專利名稱：：改進G/11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性并且擴展其pH范圍的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程，具體涉及G/11家族木聚糖酶，以及編碼所述酶的基因。本發(fā)明具體涉及編碼內(nèi)-1,4-(3-木聚糖酶(EC3.2丄8)的7Hc/K^ferma6"/義1^//基因。本發(fā)明描述了如何利用定點誘變改進酶的性質(zhì)，以使其符合所要應(yīng)用的工業(yè)條件?？衫玫鞍踪|(zhì)工程改進木聚糖酶的熱活性和熱穩(wěn)定性，以及擴展它們的pH范圍。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶是水解(3-1,4連接的吡喃木糖苷鏈的糖基水解酶。已發(fā)現(xiàn)木聚糖酶存在于至少一百種不同的生物中。它們與其它糖基水解酶一起形成了包括超過40種不同酶家族的超家族(Henrissat和Bairoch，1993)。木聚糖酶家族ll(以前稱G)根據(jù)它們在基因序列，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，催化機制的相似性來確定。此家族成員的共同特點是高度的基因同源性，大小約20kDa,具有雙取代催化機制(Tenkanen等，1992;Wakarchuk等，1994)。木聚糖酶家族11主要由形成2個大P-折疊的(3-鏈和1個ct-螺旋組成。它們形成了一個類似半握的右手的結(jié)構(gòu)，其中的p-折疊稱為A-折疊和B-折疊(Torronen&Rouvinen，1997)。由于木聚糖酶家族11的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且不易受蛋白酶活性的影響，所以它們在工業(yè)應(yīng)用方面特別有用。此外，木聚糖酶可以經(jīng)濟地大規(guī)才莫生產(chǎn)。已知7Hc/2odermare^se/可以產(chǎn)生三種不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(XynI和XynII)具有最好的特點(Tenkanne等，1992)。Xynl分子量19kDa，與XynII相比，它的等電點和最適pH較低(p15.5，pH3-4)。XynII分子量20kDa,它的等電點為9.0,最適pH5.0-5.5(Torronen&Rouvi腿，1995)。木聚糖酶最重要的工業(yè)應(yīng)用是紙漿漂白，織物纖維的改良，生物質(zhì)的改良以促進動物飼料中它的消化(Prade，1996)。所有這些應(yīng)用中的共同問題是該酶面臨的極端條件。在工業(yè)應(yīng)用中的高溫以及與許多木聚糖酶的最適pH不同的pH條件降低了現(xiàn)有木聚糖酶在工業(yè)上的有效利用。在飼料應(yīng)用中，該酶面臨飼料制備期間的短時高溫(例如卯。C下2-5分鐘)。但是，該酶的催化活性需要的溫度較低(例如約37°C)。這樣，該酶應(yīng)在較低溫下保持活性，它不應(yīng)在高溫下不可逆地失活。在應(yīng)用于紙漿漂白的過程中，來自于堿洗的物料具有較高的溫度(>80。C)和pH(>10)。沒有一種當今市售的木聚糖酶可以在這樣的條件下不失活。必須將紙漿冷卻，將堿性pH中和，這樣才能用當今可得的木聚糖酶進行紙漿處理。但這意味著費用提高。已有人利用蛋白質(zhì)工程-有時是成功的-穩(wěn)定木聚糖酶，使之耐受較高溫度和pH的變性效應(yīng)。已從嗜熱生物中發(fā)現(xiàn)并克隆了幾種耐熱的，嗜堿和嗜酸的木聚糖酶(Bodie等，1995;Fukunaga等，1998)。但是，在大多數(shù)情況下，證明經(jīng)濟數(shù)量地生產(chǎn)這些酶是困難的。因此，工業(yè)上一般應(yīng)用不那么耐熱的T.reesei木聚糖酶II,因為它可以大量低成本地生產(chǎn)。作為分離新的木聚糖酶或開發(fā)生產(chǎn)方法的替代方法，可以設(shè)想對當今使用的木聚糖酶進行工程改造，使之在極端條件下更為穩(wěn)定。環(huán)狀芽胞桿菌木聚糖酶可以通過二硫橋?qū)⑵銷-末端與C-末端結(jié)合，將a-螺旋的N-末端部分與鄰近的P-鏈結(jié)合而改進其穩(wěn)定性(Wakarchuk等，1994)。Campbell等(1995)也通過分子間或分子內(nèi)二辟ii建對環(huán)狀芽胞桿菌木聚糖酶進行了修飾以提高其熱穩(wěn)定性。另一方面，r^"ei木聚糖酶n通過將N-末端區(qū)改變?yōu)槭葻崮揪厶敲傅南鄳?yīng)部分而改進了穩(wěn)定性(Sung等，1998)。除熱穩(wěn)定性得到改進外，所述酶也擴展了在堿性pH條件下的活性范圍。