因技術(shù)，上面闡述的離心處理法是非常有效的。尤其是未成熟胚易受栽培環(huán)境的影響不宜得到適于轉(zhuǎn)基因的未成熟胚，通過離心處理可以維持更穩(wěn)定又高效的轉(zhuǎn)基因效率。Hiei et al.(1994(參考文獻(xiàn)(11)))提供了轉(zhuǎn)基因效率非常高的載體即超二元載體，它可以使水稻的轉(zhuǎn)基因效率提高。根據(jù)Aldimita et al.1996(參考文獻(xiàn)(1))的報(bào)導(dǎo)，僅在試驗(yàn)階段里使用超二元載體LBA4404(pTOK233)則可得到轉(zhuǎn)導(dǎo)體。在本研究的離心處理法中，即使使用一般的二元載體它也可與超二元載體妣美，并達(dá)到高于報(bào)道的轉(zhuǎn)基因效率。通過把超二元載體和離心處理法結(jié)合起來使用可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因效率。我們預(yù)測(cè)通過離心處理法在迄今為止無法得到轉(zhuǎn)導(dǎo)體的品系里同樣也能夠獲得高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)體。
表1各種離心處理和共培養(yǎng)后的GUS表達(dá)結(jié)果(試驗(yàn)菌系LBA4404/pSB133)


離心處理時(shí)間10分，共培養(yǎng)時(shí)間3-5天，GUS陽性未成熟胚數(shù)/供試未成熟胚數(shù)括號(hào)內(nèi)表示在盤片里其GUS表達(dá)區(qū)域的面積-無，+小++中+++大表2來自「越光」未成熟胚的抗巴龍霉素藥性愈傷組織的出現(xiàn)頻率(試驗(yàn)菌系LBA4404/pSB133)


出現(xiàn)愈傷組織抗藥性的未成熟胚數(shù)/供試未成熟胚數(shù)，2次篩選結(jié)束時(shí)的調(diào)查結(jié)果離心處理時(shí)間10分，共培養(yǎng)時(shí)間3-5天表3來自「月之光」未成熟胚的抗巴龍霉素藥性愈傷組織的出現(xiàn)頻率(試驗(yàn)菌系LBA4404/pSB133)




出現(xiàn)愈傷組織抗藥性的未成熟胚數(shù)/供試未成熟胚數(shù)，2次篩選結(jié)束時(shí)的調(diào)查結(jié)果離心處理時(shí)間10分，共培養(yǎng)時(shí)間3-5天表4離心處理和共培養(yǎng)后的GUS表達(dá)結(jié)果(品種名「越光」)


離心速度20,000G，供試品種「越光」，GUS陽性未成熟胚數(shù)/供試未熟胚數(shù)在盤片里GUS表達(dá)區(qū)域的面積，+小++中+++大表5離心時(shí)間和抗巴龍霉素藥性愈傷組織的出現(xiàn)頻率(品種名「越光」)


離心速度20,000G，共培養(yǎng)時(shí)間3-5天，2次篩選結(jié)束時(shí)的調(diào)查結(jié)果出現(xiàn)愈傷組織抗藥性的未成熟胚數(shù)/供試未成熟胚數(shù)表6離心處理強(qiáng)度和共培養(yǎng)后的GUS表達(dá)(品種名「月之光」)


供試菌系LBA4404/pIG121Hm，離心處理時(shí)間60分1)微量高速離心機(jī)2)大型高速離心機(jī)3)超高速離心機(jī)盤片部位所占有的GUS表達(dá)區(qū)域的比率-無，±＜1/8+1/8-1/4++＞1/4表7離心處理以及共培養(yǎng)時(shí)間和共培養(yǎng)后的GUS表達(dá)(品種名「月之光」)




供試菌系LBA4404/pIG121Hm，1)微量高速離心機(jī)2)大型高速離心機(jī)針對(duì)各種轉(zhuǎn)速離心處理時(shí)間為60分鐘盤片所占有的GUS表達(dá)區(qū)域的比率-無，±＜1/8+1/8-1/4++＞1/4表8離心處理及共培養(yǎng)時(shí)間和共培養(yǎng)后的GUS表達(dá)(品種名「越光」)


供試菌系LBA4404/pIG121Hm，1)微量高速離心機(jī)2)大型高速離心機(jī)針對(duì)各種轉(zhuǎn)速離心處理時(shí)間為60分鐘盤片所占有的GUS表達(dá)區(qū)域的比率-無，±＜1/8+1/8-1/4++＞1/4表9LBA4404(pBI121)的轉(zhuǎn)基因結(jié)果(品種名「月之光」)


離心處理20KG·60分鐘共培養(yǎng)5天表10LBA4404(pIG121Hm)轉(zhuǎn)基因結(jié)果(品種名「月之光」)


離心處理20KG·60分鐘共培養(yǎng)5天表11LBA4404(pBI121)轉(zhuǎn)基因結(jié)果(品種名「越光」)


離心處理時(shí)間20KG·60分鐘共培養(yǎng)5天表12LBA4404(pSB133)轉(zhuǎn)基因結(jié)果(品種名「越光」)


