專(zhuān)利名稱(chēng)：一種熒光pcr檢測(cè)單純皰疹病毒ii型的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒II型的試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速、定性檢測(cè)單純皰疹病毒II型感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中單純皰疹病毒II型核酸DNA進(jìn)行定性檢測(cè)，適用于單純皰疹病毒II型感染的輔助診斷，抗病毒治療的療效監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒herpes simplex virus，屬于皰疹病毒科a病毒亞科，病毒質(zhì)粒大小約180納米。根據(jù)抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。1型主要由口唇病灶獲得， 2型可從生殖器病灶分離到。感染是由于人與人的接觸。從發(fā)生后四個(gè)月到數(shù)年被感染的人數(shù)可達(dá)人口總數(shù)的50-90%，是最易侵犯人的一種病毒，但在臨床僅有一部份發(fā)病。此病可分為口唇性皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性皮膚炎、陰部皰疹、卡波西病等，有時(shí)也是腦膜炎、腦炎的病因?？诖讲堪捳钜话爿^易診斷，同時(shí)因日曬、發(fā)熱等種種的刺激因素而引起復(fù)發(fā)。該病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上及人、猴、雞等的動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中大量地增殖。HSV具有典型皰疹病毒形態(tài)特征。根據(jù)生物化學(xué)、生物學(xué)、流行病學(xué)等分為兩個(gè)血清型，即HSV-I和HSV-2。二者基因組相似，序列有50%的同源性，HSV基因組大約1521Λ，34 個(gè)基因，編碼70多個(gè)多肽(polyp印tides)。特別是基因編碼的晚期蛋白中有11種包膜糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM)，有些功能較清楚。其中g(shù)B和gD與病毒吸附和穿入有關(guān)，是與細(xì)胞特異性受體相互作用的病毒配體分子。gD誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力最強(qiáng)，可用于研制疫苗。gC是補(bǔ)體C3b-結(jié)合蛋白(complement C3b-binding protein) 0 gE是Fc受體，可與IgG的Fc端結(jié)合。gG為型特異性抗原，以此抗原能區(qū)別HSV-I (gG_l) 和HSV-2 (gG-2)。gH與病毒的釋放有關(guān)。HSV對(duì)動(dòng)物感染宿主范圍較廣。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為家兔、豚鼠及小鼠等。HSV在多種細(xì)胞中能增殖，常用原代兔腎、人胚腎細(xì)胞以及地鼠腎等傳代細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒。感染細(xì)胞很快出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，并出現(xiàn)嗜酸性核內(nèi)包涵體。單純皰疹病毒在全球廣泛分布，人群中感染極為普遍，潛伏和復(fù)發(fā)感染者較多?；颊吆蛶Ф菊呤窃摬〉膫魅驹础２《究赏ㄟ^(guò)皮膚、 粘膜的直接接觸或性接觸途徑進(jìn)入機(jī)體。新生兒皰疹是臨床上常見(jiàn)而又嚴(yán)重的感染，據(jù)統(tǒng)計(jì)死亡率超過(guò)50%，存活者約有 1/2嚴(yán)重?fù)p傷。HSV-1、HSV-2在分娩時(shí)均可通過(guò)產(chǎn)道感染新生兒，以HSV-2為多見(jiàn)，約占 75%。常發(fā)生在生后第6天。感染類(lèi)型有①皮膚、眼和口腔的局部損傷；②腦炎；③病毒播散到內(nèi)臟，發(fā)生膿毒血癥(s印sis)，常引起死亡。早期抗感染可減少死亡率。剖腹產(chǎn)是避免生殖道感染的有效方法。妊娠婦女感染HSV-1，病毒有可能經(jīng)胎盤(pán)感染胎兒，造成流產(chǎn)、死胎或先天性畸形。單純皰疹病毒I If多引起腰部以下的皮膚皰疹及外生殖器皰疹，主要存在于女性宮頸、陰道、外陰皮膚及男性的陰莖、尿道等處，是引起生殖器發(fā)炎和皰疹的主要原因。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)資料顯示，生殖器皰疹的病原體90%為II型皰疹病毒。微生物學(xué)檢查法包括病毒分離培養(yǎng)是當(dāng)今臨床上明確診斷皰疹病毒感染的可靠依據(jù)?？刹杉つw、生殖器等病變部位的水皰液、腦脊液、角膜刮取物、唾液等標(biāo)本，接種人二倍體成纖維細(xì)胞株 WI38及其它傳代細(xì)胞株如Vero、BHK等，經(jīng)M 48小時(shí)后，細(xì)胞則出現(xiàn)腫脹、變圓、細(xì)胞融合等病變。然后用HSV-I和HSV-2的單克隆抗體作免疫熒光染色鑒定或應(yīng)用DNA限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析來(lái)定型?？贵w檢測(cè)常用于抗體檢測(cè)的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫熒光及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，臨床多用于急性感染診斷和器官移植患者的檢測(cè)，以及流行病學(xué)調(diào)查。如用于急性感染診斷，應(yīng)采取急性期和恢復(fù)期雙份血清，同時(shí)檢測(cè)血清中的IgG和IgM。DNA檢測(cè)取病變組織或細(xì)胞，提取病毒DNA，與標(biāo)記的HSV DNA探針進(jìn)行雜交或應(yīng)用PCR檢測(cè)HSV-I或HSV-2的gB糖蛋白基因來(lái)判斷是否是HSV的感染。這種方法已用于疑為HSV腦炎患者的診斷。而實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一種新的PCR方法，是在常規(guī)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上增加了能與擴(kuò)增模板特異性結(jié)合的探針，與傳統(tǒng)PCR相比，該方法無(wú)需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行再處理，完全是在封閉狀態(tài)下完成檢測(cè)的全過(guò)程，具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)。