單點突變(singlepointmutation)也用于提高短小芽胞桿菌木聚糖酶的穩(wěn)定性(Arase等，1993)。還對許多其它酶進行了誘變對穩(wěn)定性影響的研究。通過對比嗜熱和嗜溫酶的結(jié)構(gòu)，得到了大量信息(Vogt等，1997)。嗜熱木聚糖酶的結(jié)構(gòu)信息也給出了影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性因素的信息(Gmber等，1998;Harris等，1997)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及屬于糖基水解酶家族ll(以前稱G)的木聚糖酶。本發(fā)明提供了經(jīng)過修飾的木聚糖酶，所述修飾使它們的熱穩(wěn)定性，熱活性得到了改變，和/或擴展了它們的pH范圍。對7Wc/2o&ma木聚糖酶結(jié)構(gòu)的各種修飾，不管是單獨的，或者組合的，都產(chǎn)生了本發(fā)明所述的改變(1)通過用二辟^橋(例如，由突變對T2C和T28C;P5C和N19C;T7C和S16C;Nl0C和N29C形成的橋)將N-末端區(qū)結(jié)合到該蛋白主體上而提高了該酶的穩(wěn)定性；(2)通過延伸一個額外的天冬氨酸(+191D)而穩(wěn)定C-末端，其中該天冬氨酸與第58位的精氨酸(野生型酶中第58位的賴氨酸已換成精氨酸(K58R))形成鹽橋；(3)將oc-螺旋通過二硫橋與該酶的主體結(jié)合而提高該酶的穩(wěn)定性(例如L105C和Q162C);(4)在不同位置進行點突變以改進木聚糖酶的穩(wěn)定性(N11D，T26R，G30H,N67R,N97R,A132R，N157R,A160R，T165N，M169H,S186R)。具體地，本發(fā)明提供了經(jīng)過修飾的7Wc/zocfen^a木聚糖酶，其中氨基酸T2和T28被改變?yōu)榘腚装彼?，K58改變?yōu)槟芫彼幔谠撁傅腃-末端添加了一個天冬氨酸(+191D),這樣在氨基酸T2C和T28C之間形成了二硫橋，在氨基酸K58R和+191D之間形成了鹽橋。圖1:木聚糖酶誘變中所用的一組寡核苷酸(密碼子改變以下劃線標記)。這些序列在所附序列表中為序列1到12。圖2:表示突變T2C,T28C，K58R,和+191D對7>ewe/XynII溫度最適值的影響(WT二野生型酶；丫5=突變型7>e"ez'XynII)。圖3:表示突變T2C,T28C,K58R，和+191D對7>e"e/XynII的pH依賴性活性的影響(WT和Y5如圖2)。圖4:表示在不同溫度下突變T2C，T28C,K58R，和+191D對7>e"e/XynII的失活效應(yīng)(WT和Y5如圖2)。圖5:表示在不同溫度下突變Q162C和L105C對7>e^e/XynII的失活效應(yīng)(W.t尸野生型酶)。發(fā)明詳述源于細菌，酵母和真菌的G/11家族木聚糖酶有共同的分子結(jié)構(gòu)。這樣的木聚糖酶例如有黑曲霉(」5perg77/wsXynA川地曲霉(J，rg77/^sA(2麗cM)XynC塔賓曲霉(^5^erg7'〃ws勵/gem7.力XynA環(huán)4大芽孑包斥干菌(5ac/〃"sczVr"/am1)XynA鄉(xiāng)豆小芽孑包4干菌(Bac〃/ws/w/w7m力XynA才古草芽孑包^干菌CS(3c/〃t^sw6/77&)XynAiVeocfl〃/附o^xpa/W"'aramXynA淺青紫鏈霉菌OSV邵tom;/ces//v/(ia"力XynB淺青紫鏈霉菌OSV，tom少ce:S//v油m0XynC熱紫鏈霉菌(浙，。myc&yf/zewzoWo/ace—XynII赤者色p耆熱單孑包菌(777ermomowo^ora/ksca)XynA7Hc/70(ie環(huán)a/zorzz'。wwmXyn7Hc/zo(ie，areese/Xynl，7h'c/7oofe環(huán)(3reesez'XynII綠色木霉(7h'c/zocfermav/n.剩Xyn本發(fā)明涉及具有下列共同特點的木聚糖酶家族G/11:(i)一類酶，其中N-末端序列是雙層p-折疊(木聚糖酶家族11中的A-和B-折疊，(Gmber等，1998》的一部分，且第一(3-鏈(7^"dXynII中的氨基酸5-10)或N-末端可通過二硫橋與鄰近的(3-鏈(7:we^XynII中的氨基酸13-19)或其它鄰近區(qū)相連。(ii)一類酶，其中C-末端肽鏈形成(3-鏈(7^e^'XynII中的氨基酸183-190),它是更大的P-折疊的一部分，并且C-末端區(qū)可通過二硫橋與鄰近的(3-鏈相連或通過鹽橋與酶的主體相連。(m)—類酶，其在酶結(jié)構(gòu)中催化凹溝的另一側(cè)具有a-螺旋，并且該a-螺旋或鄰近區(qū)可通過二硫橋更緊密地與該蛋白的主體相連。