專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種提高植物產(chǎn)量的方法及其表達(dá)盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提高植物產(chǎn)量的方法及其專(zhuān)用表達(dá)盒。
背景技術(shù)：
：綠色植物通過(guò)光合作用制造有機(jī)物，植物光合作用固定C02產(chǎn)生的原初光合同化產(chǎn)物(primaryphotoassimilates)—部分在葉綠體轉(zhuǎn)化為淀粉，另一部分則以三碳糖的形式輸送到細(xì)胞質(zhì)用于蔗糖的合成及其它代謝反應(yīng)。光合作用的效率及其兩大原初同化產(chǎn)物一一淀粉和蔗糖的分配方式對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量有著很大的影響。目前，增加作物的產(chǎn)量主要從三個(gè)方面來(lái)操作(1)增加源葉片中蔗糖的合成；(2)增加蔗糖的運(yùn)輸能力，即提高H+/蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)量或酶活性；(3)改善庫(kù)的利用。植物的光合速率一方面取決于光強(qiáng)，二氧化碳濃度等因素，另一方面也受參與C02的固定卡爾文循環(huán)(Calvincycle)的各種酶(如1，5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)、葉綠體型l，6-二磷酸果糖酶)的活性、原初同化產(chǎn)物的分配、碳水同化產(chǎn)物的運(yùn)輸及在庫(kù)器官的利用等自身代謝的影響。葉綠體與細(xì)胞質(zhì)間的物質(zhì)交流對(duì)于調(diào)節(jié)光合速率以滿足植物組織對(duì)光合產(chǎn)物的需求起著重要作用，這一過(guò)程是通過(guò)葉綠體膜系統(tǒng)來(lái)完成的。在葉綠體的內(nèi)膜上，有一特異的磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(triosephosphatetranslocator，TPT)負(fù)責(zé)磷酸丙糖的運(yùn)輸。在正常生理?xiàng)l件下，TPT的運(yùn)輸嚴(yán)格遵循1:l反向交換，即一個(gè)分子物質(zhì)運(yùn)入葉綠體，則另一個(gè)分子物質(zhì)以相反的方向運(yùn)出葉綠體。磷酸丙糖從葉綠體中運(yùn)出之后，在細(xì)胞質(zhì)中參與蔗糖、氨基酸等的合成反應(yīng)。蔗糖在細(xì)胞質(zhì)中合成的主要限速酶是細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶(cytosolicfructose-1,6-bisphosphatase,cyFBPase)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)，前者與6-磷酸果糖激酶(PFK)和焦磷酸6-磷酸果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(pyrophosphate:fructose-6-phosphate-1-phosphotransferase,PFP講同調(diào)控1，6-二磷酸果糖(FBP)向6-磷酸果糖(F6P)的轉(zhuǎn)化；后者催化蔗糖合成的最后一步。通過(guò)改變這些酶的活性或者打破這些反應(yīng)的平衡，就可以使反應(yīng)向增加蔗糖合成的方向移動(dòng)。在無(wú)機(jī)磷酸存在時(shí)，PFP催化FBP脫磷形成F6P和無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)，蔗糖合成反應(yīng)中由葡萄-l-磷酸(GlP)到UDP-葡萄糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)也釋放出PPi。焦磷酸水解酶(Pyrophosphatase，PPase)可將1個(gè)分子的無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)水解成2個(gè)分子的無(wú)機(jī)磷(Pi)。因此根據(jù)化學(xué)平衡原理，通過(guò)表達(dá)外源焦磷酸水解酶不斷的去除細(xì)胞質(zhì)中的焦磷酸將會(huì)刺激細(xì)胞質(zhì)中反應(yīng)向蔗糖合成的方向進(jìn)行，同時(shí)也為磷酸丙糖向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移提供了充足的交換體-無(wú)機(jī)磷酸。為了提高碳水同化產(chǎn)物向蔗糖的分配比，大腸桿菌的焦磷酸水解酶基因被克隆到35S啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入馬鈴薯和煙草，Northern雜交證明在轉(zhuǎn)基因植物中存在此焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。與野生型相比，兩種轉(zhuǎn)基因植株源葉片中可溶性糖與淀粉的比例都增加了3-4倍。與非轉(zhuǎn)基因相比煙草中葡萄糖含量提高68倍，果糖提高24倍，蔗糖提高12倍，淀粉提高8倍；在馬鈴薯中碳水同化產(chǎn)物分配的改變是因?yàn)檎崽翘岣吡?倍，淀粉含量降低造成的(SonnewaldU(1992)Expressionofco//inorganicpyrophosphataseintransgenicplantsaltersphotoassimilatepartitioning.PlantJ2:571-581)。但是，上述轉(zhuǎn)基因植物的植株矮化，節(jié)間變短，無(wú)機(jī)焦磷酸的含量下降，老葉片中可溶性糖的含量是野生型的100倍。轉(zhuǎn)基因植株矮化推測(cè)可能是由于35S啟動(dòng)子組成型表達(dá)所引起，在轉(zhuǎn)基因植物的維管束中表達(dá)焦磷酸水解酶造成焦磷酸含量的下降，而焦磷酸又是蔗糖長(zhǎng)距離運(yùn)輸所必需的，焦磷酸的降低造成蔗糖在韌皮部的裝載受阻，因而大量蔗糖積累在葉片中(SonnewaldU(1992)Expressionofco//inorganicpyrophosphataseintransgenicplantsaltersphotoassimilatepartitioning.PlantJ2:571-581;Lerchl,J.,Geigenberger,P.,Stitt,M.