本試劑盒采用TaqMan熒光探針技術(shù)，選取單純皰疹病毒II型基因編碼區(qū)的高度特特異保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，其中目的熒光探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，利用熒光PCR檢測(cè)儀可在FAM通道檢測(cè)熒光信號(hào)。同時(shí)設(shè)置了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控系統(tǒng)，用于整個(gè)核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。內(nèi)標(biāo)靶區(qū)域選取與HSV-II目標(biāo)區(qū)域一致，并在探針位置人工合成了一段寡核苷酸，設(shè)計(jì)特異性熒光探針，與任何物種均無(wú)交叉反應(yīng)，其中熒光探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)HEX，并與內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒共同組成內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系，可在VIC通道檢測(cè)熒光。對(duì)于待檢物而言，若檢測(cè)結(jié)果顯示典型的S 型熒光增長(zhǎng)曲線(xiàn)，則為陽(yáng)性標(biāo)本，反之則為陰性。通過(guò)簡(jiǎn)單易操作的核酸提取系統(tǒng)，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)運(yùn)行PCR擴(kuò)增程序，本試劑盒實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高效率、高靈敏和高特異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒II型的試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定性檢測(cè)單純皰疹病毒II型感染的試劑盒。應(yīng)用熒光 PCR的方法，對(duì)皰疹液、泌尿生殖道分泌物等樣本中的單純皰疹病毒I型DNA進(jìn)行定性檢測(cè)， 可用于單純皰疹病毒II型感染的輔助診斷，抗病毒治療的療效監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究。其基本原理是利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，以單純皰疹病毒II型基因編碼區(qū)的高度特特異保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于單純皰疹病毒II型DNA的定性檢測(cè)。另外，本試劑盒還帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用于對(duì)核酸提取的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案1)使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對(duì)已知的單純皰疹病毒II型基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件選擇并設(shè)計(jì)寡核苷酸引物和探針。由于所設(shè)計(jì)的引物和探針均具有互補(bǔ)于HSV-II基因的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒(méi)有同源性，也不包括任何常見(jiàn)的核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，所以避免了單純皰疹病毒I型檢測(cè)的假陰性和假陽(yáng)性，提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度。同時(shí)設(shè)置了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控系統(tǒng)，用于整個(gè)反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。內(nèi)標(biāo)靶區(qū)域選取與HSV-II目標(biāo)區(qū)域一致，并在探針位置人工合成了一段寡核苷酸，設(shè)計(jì)特異性熒光探針，與任何物種均無(wú)交叉反應(yīng)。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物和探針，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化后進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’ 端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán))的6-FAM amidite和HEX，并在其3’端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)上作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的BHQ1。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。 然后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)適宜于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系包括熱啟動(dòng)Taq酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、能夠與內(nèi)標(biāo)核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。同時(shí)設(shè)置了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控系統(tǒng)，用于整個(gè)核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。4)從待測(cè)樣本中提取核酸DNA，分別加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)PCR擴(kuò)增，從熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)對(duì)未知樣本的核酸DNA進(jìn)行定性檢測(cè)?；谝陨霞夹g(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括(1)核酸提取試劑、HSV-II反應(yīng)液A、 HSV-II反應(yīng)液B、HSV-II內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，和( 分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中PCR反應(yīng)體系包括HSV-II反應(yīng)液A和 HSV-II反應(yīng)液B。