7>e^e/木聚糖酶II具有上述性質(zhì)，并且可在這些性質(zhì)的基礎(chǔ)上對該酶的熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性和熱活性進行改變。下列是對7>e"e/的木聚糖酶基因(Z少"/7)作出的改變1.通過定點誘變，在N-末端區(qū)形成二碌u橋*第2和28位的蘇氨酸改變?yōu)榘腚装彼?，使得在它們之間形成二硫橋(T2C和T28C)。*第5位的脯氨酸和第19位的天冬酰胺改變?yōu)榘腚装彼?，使得在它們之間形成二石克橋(P5C和N19C)。*第7位的蘇氨酸和第16位的絲氨酸改變?yōu)榘腚装彼?，使得在它們之間形成二碌u橋(T7C和S16C)。*第IO位和第29位的天冬酰胺改變?yōu)榘腚装彼?，使得在它們之間形成二石克橋(N10C和N29C)。2.通過定點誘變，在該木聚糖酶的C-末端加入一個重組改變的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，使得在C-末端和酶主體之間形成鹽橋，導(dǎo)致該C-末端更緊地與酶主體連接。如果合適，可在該蛋白的主體中進行恰當?shù)陌被崛〈鷱亩纬甥}橋。*將一個天冬氨酸(+191D)添加到C-末端的絲氨酸(S190)。這使得與第58位的精氨酸(此處的野生型賴氨酸已被精氨酸取代(K58R))間形成鹽橋。3.通過定點誘變，形成至少一個二硫橋以通過a-螺旋或a-螺旋的鄰近區(qū)穩(wěn)定該酶的C-末端部分。*第105位的亮氨酸和第162位的谷氨酰胺改變?yōu)榘腚装彼幔沟迷谒鼈冎g形成二硫橋(L105C和Q162C)。4.通過定點誘變進行點突變以提高7>ee"/木聚糖酶II的穩(wěn)定性N11D,T26R,G30H，N67R，N97R，A132R,N157R，A160R,T165N，M169H,S186R。本發(fā)明方法通過下列常規(guī)方法生產(chǎn)突變和重組的HW/7基因1.表達載體和所述酶的產(chǎn)生利用載體pKKtac(VTT,Espoo,芬蘭)或載體pALK143(ROAL,Rajam能i，芬蘭)在大腸桿菌菌抹XLl-Blue或Rv308中生產(chǎn)7>^^/木聚糖酶11。7>ee^/^Wi7基因通過PCR直接從7>e^e/的cDNA克隆到載體pKKtac(由IPTG誘導(dǎo)表達)?？蛇x地，使用含有7>^化/義}^//基因的質(zhì)粒？八0:143。這兩種載體都分泌所述木聚糖酶到培養(yǎng)基中；載體pKKtac通過果膠酸裂解酶(pe舊)信號序列，載體pALK143通過淀粉酶信號序列。2.定點誘變和重組XRW7基因的產(chǎn)生本發(fā)明實施例中所用的突變的rwe"/ZKV7/基因如下產(chǎn)生采用含有改變的密碼子序列的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生突變。所用寡核苷酸的例子在圖1中給出，也就是所附序列列表中的序列1到12。利用所述引物(含有所要的突變)，通過快速改變(QuickChange)法(Stratagene,Westburg，Leusden,荷蘭)以及眾所周知的方法進4亍PCR。用PfuTurbo作為DNA聚合酶(Stratagene,LaJolla，Ca,美國)。將克隆的大腸桿菌菌抹培養(yǎng)在含耦合了RhemazolBrilliantBlue的木聚糖(樺木(birchwood)木聚糖Sigma,Steinheim,德國)的平板上。通過環(huán)繞菌落的暈圈可以觀察到木聚糖酶活性(Biely等，1985)。3.木聚糖酶活性的測定通過測定從水解的木聚糖纖維釋放出的還原糖量可以測定酶樣品的木聚糖酶活性。通過DNS法在50mM檸檬酸-磷酸緩沖液中測定還原糖(Bailey等，1992)。在pH5和50。C下進行標準活性測定。4.酶穩(wěn)定性的測定通過測定在不同溫度下修飾型酶的半衰期來檢測所述木聚糖酶的穩(wěn)定性。所述酶在55或65。C下保溫不同的時間，如上測定其殘余活性。也在不同溫度下溫育所述酶10分鐘，再通過DNS法測定殘余活性來測定高溫下的穩(wěn)定性。通過測定不同pH值下的酶活性來測定pH依賴性木聚糖酶活性。通過測定不同溫度下的活性(10min，pH5)可以確定該酶的最適溫度。將突變的酶的性質(zhì)與野生型7>e^e/XynII酶的相對比。突變實施例實施例1通過如上所述方法對7>eew/Xynn進行三重突變(T2C,T28C和K58R)和重組改變(+191D)。突變的酶命名為Y5。該突變酶在大腸桿菌中表達，所述大腸桿菌培養(yǎng)在+37。C搖瓶中，以LuriaBroth作為生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)完成后，離心去除細胞，如上所述對分泌到培養(yǎng)液中的木聚糖酶在各種條件下進行鑒定。圖2表示當突變型Y5(T2C，T28C和K58R,十191D)和野生型(7>e^e/XynII)酶在不同溫度下與樺木木聚糖保溫10分鐘，并采用DNS法測定釋放的還原糖的相對數(shù)量時，溫度對酶活性的影響。所述突變使木聚糖酶的最適溫度有約15。C的改善。實施例250。C下，將實施例1中所述的三重突變型木聚糖酶(T2C，T28C,K58R，十191D)在1%樺木木聚糖的不同pH值的檸檬酸-磷酸緩沖液中保溫IO分鐘。圖3表示突變酶和野生型木聚糖酶釋放的還原糖的相對量。突變使該酶的活性的pH適應(yīng)范圍略向堿性條件擴展。在pH7-8時突變酶活性高于野生型酶；在pH8(50。C)下，突變酶的活性約高20%。實施例3上述三重突變型酶(T2C,T28C，K58R,十191D)和野生型酶在不同溫度下保溫10分鐘。保溫后，冷卻樣品，在標準條件下測定殘余活性。所述野生型酶在55-6(TC下已完全失活。而所述突變型酶即使在65'C下還保留約50%的活性(圖4)。下表1表示突變型(Y5)和所述野生型木聚糖酶在55。C和65。C下的半衰期(T1/2)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4采用上述方法形成二硫橋(L105C和Q162C)，以便將a-螺旋的C-末端與鄰近的P-鏈連接。由大腸桿菌生產(chǎn)所述酶并確定其性質(zhì)。圖5表示不同溫度下，與所述野生型酶相比該突變型酶的失活。55。C下，與野生型酶相比，所述突變酶的穩(wěn)定性提高約20倍，而半衰期從5分鐘(所述野生型酶)提高到約1.5小時(所述突變酶)。文獻Arase,A.Yomo,T.,Urabe,I.，Hata，Y.,Katsube，Y.&Okada,H.(1993).Stabilizationofxylanasebyrandommutagenesis.FEBSLetters316,123-7.Bailey,J.M.,Biely,R&Poutanen，K.(1992).Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J.Biotech.23，257-270.Biely,P.,Mislovicova，D.&Toman,R.(1985).Solublechromogenicsubstratesfortheassayofendo-l，4-beta-xylanasesandendo-1,4-beta-glucanases.AnalyticalBiochemistry144,142-6.Bodie,E.,C證as，W.A.&Koljonen,M.(1995).InUnitedStatesPatent5,437,992.Campbell,R丄.，Rose,D.R.，Sung,W.L.,Yaguchi，M.&Wakarchuck,W.(1995).InUnitedStatesPatent5，405，769.Fukunaga,N.,Iwasaki，Y.,Kono,S.,Kita,Y.&Izumi,Y.(1998).InUnitedStatedPatent5,736，384.Gruber,K.,Klintschar，G"Hayn,M.，Schlacher,A.,Steiner,W.&Kratky,C.(1998).ThermophilicxylanasefromThermomyceslanuginosus:High-resolutionX-raystructureandmodelingstudies.Biochemistry37,13475-13485.Harris,G.W"Pickersgill，R.W.，Connerton，I.,Debeire,P,，Touzel,J.P.,Breton,C.&Perez，S.(1997).Structuralbasisofthepropertiesofanindustriallyrelevantthermophilicxylanase.Proteins29,77-86.Henrissat，B.&Bairoch,A.(1993).Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.BiochemicalJournal293,781-8.Prade,R.A.(1996).Xylanases:frombiologytobiotechnology.Biotechnology&GeneticEngineeringReviews13,101-31.Simg，W.L"Yaguchi,M.,Ishikawa,K.,Huang,F.,Wood,M.&Zahab,D.M.(1998).InUnitedStatesPatent5，759，840.Tenkanen,M.,Puis,J.&Poutanen,K.(1992).TwomajorXylanasesofTrichodermareesei.EnzymeMicrob.Technol,14，566-574.Torronen，A.&Rouvinen，J.(1995).Structuralcomparisonoftwomajorendo-1,4-xylanasesfromTrichodermareesei.Biochemistry34,847-56.Torronen,A.&Rouvinen,J.(1997).Structuralandfunctionalpropertiesoflowmolecularweightendo-1,4-beta-xylanases.JournalofBiotechnology57,137-49.Wakarchuk,W.W"Sung,W.L.,Campbell,R.L.,Cunningham,A.，Watson，D.C.&Yaguchi，M.(1994).ThermostabilizationoftheBacilluscirculansxylanasesbytheintroductionofdisulfidebonds.ProteinEngineering7,1379-86.Vogt,G.，Woell,S.&Argos,P.(1997).Proteinthermalstability,hydrogenbonds,andionpairs.JournalofMolecularBiology269,631-43.序列表<110>金內(nèi)克國際公司(Ge謹corInternational,Inc.)<120>改進G/11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性并且擴展其pH范圍的方法<130>34142<140><141><160>12<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突變T2C中所用寡核苷酸<400>1gagaagcgccagtgcattcagcccggc<210>2<211〉27<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述突變T28C中所用寡核苷酸<400>2gtgacgtactgca江tggtcccggcggg<210>3<211〉33<212>DM<213〉人工序列<220〉<223>人工序列的描述突變K58R中所用寡核苦酸<400>3ggcaccaagaacagggtcatcaacttctcgggc<210〉4<211>33<212〉DM<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述突變+191D中所用寡核苷酸<400>4tccatcaccgtcagcgattaaagggggctcttc33<210>5<211>32<212>DM<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述突變P5C中所用寡核苷酸<400>5cccagacgattcagtgcggcacgggctacaac32<210〉6<211〉32<212>DM<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述突變N19C中所用寡核苷酸<400>6cttctactcgtactggtgcgatggccacggcg32<210〉7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述突變T7C中所用寡核苷酸<400〉7cgattcagcccggctgcggctacaacaacggc32<210>8<211>35<212>DM<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述突變S16C中所用寡核苷酸<400>8caacggctacUctactgctactggaacgatggcc35<210〉9<211〉34<212>DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突變N10C中所用寡核苷酸<400>9ccggcacgggctactgcaacggctacttctactc<210>10<211〉31<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述突變N29C中所用寡核苦酸<400>10ggcgtgacgtacacctgcggtcccggcgggc<210〉11<211〉27<212>腿<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突變L105C中所用寡核苷酸<400>11ggcgccaccaagtgcggcgaggtcacc<210>12<211>28<212>DM<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述突變Q162C中所用寡核苷酸<400〉12gcgtgggctcagtgcggcctgacgctcg34312728權(quán)利要求1.一種經(jīng)過修飾的G/11家族的木聚糖酶，與對應(yīng)的野生型木聚糖酶相比，其熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性已提高，其中對所述野生型酶經(jīng)過如下修飾-通過二硫橋?qū)⒃撁傅腘-末端區(qū)與該蛋白的主體相連，和/或-通過鹽橋?qū)⒃撁傅腃-末端區(qū)與該蛋白的主體相連，或-通過二硫橋?qū)⒃撁傅摩?螺旋與該蛋白的主體相連，或-使該蛋白中單個氨基酸突變。2.權(quán)利要求1的經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶是7h.c/zo(ier附(3re^ye/木聚糖酵。3.權(quán)利要求2的經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶是7Hc/zcxierwa廠e&sd木聚糖酶II(XynII)。4.權(quán)利要求1-3任一項的經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其中通過加入天冬氨酸或谷氨酸到C-末端，使得所加氨基酸與蛋白主體上合適的氨基酸間形成鹽橋，從而使該酶的C-末端區(qū)與該蛋白的主體相連。5.權(quán)利要求1-4任一項的經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其中通過在7>/c/2oA/7^reew/木聚糖酶II(XynII)的氨基酸T2C和T28C之間或在所述G/11家族其它木聚糖的相應(yīng)氨基酸之間形成二硫橋，使該酶的N-末端區(qū)與該蛋白的主體相連。6.權(quán)利要求1的經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其中7h'c/zo&nware"e/木聚糖酶II(XynII)中T2和T28位的氨基酸變?yōu)榘腚装彼幔琄58變?yōu)榫彼?，并將一個天冬氨酸加到該酶的C-末端(+191D),從而在氨基酸T2C和T28C之間形成了二硫橋，并在氨基酸K58R和+191D之間形成了鹽橋。7.權(quán)利要求1到3任一項的經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其中通過在7Hc/2oArma^&yez'木聚糖酶II(XynII)的氨基酸L105C和Q162C之間或在所述G/11家族其它木聚糖的相應(yīng)氨基酸之間的二硫橋，使所述a-螺旋的C-末端部分與鄰近的P-鏈相連，從而使該酶的C-末端區(qū)通過二硫橋與該蛋白的主體相連。8.—種改進G/11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性和/或擴展其pH范圍的方法，其包括進行下列步驟-通過二^L橋?qū)⒃撁傅腘-末端區(qū)與該蛋白的主體相連，和/或-通過鹽橋?qū)⒃撁傅腃-末端區(qū)與該蛋白的主體相連，或-通過二硫橋?qū)⒃撁傅腶-螺旋與該蛋白的主體相連，或-使該蛋白中單個氨基酸突變。9.權(quán)利要求8的方法，其中將天冬氨酸或谷氨酸加入到C-末端，從而在該加入的氨基酸和該蛋白主體中合適的氨基酸之間形成鹽橋。10.權(quán)利要求9的方法，其中在7:^ese/木聚糖酶n(XynlI)中，加入的天冬氨酸或谷氨酸與已改變?yōu)橘嚢彼峄蚓彼岬牡?8位氨基酸間形成鹽橋。11.權(quán)利要求8的方法，其中在r木聚糖酶II(XynII)中，氨基酸T2和T28已變?yōu)榘腚装彼幔琄58已變?yōu)榫彼?，并在其C-末端加入了天冬氨酸(+191D),這樣就在氨基酸T2C和T28C之間形成了二硫橋，在K58R和+191D之間形成了鹽橋。12.權(quán)利要求8的方法，其中進行了單氨基酸突變。13.權(quán)利要求12的方法，其中在7:re^e/木聚糖酶II(XynlI)中進行了N11D的+務(wù)飾。全文摘要本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程，具體涉及G/11木聚糖酶家族，以及編碼所述酶的基因。本發(fā)明具體涉及編碼內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)的TrichodermareeseiXYNII基因。本發(fā)明描述了如何利用定點誘變改進酶的性質(zhì)，以使其符合所要應(yīng)用的工業(yè)條件?？衫玫鞍踪|(zhì)工程改進木聚糖酶的熱活性和熱穩(wěn)定性，以及擴展它們的pH范圍。文檔編號C12NGK101173262SQ20071018016公開日2008年5月7日申請日期2000年10月12日優(yōu)先權(quán)日1999年10月12日發(fā)明者奧西·特魯南,弗雷德·費內(nèi)爾,馬蒂·萊索拉申請人:金內(nèi)克國際公司