&Sonnewald,U.(1995)Impairedphotoassimilatepartitioningcausedbyphloem-specificremovalofpyrophosphatecanbecomplementedbyaphloem-specificcytosolicyeast-derivedinvertaseintransgenicplants.尸/a^Ce〃7,259-270)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高作物產(chǎn)量的方法及其專(zhuān)用表達(dá)盒。本發(fā)明所提供的提高作物產(chǎn)量的表達(dá)盒，可在植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)能夠水解焦磷酸的焦磷酸水解酶基因，包括依次串聯(lián)的植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、焦磷酸水解酶基因和終止子；所述焦磷酸水解酶基因具有自GENBANK號(hào)為ABE10235的5'端第1一531位核苷酸。所述植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子為cyFBPase啟動(dòng)子，所述cyFBPase啟動(dòng)子具有自GENBANK號(hào)為NC—008394.1的5'端第37511734—37512949位核苷酸；所述終止子為OCS終止子，所述OCS終止子具有自GENBANK號(hào)為V00088的5'端第1403—1629位核苷酸。含有上述的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體，工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述含有上述的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為雙元表達(dá)載體，優(yōu)選為pCAMBIA1300。本發(fā)明所提供的提高作物產(chǎn)量的方法，是將上述的可在植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的表達(dá)盒導(dǎo)入作物中，篩選得到可表達(dá)焦磷酸水解酶的作物，即為產(chǎn)量提高的作物。所述可在植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的表達(dá)盒是通過(guò)上述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。所述植物為水稻、小麥、大麥、玉米等單子葉禾本科植物。本發(fā)明的方法利用葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)啟動(dòng)子控制焦磷酸水解酶基因在植物的葉肉細(xì)胞中表達(dá)焦磷酸水解酶，通過(guò)表達(dá)的焦磷酸水解酶不斷的去除細(xì)胞質(zhì)中的焦磷酸將會(huì)刺激細(xì)胞質(zhì)中反應(yīng)向蔗糖合成的方向進(jìn)行，改善水稻中碳水化合物的分配，同時(shí)也為磷酸丙糖向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移提供了充足的交換體-無(wú)機(jī)磷酸，而且又通過(guò)葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)，避免了因韌皮部特別是伴胞中焦磷酸的降低造成蔗糖在韌皮部的裝載受阻，從而達(dá)到提高作物產(chǎn)量的目的。本發(fā)明方法可大大提高轉(zhuǎn)基因植物，特別是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的產(chǎn)量水平。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的在葉肉細(xì)胞中特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的表達(dá)盒通過(guò)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入秈稻6547和粳稻8706中，篩選得到的可特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)基因水稻，水稻中碳水化合物的分配得到改善，產(chǎn)量最高提高了50%。圖1為FBP:PPase的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖圖2為部分抗性篩選陽(yáng)性的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系的PCR結(jié)果圖3為轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的Western(圖3中a)、PPase活性(圖3中b)和植物中無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)(圖3中c)的檢測(cè)結(jié)果圖4為可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻葉片中蔗糖，淀粉含量及同位素示蹤結(jié)果圖5為可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻中蔗糖和淀粉的晝夜變化圖6為轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的代謝物分析圖7為可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的光合作用的變化具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明將葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子(cyFBPase啟動(dòng)子)和焦磷酸水解酶(PPase)基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物中，利用葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子來(lái)控制焦磷酸水解酶在水稻中的表達(dá)，通過(guò)表達(dá)外源焦磷酸水解酶不斷地去除細(xì)胞質(zhì)中焦磷酸將會(huì)刺激細(xì)胞質(zhì)中反應(yīng)向蔗糖合成的方向進(jìn)行，同時(shí)也為磷酸丙糖向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移提供充足的交換體-無(wú)機(jī)磷酸。以便改變植株中碳水同化產(chǎn)物的分配，從而提高植物的產(chǎn)量。以水稻為例，構(gòu)建產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因水稻，并對(duì)其碳水同化產(chǎn)物的分配，產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下所述。實(shí)施例1、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)基因水稻的創(chuàng)制及其產(chǎn)量鑒定一、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)焦磷酸水解酶基因水稻的創(chuàng)制1、可表達(dá)焦磷酸水解酶(PPase)基因的重組載體(FBP:PPase載體)的構(gòu)建將含有cyFBPase啟動(dòng)子pCambia1391Z載體(購(gòu)自Cambia,澳大利亞，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)用五coRI酶切，得到1229bp的片段，即cyFBPase啟動(dòng)子(自GENBANK號(hào)為NC—008394.1的5'端第37511734—37512949位核苷酸)。將酶切得到的cyFBPase啟動(dòng)子片段插入到pCAMBIA1300的五coRI酶切位點(diǎn)，得到重組載體，將該重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證表明正確的含有cyFBPase啟動(dòng)子片段的pCAMBIA1300(Cambia，澳大利亞，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)重鄉(xiāng)且載j本命名為pCA-FBP。以大腸桿菌(￡w/zen'C/'flco//XLl-blue菌株，購(gòu)自北京萊博菲爾生物技術(shù)公司)基因組為模板，以5'引物F1:5'GGATCCATGAGCTTACTCAACGTCCCTGCGGGT3'和3'引物Rl:5'GGATCCTTATTTATTCTTGGCGCGCTCGAA3'為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到約530bp的片段，即PPase基因片段，經(jīng)測(cè)序表明，該P(yáng)Pase基因片段具有自GENBANK號(hào)為ABE10235的5'端第1_531位核苷酸序列。將該擴(kuò)增得到的PPase基因片段用5amHI酶切后，插入到pUC19(購(gòu)自北京萊博菲爾生物技術(shù)公司)的萬(wàn)flmHI酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體，將重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將經(jīng)鑒定表明正確的含有PPase基因的重組載體命名為pUC-PPase。將pUC-PPase用5flmHI酶切后，回收531bp的PPase基因片段(具有自GENBANK號(hào)為ABE10235的5'端第1一531位核苷酸序列)，正向插入到pCA-FBP6的5"mHI酶切位點(diǎn)，即正向插入到pCA-FBP的cyFBPase啟動(dòng)子后，獲得重組載體，將該重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證表明正確的含有cyFBPase啟動(dòng)子及與其串聯(lián)的正向PPase基因片段的pCAMBIA1300重組載體命名為pCA國(guó)FBP-PPase。直接以根癌農(nóng)桿菌(Jgra^cte〃'wm/wme/ade似)AGL1(購(gòu)自v47TC(^men'ca"7>/eCw//wreCo〃e"/o"))為模板，以5'引物F2:5'CAGGGCTCTCAATGGAGTTTGAA3'和3，引物R2:5'CAATCAGTAAATTGAACGGAGA3'為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到227bp的片段，即終止子OCS，經(jīng)測(cè)序表明，該終止子OCS片段具有自GENBANK號(hào)為V00088的5'端第1403—1629位核苷酸序列。將上述獲得的終止子OCS片段用與///dIII雙酶切后，插入到pCA-FBP-PPase的與F/wdIII酶切位點(diǎn)之間獲得重組載體，將該重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證表明正確的含有依次串聯(lián)的cyFBPase啟動(dòng)子、正向PPase基因片段和終止子OCS的重組載體命名為FBP:PPase(結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示)。圖1中，35S-pro為35SCaMV啟動(dòng)子，F(xiàn)BP-pro為cyFBPase啟動(dòng)子，t35為CaMV35S終止子，Hygromycin為潮霉素篩選抗性基因，tOCS為OCS終止子。2、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)PPase基因水稻的獲得和鑒定1)轉(zhuǎn)PPase基因水稻(轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻)的獲得將載體FBP:PPase通過(guò)農(nóng)桿菌AGL1(購(gòu)自」7TC(^men'ca"7>peCwtoCo//e"/o"))導(dǎo)入到水稻8706(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)愈傷組織中。轉(zhuǎn)化方法參見(jiàn)(易自力，曹守云，王力，何鍶潔，儲(chǔ)成才，唐祚舜，周樸華，田文忠(2001)提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的研究，遺傳學(xué)報(bào)，28(4):352-358)，獲得抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻Tq代株系。2)轉(zhuǎn)PPase基因水稻(轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻)的PCR鑒定分別提取步驟l)獲得轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系的基因組DNA，以焦磷酸水解酶基因編碼區(qū)特異的引物(上游引物F3:ATGAGCTTACTCAACGTCCCTGCGGGT;下游引物R3:TTATTTATTCTTGGCGCGCTCGAA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并以未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706)為對(duì)照，結(jié)果表明，步驟l)獲得的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系中，共有11株可以擴(kuò)增出約500bp長(zhǎng)的預(yù)期帶，并經(jīng)測(cè)序表明擴(kuò)增片段為焦磷酸水解酶基因片段，而未轉(zhuǎn)基因水稻陰性對(duì)照中沒(méi)有任何擴(kuò)增帶，說(shuō)明獲得了ll個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系。部分抗性篩選陽(yáng)性的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系To代植株的PCR結(jié)果如圖2所示。圖2中，泳道l為分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為未轉(zhuǎn)基因水稻陰性對(duì)照;泳道3-13為抗性篩選陽(yáng)性的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系擴(kuò)增結(jié)果。3)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)PPase基因水稻(轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻)的篩選通過(guò)對(duì)后代中潮霉素鑒定和篩選，獲得三個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase純合轉(zhuǎn)基因株系，株系27、34和37。分別將未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照，WT)和轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系27、34和37完全張開(kāi)的成熟葉片總蛋白30ug加熱變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，用PPase特異性抗體(抗體的制備，是將大腸桿菌表達(dá)的大腸桿菌PPase蛋白免疫注射兔子三次(每10天注射一次，共計(jì)l個(gè)月所獲的兔子的血清)進(jìn)行Western檢測(cè)。Western檢測(cè)結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)基因的陰性對(duì)照植株(WT)中沒(méi)有任何帶，而三個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系27、34和37中有一條預(yù)期大小32kD的特異帶(如圖3中a所示)，說(shuō)明篩選得到3個(gè)外源基因焦磷酸水解酶已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系。轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻Io代植株的種子及該種子發(fā)育而成的植株為轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻1\代，依次類(lèi)推T,代植株的種子及該種子發(fā)育而成的植株為T(mén)2代。二、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻葉片中焦磷酸水解酶表達(dá)活性分析檢測(cè)未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照，WT)和上述得到的三個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系27、34和37葉片中焦磷酸水解酶活性，方法和步驟按照(So皿ewaW,U.(1992)Expressionof五.co//inorganicpyrophosphataseintransgenicplantsaltersphotoassimilatepartitioning.P/fl"/J2,571-581)進(jìn)行。結(jié)果如圖3中b所示，表明，在步驟一篩選得到的可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)PPase基因水稻株系，焦磷酸水解酶活性比未轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)照提高3至5倍；這一結(jié)果證明步驟一篩選得到的可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)PPase基因水稻株系表達(dá)的焦磷酸水解酶在植物體內(nèi)有很高的酶活性。同時(shí)對(duì)三個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系27、34和37以及未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照，WT)的無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)含量進(jìn)行了檢測(cè)。按照(Sonnewald,U.(1992)Expressionof五.co//inorganicpyrophosphataseintransgenicplantsaltersphotoassimilatepartitioning.P/a"〃.2,571-581)進(jìn)行無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)的提取，提取后立即上樣檢測(cè)。具體檢測(cè)方法是PPi的檢測(cè)采用日本島津HPLC10Avp系統(tǒng)(Shimadzu，Japan)禾卩Corona電噴霧檢測(cè)器(ChargedAerosolDetector)(ESAInc"USA)組合系統(tǒng)，分離柱采用5pmHamiltonPRP-X100(100x4.1mm)陰離子交換柱和25x2.3mm保護(hù)柱(HamiltonInc.,USA)，流動(dòng)相為60mM銨/100mM甲酸，流速為每分鐘1.0ml。采用焦磷酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)樣品。檢測(cè)結(jié)果表明，三個(gè)不同轉(zhuǎn)基因植物株系中無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)含量比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?WT)都顯著降低(結(jié)果如圖3c所示)。三、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻葉片中碳水化合物含量的分析分別取步驟一篩選得到的其中三個(gè)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系(株系29、34、37)植株或未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照，WT)完全展開(kāi)的成熟葉，按照(Geigenberger,P.eZ(1998)Overexpressionofpyrophosphataseleadstoincreasedsucrosedegradationandstarchsynthesis,increasedactivitiesofenzymesforsucrose-starchinterconversions,andincreasedlevelsofnucleotidesingrowingpotatotubers./Vawto205,428-437)所述方法提取、檢測(cè)植物葉片中蔗糖和淀粉含量，結(jié)果如圖4中a所示，結(jié)果表明，可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻29、34、37株系與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?WT)相比蔗糖的含量沒(méi)有顯著差異，但淀粉的含量比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ战档土?-5倍(圖4中a)。為了證明所固定的C02向蔗糖合成的方向流動(dòng)，對(duì)步驟一篩選得到的其中三個(gè)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系(株系29、34、37)植株和未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照，WT)葉片進(jìn)行了"C02示蹤實(shí)驗(yàn)，具體方法如下利用直徑為1厘米打孔器從播種60天生長(zhǎng)在大田的步驟一篩選得到的三個(gè)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系(株系29、34、37)和未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照,WT)完全展開(kāi)的旗葉上取樣，所取葉盤(pán)快速放入密閉保濕的有機(jī)玻璃培養(yǎng)室中一個(gè)吸水的海綿上以保持濕度。在培養(yǎng)室中放入一個(gè)小的培養(yǎng)皿，其中含2毫升10mM2-嗎啉乙磺酸[2-(N-morpholino)ethanesulphonicacid,MES)](pH6.5;用KOH調(diào)節(jié))和40pCi的NaH"CO3，待所取葉盤(pán)在培養(yǎng)室中完全擺放好后，向小培養(yǎng)皿中加入2—3毫升10。/。lmol/L鹽酸，以釋放14C同位素標(biāo)記的C02，立即關(guān)閉有機(jī)玻璃培養(yǎng)室并密封，在有機(jī)玻璃培養(yǎng)室外60cm上方加光強(qiáng)為250pEinstein的光照，培養(yǎng)l個(gè)小時(shí)后，收集葉盤(pán)，用80%(Wv)酒精80°C培養(yǎng)1小時(shí)，可溶和不可溶成分分別在液閃計(jì)數(shù)器下檢測(cè)計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖4中b所示，同位素示蹤也表明，新固定的"C整合到不可溶成分的比率比未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照相比顯著降低，而轉(zhuǎn)基因植物比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ照系娇扇苄猿煞值谋嚷拭黠@升高。這些結(jié)果表明，在可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻中淀粉的含量顯著下降是由于新固定的C02中本應(yīng)合成淀粉的那一部分碳水同化產(chǎn)物分配至蔗糖合成途徑，而所合成的蔗糖都已通過(guò)植物的運(yùn)輸組織運(yùn)向庫(kù)器官，因而在源葉片中并沒(méi)有造成蔗糖的積累。由此可見(jiàn)，焦磷酸水解酶在可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的葉肉細(xì)胞中特異性表達(dá)確實(shí)可以改變碳水化合物的分配。四、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻葉片碳水同化產(chǎn)物分配的晝夜變化分析為了研究焦磷酸水解酶的表達(dá)對(duì)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻晝夜碳水同化產(chǎn)物分配的影響，分別在一天的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)(10:00，14:00，18:00，22:00，2:00，6:00)分別取步驟一篩選得到的可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻(株系29、34、37的^代植株，每個(gè)株系選5株植株)或未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照，WT)(5株)葉片，然后分析其可溶性糖與淀粉的變化。方法按照文獻(xiàn)(Geigenberger,P."(1998)Overexpressionofpyrophosphataseleadstoincreasedsucrosedegradationandstarchsynthesis,increasedactivitiesofenzymesforsucrose-starchinterconversions,andincreasedlevelsofnucleotidesingrowingpotatotubers.尸/aw/a205,428-437)所述進(jìn)行。結(jié)果如圖5所示，蔗糖的晝夜變化具有很明顯的規(guī)律性，在凌晨2:00至早上6:00可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻蔗糖含量較低，上午10:00時(shí)蔗糖含量即已開(kāi)始回升，至14:00達(dá)到最大值，此后開(kāi)始下降。可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻在夜間的淀粉含量盡管比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?，但它仍然保持了足夠的量以確保植物在夜間的正常生命活動(dòng)所需。圖5中，WT為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?個(gè)單株檢測(cè)的平均值，29、34、37分別為三個(gè)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻29、34、37株系5個(gè)植株單株檢測(cè)的平均值。五、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的代謝分析對(duì)步驟一篩選得到的可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻(株系29、34、37的T^代植株，每個(gè)株系選5-7株植株)和未轉(zhuǎn)基因水稻(水稻8706，陰性對(duì)照,WT)(5-7株)進(jìn)行代謝物分析。代謝物分析方法和步驟按照文獻(xiàn)(Geigenberger,P."W(1998).Overexpressionofpyrophosphataseleadstoincreasedsucrosedegradationandstarchsynthesis,increasedactivitiesofenzymesforsucrose-starchinterconversions,andincreasedlevelsofnucleotidesingrowingpotatotubers.P/a齒205,428-437)所述方法進(jìn)行。分析結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻(株系29、34、37)與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?-磷酸果糖、3-磷酸甘油酸的含量沒(méi)有明顯差異；6-磷酸葡萄糖含量在轉(zhuǎn)基因株系29中提高了83%，在34與37中分別比對(duì)照提高了26%、12%;尿苷二磷酸葡萄糖的含量顯著增加，在29、34、37三個(gè)株系分別比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗岣?倍、2倍、1.18倍。尿苷二磷酸葡萄糖是合成6-磷酸蔗糖的物質(zhì)之一，且僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，因此其含量的顯著提高說(shuō)明代謝反應(yīng)的確向蔗糖合成的方向轉(zhuǎn)移。圖6中，WT為未轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)照(5-7株檢測(cè)的平均值)；29、34、37為轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻29、34、37株系5-7株單株檢測(cè)的平均值。六、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的光合作用分析當(dāng)植物的光合產(chǎn)物從葉片中輸出過(guò)快時(shí)，就會(huì)造成植物的Calvin循環(huán)中的中間產(chǎn)物降低，從而導(dǎo)致光合速率降低。為了研究可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻中的光合速率的變化，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻在光強(qiáng)(0-2000pmoLm'V1)條件下的光合速率。具體方法如下所述水稻凈C02吸收率是在水稻灌衆(zhòng)早期通過(guò)檢測(cè)旗葉的光合作用進(jìn)行的。光反應(yīng)曲線采用LI-6400便攜式光合作用測(cè)定儀(Li-cor,Lincoln,NE，USA)。測(cè)定參數(shù)設(shè)定如下C02流速為400pmol/秒，氣體流速為500pmol/秒，設(shè)定溫度28V。光強(qiáng)由0到2000pmolVm力秒通過(guò)葉室上的LED光源實(shí)現(xiàn)。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照相比，凈C02同化率在可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻中有顯著提高。在光飽和點(diǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物的光合速率比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭叱?0%。這說(shuō)明葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)焦磷酸水解酶能夠提高轉(zhuǎn)基因水稻的光合作用。七、可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的產(chǎn)量檢測(cè)對(duì)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻(株系29、株系34、株系37)小面積的田間種植實(shí)驗(yàn)，以未轉(zhuǎn)基因水稻(野生型水稻8706)為對(duì)照，每個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系和野生型對(duì)照均種植60株，待種子完全成熟后，每個(gè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系和野生型對(duì)照分別取10株檢測(cè)株高，每株分蘗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)，每穗總粒數(shù)，結(jié)實(shí)率、千粒重，單株產(chǎn)量等，然后計(jì)算轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因株系對(duì)照相比產(chǎn)量增加情況。產(chǎn)量增加(％)=(轉(zhuǎn)基因株系一未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?/未轉(zhuǎn)基因?qū)φ誼100。/。。結(jié)果表明，可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的地上部分和地下部分的生長(zhǎng)均比野生型旺盛，單株分蘗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率與野生型相比均有增加(表1)，但千粒重、株高等與對(duì)照相比沒(méi)有顯著變化。單株產(chǎn)量與對(duì)照相比增加了24—50%。表1.轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量檢測(cè)農(nóng)藝性狀野生型株系29株系34株系3711<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>對(duì)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻(株系29、株系34、株系37)和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?野生型)分別在北京(2004年)和浙江(2005年)進(jìn)行小區(qū)產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)，在北京和在浙江的大田試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)六個(gè)重復(fù)，每塊田約133.3平方米。轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系和野生型對(duì)照(水稻8706)種植行間距均為25cmxl5cm，待種子完全成熟后，對(duì)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系和野生型對(duì)照(水稻8706)實(shí)測(cè)產(chǎn)量，然后計(jì)算轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因株系的理論產(chǎn)量以及對(duì)照相比產(chǎn)量增加情況。理論產(chǎn)量(Kg/公頃)二實(shí)測(cè)產(chǎn)量x75。產(chǎn)量增加(％)=(轉(zhuǎn)基因株系—未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?沫轉(zhuǎn)基因?qū)φ誼100。/。。結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，北京產(chǎn)區(qū)的可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻三個(gè)株系29、34、37與對(duì)照相比產(chǎn)量分別增加42%,32%,24%;在浙江的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此北京產(chǎn)區(qū)的結(jié)果相似，產(chǎn)量增加了22—47%(浙江，2005)。表2.轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻(株系29、34、37)的大田產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2、可表達(dá)焦磷酸水解酶轉(zhuǎn)基因秈稻6547的創(chuàng)制及其產(chǎn)量鑒定為了驗(yàn)證在不同的水稻品種中，特異性表達(dá)焦磷酸水解酶也可以增加產(chǎn)量，我們?cè)诙i稻6547中也通過(guò)農(nóng)桿菌方法表達(dá)FBP:PPase，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量進(jìn)行了田間試驗(yàn)。按照實(shí)施例1的方法將FBP:PPase載體被轉(zhuǎn)入秈稻6547(揚(yáng)州大學(xué))中，并篩選得到2個(gè)可表達(dá)焦磷酸水解酶的轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系3003和3010，分別在2004年和2005年進(jìn)行大田種植實(shí)驗(yàn)。每次試驗(yàn)設(shè)三個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)兩個(gè)重復(fù)，每塊田約133.3平方米。每個(gè)株系包括野生型對(duì)照種植行間距為25cmxl5cm，待種子完全成熟后，按照實(shí)施例1中步驟七的方法取樣檢測(cè)轉(zhuǎn)FBP:PPase水稻株系產(chǎn)量，同時(shí)以相同方法處理的未轉(zhuǎn)基因秈稻6547為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)表明，3003的產(chǎn)量與對(duì)照相比增加了11%(2004年)，18%(2005年)；株系3010與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾仍黾恿?%(2004年)，21%(2005年)(表3)。表3.轉(zhuǎn)FBP:PPase秈稻6547(株系3003、株系3010)的大田產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果株系2004年2005年產(chǎn)量(kg/ha)產(chǎn)量增加產(chǎn)量(kg/ha)產(chǎn)量增加秈稻65476253.2±214.25145.9±118.530036946.U135.311%6069.4±98.418%30106766.6±64.48%6208.0±181.921%1權(quán)利要求1、一種可在植物葉肉細(xì)胞中特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的表達(dá)盒，包括依次串聯(lián)的植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)啟動(dòng)子、焦磷酸水解酶基因和終止子；所述焦磷酸水解酶基因具有自GENBANK號(hào)為ABE10235的5′端第1—531位核苷酸。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于所述植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子為cyFBPase啟動(dòng)子，所述cyFBPase啟動(dòng)子具有自GENBANK號(hào)為NC—008394.1的5'端第37511734—37512949位核苷酸；所述終止子為OCS終止子，所述OCS終止子具有自GENBANK號(hào)為V00088的5'端第1403—1629位核苷酸。3、含有權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)盒的工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。4、含有權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為雙元表達(dá)載體。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA1300。7、一種提高植物產(chǎn)量的方法，是將權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)盒導(dǎo)入植物中，篩選得到可表達(dá)焦磷酸水解酶的植物，即為產(chǎn)量提高的植物。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中還將植物篩選標(biāo)記基因同所述表達(dá)盒一同轉(zhuǎn)入植物中。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述可在植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)焦磷酸水解酶基因的表達(dá)盒是通過(guò)權(quán)利要求4-6任意所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述植物為禾本科植物，優(yōu)選為水稻、小麥、大麥或玉米。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種提高植物產(chǎn)量的方法及其專(zhuān)用表達(dá)盒。所述提高植物產(chǎn)量的方法，是將可在植物葉肉細(xì)胞中特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的表達(dá)盒導(dǎo)入植物中，篩選得到可表達(dá)焦磷酸水解酶的植物，即為產(chǎn)量提高的植物。所述可在植物葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)焦磷酸水解酶的表達(dá)盒，包括依次串聯(lián)的cyFBPase啟動(dòng)子、焦磷酸水解酶基因和OCS終止子。本發(fā)明方法可大大提高轉(zhuǎn)基因植物，特別是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的產(chǎn)量水平。文檔編號(hào)C12N15/82GK101457234SQ200710179540公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日發(fā)明者儲(chǔ)成才,司麗珍,姚海根,宋德林,左建儒,張亞芳,潘學(xué)彪,王義琴,童紅寧,默罕默德申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所