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中HSV-II反應(yīng)液A(引物探針混合液)由正向引物、反向引物、目的寡核苷酸探針、內(nèi)標(biāo)寡核苷酸探針和PCR反應(yīng)緩沖液組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物分別是5’ -GTCAGCCCATCCTCCTTCG-3，(SEQ ID NO :1)禾口 5，-GGGAAGCATTTACGAGAGCG-3，(SEQ ID NO 2)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的寡核苷酸探針是 5，-X-CGACACCCTCCATACTGCCGAAG-Y-3，(SEQ ID NO :3)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團(tuán)，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物探針濃度均為5 15pmol/人份，優(yōu)選引物濃度為IOpmol/人份、探針濃度為5pmol/人份。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，引物探針混合液中用于內(nèi)標(biāo)多核苷酸擴(kuò)增的寡核苷酸探針是 5，-X-CCTGCTCTGACTCTGACCATCCCTG-Y-3，(SEQ ID NO :4)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團(tuán)，包括能夠與內(nèi)標(biāo)多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于引物探針混合液中用于內(nèi)標(biāo)多核苷酸擴(kuò)增的探針濃度為3 IOpmol/人份，優(yōu)選探針濃度為5pmol/人份。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，HSV-II反應(yīng)液B由熱啟動(dòng)Taq酶、dNTPs、酶稀釋液組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于熱啟動(dòng)Taq酶用量為3 7U/ 人份、dNTPs濃度為0. 20mmol/L,酶稀釋液為一般市售的酶稀釋液。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，HSV-II反應(yīng)液A包括PCR反應(yīng)緩沖液，其中 PCR 反應(yīng)緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 8)、50mmol/L KC1、3. Ommol/L MgCl20根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，陰性質(zhì)控品為生理鹽水，HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品和HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品均為含有HSV-2病毒株，且濃度分別為5. OX IO6和5. OX IO3IU/ ml ο根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為95°C 15min，l個(gè)循環(huán)；最后94°C 15s，55°C 45s，40個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒的待檢樣品是泌尿生殖道分泌物、 生殖道刮片等。本發(fā)明提供的PCR試劑盒可以檢測(cè)出單純皰疹病毒II型的靈敏度為lOOcopies/ ml，說(shuō)明本試劑盒具有非常好的靈敏度。本發(fā)明針對(duì)單純皰疹病毒II型基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，檢測(cè)的線(xiàn)性范圍為 2. 5X102COpies/ml-1.0X108COpies/ml，與同種屬、感染部位相同或感染癥狀相似的其他病毒(單純皰疹病毒I型、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒等)無(wú)交叉反應(yīng)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)全封閉反應(yīng)，提取DNA以后，直接用于PCR檢測(cè)，避免了污染發(fā)生。(2)試劑盒帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可以用于對(duì)核酸提取和PCR擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控， 從而減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。(3)使用熱啟動(dòng)Taq酶，防止低溫非特異性擴(kuò)增，使得試劑盒的靈敏度提高。(4)相對(duì)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法可以快速檢測(cè)樣本中核酸DNA。


圖1顯示HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果。HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品FAM檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，呈典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，且強(qiáng)陽(yáng)性和臨界陽(yáng)性質(zhì)控品的定值分別在 1. OX 106-5. OX 107copies/ml 和 5· 0X 102_5· 0X 104copies/ml 范圍內(nèi)，可明確判定為陽(yáng)性。 陰性質(zhì)控品FAM檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線(xiàn)無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，VIC檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線(xiàn)為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；可明確判定為陰性，均符合質(zhì)量控制判斷標(biāo)準(zhǔn)。圖2顯示HSV-II特異性的檢測(cè)結(jié)果。10份特異性參考品的擴(kuò)增曲線(xiàn)平直或斜向下且與基線(xiàn)無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性。特異性樣本包括單純皰疹病毒1型 (HSV-I)，水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，人巨細(xì)胞病毒(CMV)，EB病毒等其他病原微生物標(biāo)本。圖3顯示最小檢出量參考品的檢測(cè)結(jié)果。最小檢出量參考品共4份，標(biāo)號(hào)分別為 L1-L4，將HSV-2病毒液提取核酸后測(cè)定OD值標(biāo)定其拷貝數(shù)，將已標(biāo)定的HSV-2病毒液依次稀釋至 1 X 105copies/ml、1 X 104copies/ml、1 X 103copies/ml、2. 5 X 102copies/ml 作為線(xiàn)性參考品，編號(hào)L1-L4。以制備的L1-L4為待檢樣本進(jìn)行檢測(cè)。圖4顯示8份HSV-II陽(yáng)性患者樣本的檢測(cè)結(jié)果。8個(gè)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，均能夠判定為陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 單純皰疹病毒II型試劑盒的檢測(cè)方法(1)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存標(biāo)本采集1.男性生殖泌尿道分泌物棉拭子用細(xì)小棉拭子伸入尿道約2 4厘米，捻動(dòng)拭子采集分泌物，將棉拭子置入無(wú)菌玻璃管，密閉送檢(采集分泌物前2小時(shí)禁小便)。2.女性生殖道分泌物棉拭子用無(wú)菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物，再用無(wú)菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒鐘后旋動(dòng)棉拭子采集宮頸分泌物，將棉拭子置入無(wú)菌玻璃管，密閉送檢。3.女性尿道分泌物棉拭子用無(wú)菌生理鹽水棉球洗凈尿道口，再用無(wú)菌棉拭子插入尿道約2厘米，捻動(dòng)拭子采集分泌物，將棉拭子置入無(wú)菌玻璃管，密閉送檢。4.尿道口或患病部位刮片用刮片刮取宮頸病灶處脫落細(xì)胞，置入無(wú)菌玻璃管， 密閉送檢。標(biāo)本保存和運(yùn)送所采集的標(biāo)本可立即用于測(cè)試或長(zhǎng)期保存于-70°C，-20°C保存期為6個(gè)月，標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)送采用0°C冰壺。(2)核酸提取將待測(cè)樣本與陰性質(zhì)控品、HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。a).在1. 5ml的無(wú)菌離心管內(nèi)加入50 μ 1的蛋白酶K ；b).取樣本200 μ 1加入離心管中；c).再加入200 μ 1的裂解工作液(即已含Carrier RNA的病毒裂解液)，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15秒以充分混勻，高速離心10秒(防止溫育時(shí)產(chǎn)生氣泡)，72°C 10分鐘。同時(shí)可將洗脫液置于72°C預(yù)熱；d).再加入250 μ 1無(wú)水乙醇，蓋緊管蓋，振蕩15秒；e).將混合液全部吸至離心柱，室溫下12，OOOrpm離心1分鐘，將離心柱裝至新的
收集管；f).將500 μ 1的抑制物去除液加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心1分鐘，將離心
柱裝至新的收集管；g).將500 μ 1的去離子液加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心1分鐘，將離心柱裝
至新的收集管；h).再次將500 μ 1的去離子液加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心1分鐘，將離心
柱裝至新的收集管；i).將離心柱-收集管于室溫下14，OOOrpm離心3分鐘以除去殘余的乙醇；j).將離心柱取出，放置于新的1. 5ml離心管。打開(kāi)離心柱蓋子，72°C放置2分鐘 (使用干式恒溫器，不能使用水浴鍋)；
k).在離心柱的膜的正上方小心加入72°C預(yù)熱的洗脫液50 μ 1，蓋緊離心柱管蓋， 室溫靜置1分鐘后，14，OOOrpm離心1分鐘。離心管內(nèi)即為病毒核酸溶液，建議立即使用，如需保存，置于_20°C。(3) PCR 檢測(cè)a)配制體系將27 μ 1 HSV-II反應(yīng)液Α，3 μ 1 HSV-II反應(yīng)液B，充分混合，然后分裝30 μ 1至每個(gè)PCR反應(yīng)管。b)加樣往上述HSV-II反應(yīng)管中分別加入提取后的待測(cè)樣本核酸、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品核酸和臨界陽(yáng)性質(zhì)控品核酸20μ 1。蓋緊管蓋，8，OOOrpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增儀。c)擴(kuò)增程序設(shè)置ΑΒΙ7300/7500熒光PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下Reporter Dyel :FAMQuencher Dye :noneReporter Dye2 :VICQuencher Dye :nonePassive Reference :noneLightCycler480熒光PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下“Customizes”模塊中選擇 FAM083-533)和 VIC(523-568)濾片組合，擴(kuò)增溫度參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置如下50 "C 15 分鐘；95 "C 15 分鐘；40個(gè)循環(huán)(94°C 15秒一55°C 45秒)，熒光檢測(cè)選擇在55°C 45秒這一環(huán)節(jié)；保存文件，運(yùn)行。(4)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Basel ine的Mart值、End值以及 Threshold值(用戶(hù)可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Mart值可以在3 15、End值可設(shè)在5 20，在Log圖譜窗口設(shè)置Threshold的Value值，使基線(xiàn)位于擴(kuò)增曲線(xiàn)指數(shù)期，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線(xiàn)平直或低于閾值線(xiàn))，點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲得分析結(jié)果，在Iteport界面察看結(jié)果，記錄未知樣本數(shù)值(C)。(5)結(jié)果判定如果FAM檢測(cè)通道無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，且在VIC檢測(cè)通道有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，則判樣品為單純皰瘡病毒II型陰性。如果FAM，VIC檢測(cè)通道均有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且FAM檢測(cè)通道Ct值彡40 ；或FAM檢測(cè)通道有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且Ct值彡40，VIC檢測(cè)通道無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，則判樣品為單純皰瘡病毒II 型陽(yáng)性。實(shí)施例2 單純皰疹病毒II型試劑盒中質(zhì)控品的使用單純皰疹病毒II型試劑盒中質(zhì)控品包括HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品，HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品，用于臨床試驗(yàn)中質(zhì)量控制，操作方法同待檢樣本。陰性質(zhì)控品FAM檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線(xiàn)無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，VIC檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線(xiàn)為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；強(qiáng)界陽(yáng)性質(zhì)控品FAM檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，且FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線(xiàn)Ct值< 33 ； 臨界陽(yáng)性質(zhì)控品FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，且FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線(xiàn)Ct值< 37 ；以上要求須在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足，否則，本次實(shí)驗(yàn)視作無(wú)效，需重新進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)附圖1)陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線(xiàn)不呈S型，陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線(xiàn)為明顯S型曲線(xiàn)，陰、陽(yáng)性質(zhì)控品均符合試劑盒的質(zhì)控要求，因此待檢標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果是有效的。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒II型的試劑盒，試劑盒包括(1)核酸提取試劑、 HSV-II反應(yīng)液A、HSV-II反應(yīng)液B、HSV-II內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、HSV-II強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、 HSV-II臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中PCR反應(yīng)體系包括HSV-II反應(yīng)液A和HSV-II反應(yīng)液B，其特征在于HSV-II反應(yīng)液A中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物分別是5，-GTCAGCCCATCCTCCTTCG-3’ (SEQ ID NO 1)5’ -GGGAAGCATTTACGAGAGCG-3，(SEQ ID NO 2)用于靶多核苷酸擴(kuò)增的寡核苷酸探針是5’ -X-CGACACCCTCCATACTGCCGAAG-Y-3’ (SEQ ID NO 3)其中X/Y表示熒光標(biāo)記基團(tuán)，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針；用于內(nèi)標(biāo)多核苷酸擴(kuò)增的寡核苷酸探針是5’-X-CCTGCTCTGACTCTGACCATCCCTG-Y-3’ (S EQ ID NO :4)，其中Χ/Υ表示熒光標(biāo)記基團(tuán)，包括能夠與內(nèi)標(biāo)多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于正、反向引物的濃度均為IOpmol/人份，目的寡核苷酸探針、內(nèi)標(biāo)寡核苷酸探針的濃度均為5pmol/人份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，HSV-II反應(yīng)液B由熱啟動(dòng)Taq酶、dNTPs、酶稀釋液組成， 其中熱啟動(dòng)Taq酶用量為3 7U/人份、dNIPs濃度為0. 20mmol/L,酶稀釋液為一般市售的酶稀釋液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，HSV-II反應(yīng)液A包括PCR反應(yīng)緩沖液，其中PCR反應(yīng)緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 8)、50mmol/L KC1、3. Ommol/L MgCl20
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為 95°C 15min，l個(gè)循環(huán)；最后94°C 15s，55°C 45s，40個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒II型的試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速、定性檢測(cè)單純皰疹病毒II型感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中單純皰疹病毒II型核酸DNA進(jìn)行定性檢測(cè)，適用于單純皰疹病毒II型感染的輔助診斷，抗病毒治療的療效監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559931SQ201210014409
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者丁渭, 李明, 陳華云 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司