離心處理20KG·60分鐘共培養(yǎng)5天實(shí)施例2將大小為1.2mm的未成熟玉米胚(A188品種，采自農(nóng)林水產(chǎn)省生物資源研究所)進(jìn)行無菌處理，解剖取出，用LS-inf液體培養(yǎng)基洗滌1次。在離心管里，加入含有未成熟胚和100μM乙酰丁香酮的LS-inf培養(yǎng)基2.0ml，約為1×109cfu/ml并懸浮根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pSB133)(Ishida etal.1996(參考文獻(xiàn)(18)))的懸浮液，在40,000G，4℃條件下離心30分鐘。對(duì)照組未成熟胚同前所述在細(xì)菌懸浮液中室溫下靜置30分鐘。緩慢攪拌之后，接種至LS-AS培養(yǎng)基上使胚軸面接觸培養(yǎng)基。接種離心后的未成熟胚其操作如下。把無菌的未成熟胚用LS-inf液體培養(yǎng)基洗滌1次之后，轉(zhuǎn)移至含有相同液體培養(yǎng)基的離心管里，在4℃20KG或40KG的條件下離心1小時(shí)。對(duì)照樣品在液體培養(yǎng)基中室溫下靜置1小時(shí)。然后除去液體培養(yǎng)基，把濃度約為1×109cfu/ml并懸浮于LBA4404(pSB133)的懸浮液加入離心管里，小心攪拌。室溫下靜置5分鐘后，接種至含有10μM AgNO3的LS-AS培養(yǎng)基上使胚軸面接觸培養(yǎng)基。25℃條件下避光共培養(yǎng)3天，然后，取部分未成熟胚，如實(shí)施例1所述用X-gluc分析GUS基因瞬時(shí)表達(dá)。上述培養(yǎng)基及培養(yǎng)法均依照Ishida，Y.et al.1996(參考文獻(xiàn)(18))描述的方法。
已接種LBA4404(pSB131)的未成熟胚A188的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)如表13所示。任一未成熟胚里均顯示了GUS基因的表達(dá)，但是對(duì)于對(duì)照胚來說，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過離心處理的未成熟胚大多數(shù)都表現(xiàn)出廣域的基因表達(dá)。與農(nóng)桿菌一起離心，對(duì)離心后的農(nóng)桿菌接種時(shí)發(fā)現(xiàn)由于離心處理轉(zhuǎn)基因的區(qū)域擴(kuò)大了。即使改變了離心強(qiáng)度和處理時(shí)間也比對(duì)照組表現(xiàn)出更廣域的GUS基因表達(dá)。
以上結(jié)果表明，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)離心后的未成熟胚時(shí)，轉(zhuǎn)基因效率比對(duì)照組高且有可能得到轉(zhuǎn)基因植物。用從前的農(nóng)桿菌法不能得到A188轉(zhuǎn)化體而(Ishida，Y et al.1996(參考文獻(xiàn)(18))報(bào)導(dǎo)通過離心處理能夠得到玉米品種的轉(zhuǎn)基因植物。
表13未成熟胚A188GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)


對(duì)照組用1G處理試驗(yàn)1為在農(nóng)桿菌共存下，離心處理。試驗(yàn)2為離心處理后進(jìn)行了農(nóng)桿菌的接種試驗(yàn)。
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權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的方法，其中通過對(duì)植物細(xì)胞或植物組織的離心處理，可提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的效率，其中離心處理是在1000G-100kG的離心速度范圍內(nèi)進(jìn)行1秒至2小時(shí)。
2.權(quán)利要求
1所述的方法，其中植物細(xì)胞或植物組織經(jīng)離心處理后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。
3.權(quán)利要求
1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來自于被子植物。
4.權(quán)利要求
1-3中所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來自于單子葉植物。
5.權(quán)利要求
4所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來自于禾本科植物。
6.權(quán)利要求
5所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來自于水稻或玉米。
7.一種培育植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求
1至6所述的方法。
8.通過權(quán)利要求
1至7所述方法培育出的植物細(xì)胞或植物組織。
9.一種培育被子植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求
3所述的方法。
10.通過權(quán)利要求
3或9所述方法培育出的被子植物細(xì)胞或被子植物組織。
11.一種培育單子葉植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求
9所述的方法。
12.通過權(quán)利要求
4或11所述方法培育出的單子葉植物細(xì)胞或單子葉植物組織。
13.一種培育禾本科植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求
4所述的方法。
14.通過權(quán)利要求
5或13所述方法培育出的禾本科植物細(xì)胞或禾本科植物組織。
15.一種培育水稻或玉米的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求
6所述的方法。
16.通過權(quán)利要求
6或15所述方法培育的水稻細(xì)胞、水稻組織、玉米細(xì)胞或玉米組織。
專利摘要
公開一種提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法，該方法比從前的農(nóng)桿菌法容易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因且效率高并對(duì)細(xì)胞組織沒有傷害。在本發(fā)明方法中，通過農(nóng)桿菌屬細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的同時(shí)經(jīng)過對(duì)植物細(xì)胞或植物組織的離心處理，可提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率。
文檔編號(hào)C12N15/82GKCN1268752SQ00813814
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2000年8月3日
發(fā)明者樋江井佑弘, 笠岡啟介, 石田佑二 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan