專利名稱：產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母菌的制作方法
產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母菌發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及產(chǎn)甘草皂苦重組酵母菌的技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及通過離子注入介導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母菌。
技術(shù)背景酵母菌與人類的關(guān)系源遠(yuǎn)流長，目前已建立了酵母菌的基因組數(shù)據(jù)庫和蛋 白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。酵母菌作為單細(xì)胞低等生物，具有易培養(yǎng)、繁殖快、便于基因 操作、能對外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生或很少有毒物質(zhì)等特性， 已成為外源基因表達(dá)的合適宿主。甘草((7(>^>7^/2/2<3)是豆升牛(丄6《"柳/|705|0^)蟲萊形花亞^牛(/>0/7///<3"/"〇7^wZ).), 屬 多年生深根性草本植物，具有抗寒、耐熱、抗鹽堿等優(yōu)良特性，適應(yīng)性強(qiáng)，生 命力旺盛，根系發(fā)達(dá)，是荒漠、半荒漠地區(qū)保持水土、改良土壤、防風(fēng)固沙的 重要藥用植物，被國家列為重點藥材。國內(nèi)外學(xué)者對甘草的化學(xué)成分和藥理作 用進(jìn)行了許多研究，認(rèn)為其主要有效成分是甘草酸和皂苷類化合物。甘草作為 國家重點保護(hù)的二級野生藥材物種。保護(hù)甘草資源，合理開發(fā)利用，不僅對現(xiàn) 有脆弱的生態(tài)環(huán)境具有重要意義，而且對國民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有一定的促 進(jìn)作用。甘草皂苷作為一類生物活性較強(qiáng)的成分，在醫(yī)藥、保健品、化妝品、 食品添加劑等方面具有廣泛的應(yīng)用價值，其市場需求日益強(qiáng)勁。開發(fā)出從甘草 渣中提取中提取皂苷類物質(zhì)的研究，有利于資源的科學(xué)利用，對提高產(chǎn)品副加 值，農(nóng)民增收等具有重要的意義。甘草皂苷是甘草地下部分最重要的五環(huán)三萜皂苷類生理活性物質(zhì)之一，是 非常珍貴的天然解毒劑，有顯著的促進(jìn)腎上腺皮激素樣作用，可用于人體抗衰 老、抗炎癥、降壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高生理機(jī)能，改善高血脂癥，維持水鹽代謝平衡。國內(nèi)外的最新研究證明高劑量的甘草皂苷可以完全阻止SARS 病毒的復(fù)制；甘草皂苷能促進(jìn)艾滋病患者免疫力的恢復(fù)，誘導(dǎo)干擾素，抑制癌 細(xì)胞的生長；甘草皂苷的鉀鹽的甜度是蔗糖的500倍，目前主要作為無熱量、 高強(qiáng)度的食品甜味劑，并賦予食品防病抗病功能。不僅如此，甘草皂苦還廣泛 應(yīng)用于煙草、化工、釀造、國防等行業(yè)。傳統(tǒng)的皂苷提取方法有水浸法、酸堿浸提法、醇提法等，其利用簡單的物 理方法提取甘草中的皂苷，效率低且易造成環(huán)境污染。而近來利用微波、超聲 波輔助提取法、超臨界C02萃提法等新型物理儀器提取皂苷的方法，因提取效 率較高而受到廣泛關(guān)注，但由于在生產(chǎn)應(yīng)用中存在一次性投資過大、操作煩瑣， 使其在工業(yè)應(yīng)用中受到一定程度的制約。離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因是20世紀(jì)90年代中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點實驗 室在研究注入離子與生物體相互作用的基礎(chǔ)上，首先提出的一種新的轉(zhuǎn)基因方 法。作為一種全新的轉(zhuǎn)基因手段，離子注入介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因有其自身的特點首先， 不需要事先知道或克隆出目的DNA片段，其次可轉(zhuǎn)移DNA大片段，適于多基 因或基因簇的轉(zhuǎn)導(dǎo)；其次，轉(zhuǎn)入的外源DNA是直接整合入宿主總DNA中，因 此具有較好的遺傳穩(wěn)定性。注入離子對細(xì)胞具有極強(qiáng)的刻蝕作用，致使細(xì)胞表 面形成可使外源DNA進(jìn)入的通道，這一點與基因槍方法并無差異。注入離子對 細(xì)胞的刻蝕和濺射作用屬于冷加工性質(zhì)，不傷及鄰近組織和細(xì)胞，比產(chǎn)生熱效 應(yīng)的激光束法具有明顯的優(yōu)勢。同時由于注入正離子的積累，大大降低了細(xì)胞 表面的負(fù)電性，從而減少了細(xì)胞對溶液中帶負(fù)電的外源DNA的靜電斥力，有利 于外源基因的導(dǎo)入。加之通道局部區(qū)域也由于帶正電，便于吸引帶負(fù)電性的DNA 主動進(jìn)入受體細(xì)胞。另一方面，目前離子注入在真空環(huán)境中進(jìn)行，真空造成的 負(fù)壓使細(xì)胞內(nèi)部的部分水分蒸發(fā)，當(dāng)干燥的細(xì)胞進(jìn)入含有DNA的緩沖液中時， 由于吸脹作用加強(qiáng)，也增加了外源DNA進(jìn)入通道的機(jī)會。此外，離子注入會對 受體細(xì)胞內(nèi)染色體造成直接損傷(如斷裂)和間接損傷(如自由基作用)，也增 加了外源DNA與受體細(xì)胞DNA重組和整合的機(jī)會。正是這些因素使得離子束介導(dǎo)DNA大分子的遺傳轉(zhuǎn)化具有較高的轉(zhuǎn)化率。實現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘草皂苷的技術(shù)突破，將對中國干旱半干旱荒漠地區(qū) 生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和民族制藥業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過對照現(xiàn)有技術(shù)，針對甘草皂苷的提取釆用微生物發(fā)酵獲得未見報道，而通過離子注入介導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化獲得有效的微生物菌種 發(fā)酵獲得甘草皂苷也未見報道。本發(fā)明的目的是提供一種為獲得甘草皂苷的重 組酵母菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明提供了重組酵母工程菌菌抹，通過離子注入介 導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的方法獲得的二林產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母菌，其 分別為釀酒酵母(Sacc/zaramF^ cewv/v&e ) CGMCC 2182和熱帶假絲酵母 (Qw^Vforap/cafo) CGMCC 2180,這兩種菌種通過傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝都可以 有效獲得甘草皂苷。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的兩種菌種都為酵母菌屬，具有常規(guī)酵母菌的一些 共同的技術(shù)特征，都通過傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)有效獲得甘草皂苷，是基于提取甘草 皂苷共同技術(shù)要求前提下實現(xiàn)。具體地，本發(fā)明采用已公開的技術(shù)，具體技術(shù)已經(jīng)通過申報國家發(fā)明專利， 其申請?zhí)枮椋赐ㄟ^改良的CTAB法大量提取野生烏拉爾甘草(G(yqyrW^za wra/e"w》并獲得總DNA，通過在酵母中轉(zhuǎn)化從而獲得本發(fā)明產(chǎn)甘草皂苷的兩抹 重組酵母菌。本發(fā)明技術(shù)方案所用酵母菌并不限于酵母屬(&cc/7aram;;cM)、假絲酵母屬 (Cam/Wa)和其他酵母屬通過發(fā)酵可獲得甘草急苦，本發(fā)明技術(shù)效果的再現(xiàn)，同 時在于，通過離子注入介導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的技術(shù)方案的結(jié)合。具 體地，本發(fā)明優(yōu)選為釀酒酵母(Sacc/^ramycw cerev/v/ae ) CGMCC. No.2182的 和熱帶假絲酵母(^ / /cafo ) CGMCC.No.2180。一方面，本發(fā)明提供了一種重組酵母菌抹的菌林，命名為1014，其主要次生代謝產(chǎn)物為甘草皂香。該菌抹已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京 市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院^鼓生物研究所，郵編100101。保藏日期是2007 年9月19日，保藏號是CGMCC.No. 2182。根據(jù)受體菌的來源，經(jīng)纟鼓生物學(xué)鑒 定，1014菌為釀酒酵母(S"cc/^rawyces cereWvz'"e ), 該菌抹的菌落呈乳白色, 中央隆起，邊緣圓整；細(xì)胞卵形，大小2.5 10x4.5 21pm;斜面菌種培養(yǎng)溫度 28 - 30°C ,培養(yǎng)時間24 h;液體搖瓶培養(yǎng)溫度28 - 30°C ,轉(zhuǎn)速200 - 220 r/m, 培養(yǎng)時間96 h?？刹捎萌缦路椒▽ζ溥M(jìn)行保存釆用常規(guī)的斜面?zhèn)鞔４娣ǎ?此方法是將本發(fā)明菌種接種于只要適合于酵母菌生長的斜面培養(yǎng)基表面，常規(guī) 培養(yǎng)和保存即可?；蚴抢谜婵绽鋬龈稍锓▽⒈景l(fā)明菌種制成干粉菌種，低溫 或常溫保藏即可。本發(fā)明進(jìn)一步建立菌種保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技 術(shù)。另一方面，本發(fā)明提供了一種重組酵母菌林，命名為2053,其主要次生代 謝產(chǎn)物為甘草皂苷。該菌林已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏 單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市北 京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2007 年9月19日，保藏號是CGMCC.No.2180。根據(jù)受體菌的來源，經(jīng)微生物學(xué)鑒 定，2053菌為熱帶假絲酵母(Omcfe^ frop/cato),該菌抹的菌落呈乳白色， 中央隆起，邊緣圓整；細(xì)胞卵形，大小4~8x5~llpm;斜面菌種培養(yǎng)溫度30-32°C，培養(yǎng)時間24 h;液體搖瓶培養(yǎng)溫度30 - 32°C ，轉(zhuǎn)速200 - 220 r/m,培養(yǎng) 時間96 h?？刹捎蒙鲜霰４?014菌的方法對其進(jìn)行保存。通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以通過技術(shù)方案獲 得的二林重組酵母菌，即釀酒酵母(& cc/zaram_ycw cgrev/v/ag ) CGMCC 2182和 熱帶假絲酵母(Cam&i" frop/cafc ) CGMCC 2180,通過傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術(shù) 手段有效獲得甘草皂苷的有益效果。本領(lǐng)域所知，急苦類成分由于結(jié)構(gòu)中一般沒有共軛體系，而且皂苷為大極性化合物，通常需水或醇提取，水溶性雜質(zhì)多，給其定量分析帶來一定的困難。 本發(fā)明中，甘草渣中皂苷類物質(zhì)的定性、定量測定可以運(yùn)用本領(lǐng)域熟知的比色法(Co/or/zz7e"/)、分光光度法(6^ec"o/ 力W湖e"/)、薄層掃描法(7ZC5) 和高效液相色語(歷m法。樣品用曱醇提取，用以米反復(fù)脫脂，殘渣干燥稱 重，規(guī)定含總皂苷不少于6.0% ;單體皂苦可采用薄層掃描法和高效液相色譜 法。多數(shù)采用高效液相色鐠法，檢測方法有紫外檢測器和ELSD檢測器。樣品 可用曱醇提取后直接進(jìn)樣分析，或先用三氯甲烷脫脂再用水飽和的正丁醇提取， 提取液蒸干，殘渣曱醇溶解后進(jìn)樣分析，或曱醇提取，回收曱醇，殘渣用水飽 和的正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，樣品上D101大孔吸附樹脂柱，水洗后 再用不同濃度的乙醇溶液洗脫，收集含急菩部分，回收乙醇，殘渣用甲醇溶解 進(jìn)樣分析。


無具體實施方式
實施例一產(chǎn)甘草皂香的重組釀酒酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生烏拉爾甘草(G(vqFr/z/zfl Mra/e似/力的總 DNA。取細(xì)胞濃度為1.0 x 1(^CFU/mL的釀酒酵母菌體稀釋液0.1mL均勻涂布于直 徑90mm的無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，置于LCD1000型離子注入才幾 小真空靶室的無菌靶臺上進(jìn)行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、劑量15 x 1015ions/cm2,真空度10"3pa。用2mL烏拉爾甘草總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的酵母菌膜，28 。C溫育2h后，洗脫至YEPD平板。其中，YEPD培養(yǎng)基的成分為(w/v):酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%、瓊月旨2.0%,其余為無菌水。將YEPD平板上生長的菌落接入斜面培養(yǎng)，再進(jìn)行液體培養(yǎng)。收集培養(yǎng)液， 進(jìn)行薄層色i普(TLC)檢測。獲得一抹編號為1014的重組釀酒酵母菌，其培養(yǎng)液中含有與甘草急苷標(biāo)準(zhǔn)樣品相同Rf值的物質(zhì)。重組釀酒酵母菌1014于2007年9月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏號為2182。 實施例二產(chǎn)甘草皂苷的重組熱帶假絲酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生烏拉爾甘草(G^qy廳/n'zfl wra/em/力的總 DNA〇取細(xì)胞濃度為1.0 x 1(^CFU/mL的熱帶假絲酵母菌體稀釋液0.1mL均勻涂布 于直徑90mm的無菌平亞中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，置于LCD1000型離子注 入機(jī)小真空靶室的無菌靶臺上進(jìn)行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、劑量15 x 1015ions/cm2,真空度10.3pa。用2mL烏拉爾甘草總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的酵母菌膜，28 。C溫育2 h后，洗脫至YEPD平板。其中，YEPD培養(yǎng)基的成分為(w/v):酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%、瓊月旨2.0%，其余為無菌水。將YEPD平板上生長的菌落接入斜面培養(yǎng)，再進(jìn)行液體培養(yǎng)。收集培養(yǎng)液， 進(jìn)行薄層色語(TLC)檢測。獲得一抹編號為2053的重組熱帶假絲酵母菌，其 培養(yǎng)液中含有與甘草皂苷標(biāo)準(zhǔn)樣品相同Rf值的物質(zhì)。重組熱帶假絲酵母菌2053于2007年9月19日保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為2180。通過上述的實施例，更容易理解本發(fā)明。上述實施例只是舉例性的描述， 而不應(yīng)當(dāng)被理解為用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用酵母菌并不限于酵母屬 (&cc/2aramyce"、假絲酵母屬(Ca"At/a)和其他酵母屬通過發(fā)酵可獲得甘草皂苷， 同時在于，通過離子注入介導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的技術(shù)方案的結(jié)合。 另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指重量百分比。
權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母，其特征在于，所選用的重組酵母優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2182或熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2180。
全文摘要
本發(fā)明公開一種產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母，通過離子注入介導(dǎo)甘草總DNA在酵母菌中轉(zhuǎn)化的方法獲得的二株產(chǎn)甘草皂苷的重組酵母菌，其分別為釀酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2182和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2180。實現(xiàn)重組酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)甘草皂苷的技術(shù)突破，將對于干旱半干旱荒漠地區(qū)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和發(fā)展具有重要意義。
文檔編號C12R1/865GK101230321SQ20071018002
公開日2008年7月30日 申請日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者凌海秋, 樊永紅, 武寶山, 毛培宏, 湘 金 申請人:新疆大學(xué)