專利名稱：一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)融合基因E2A-PBX1 mRNA表達(dá)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)融合基因E2A-PBX1 mRNA表達(dá)的試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定量檢測(cè)融合基因E2A-PBX1的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)外周血或骨髓中融合基因E2A-PBX1 mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)等血液系統(tǒng)腫瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表達(dá)水平，以有利于評(píng)價(jià)患者化療效果、預(yù)后及對(duì)微小殘留病變復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。
背景技術(shù)：
E2A-PBX1基因融合是由t (I ；19) (q23 ；pl3. 3)易位而形成的，產(chǎn)生的融合蛋白含有結(jié)合到PBXl同源結(jié)構(gòu)域蛋白的DNA結(jié)合域上的E2A氨基端轉(zhuǎn)錄活化域，是急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中常見(jiàn)的染色體畸變及基因異常，大約5%的兒童ALL和3. 3%的成人ALL攜帶這種異常染色體。攜帶有該易位的病人，其臨床癥狀都比較兇險(xiǎn)。早期的研究認(rèn)為，t(l ；19)易位與治療早期的復(fù)發(fā)相關(guān)，更為強(qiáng)烈的化療能夠抵消這種效應(yīng)。最近的研究證明，治療方案的改進(jìn)已使攜帶t (I ；19)易位的兒童ALL預(yù)后極大改善，5年無(wú)白血病活存率已達(dá)89. 5%。目前常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括染色體核型分析、FISH、PCR檢測(cè)等。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴(kuò)增儀，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，并通過(guò)軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)焚光 PCR 的一種(Yuqi Z，Min Y，Johann WM，et al. 2002. Quantification ofHuman Immunodeficiency Virus Type IProviral DNA by Using TaqMan Technology. JCli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C，Seifried E，Roth WK, et al. 2001, TaqMan5_-nuclease human immunodeficiency virus type I PCR assay with phage-packagedcompetitive internal control for high-throughput blood donor screening.JClin Microbiol,39 :4302-4308 ；Schuurman R，Descamps D，Weverling GJ, et al. 1996，Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of humanimmunodeficiency virus type I RNA in plasma. J Clin Microbiol，34 :3016-3022 ;Christopherson C，Kidane Y,Conway B et al. 2000. PCR-based assay to quantify humanimmunodeficiency virus type I DNA in peripheral blood mononuclear cells. J ClinMicrobiol, 38 :630-634.)，它是一種直接快速檢測(cè)RNA的方法，與檢測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，不同之處在于前者在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時(shí)多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟；相同之處在于兩者在反應(yīng)體系中均有一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過(guò)程中探針?lè)肿又饾u被水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。本試劑盒采用TaqMan熒光探針技術(shù)，選取融合基因E2A-PBX1及內(nèi)參基因TBP為靶區(qū)域，分別設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，其中熒光探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，利用熒光PCR檢測(cè)儀可在FAM通道檢測(cè)熒光信號(hào)。由于內(nèi)參TBP基因在細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在本試劑盒中可作為內(nèi)參對(duì)起始細(xì)胞量進(jìn)行校正，用于整個(gè)核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。通過(guò)簡(jiǎn)單易操作的核酸提取系統(tǒng)，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)運(yùn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增程序，本試劑盒實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高效率、高靈敏和高特異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)融合基因E2A-PBX1的mRNA試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定量檢測(cè)融合基因E2A-PBX1 mRNA表達(dá)的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)外周血或骨髓樣本中融合基因E2A-PBX1 mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)等血液系統(tǒng)腫瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表達(dá)水平，以有利于評(píng)價(jià)患者化療效果、預(yù)后及對(duì)微小殘留病變復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。其基本原理是利用熒光PCR技術(shù)，以融合基因E2A-PBX1及內(nèi)參基因TBP為靶區(qū)域，分別設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，在樣本核酸純化之后，通過(guò)含有逆轉(zhuǎn)錄酶(c-MMLV酶)、熱啟動(dòng)Taq酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的一步法RT-PCR對(duì)E2A-PBX1基因的mRNA進(jìn)行快速定量檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案I)使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對(duì)已知的融合基因E2A-PBX1基因的核苷酸序列 進(jìn)行同源性比較，在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件選擇并設(shè)計(jì)寡核苷酸引物和探針。由于所設(shè)計(jì)的弓I物和探針均具有互補(bǔ)于E2A-PBX1基因的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒(méi)有同源性，也不包括任何常見(jiàn)的核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，所以避免了融合基因E2A-PBX1檢測(cè)的假陰性和假陽(yáng)性，提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度。同時(shí)設(shè)置了內(nèi)參TBP基因作為相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)，用于整個(gè)反應(yīng)體系的質(zhì)量控制，在本試劑盒中可作為內(nèi)參對(duì)起始細(xì)胞量進(jìn)行校正。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物和探針，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化后進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán))的6-FAM amidite，并在其3’端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)上作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的BHQ1。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20% )電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)適宜于一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng)Taq酶、2’_脫氧核苷三磷酸、RNA酶抑制劑(RNasin)、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、能夠與內(nèi)標(biāo)核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。
4)從待測(cè)樣本中提取核酸mRNA，分別加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò)增，從熒光擴(kuò)增曲線對(duì)未知樣本的核酸mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)。基于以上技術(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括(1)1 應(yīng)提取試劑424^^乂1反應(yīng)液、TBP反應(yīng)液、RT PCR酶系、E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1_4、TBP陽(yáng)性定量參考品1_4、陰性質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中PCR反應(yīng)體系包括E2A-PBX1反應(yīng)液、TBP反應(yīng)液、RT PCR酶系。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中E2A-PBX1反應(yīng)液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、PCR反應(yīng)緩沖液等組成，其特征在E2A-PBX1反應(yīng)液中正向和反向引物分別是 5’-ACCCTCCCTGACCTGTCTC-3’ (SEQ ID NO :I)和 5’ -GCCTTCCGCTAACAGCATG-3’ (SEQID NO 2)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于E2A-PBX1反應(yīng)液中寡核苷酸探針是 5，-X-ACTCAAAACACTGTAGGAGTCGGGAGG-Y-3’ (SEQ ID NO :3)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物探針濃度均為2 IOpmol/人份,優(yōu)選引物濃度為5pmol/人份、探針濃度為2. 5pmol/人份。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中TBP反應(yīng)液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、PCR反應(yīng)緩沖液等組成，其特征在于用于TBP反應(yīng)液中正向和反向弓I物分別是5’ -CGTGGCTCTCTTATCCTCATGA-3’ (SEQ ID NO 4)和 5’ -GCCCGAAACGCCGAATATA-3’ (SEQ IDNO 5),寡核苷酸探針是 5’ -X-CCGCAGCAAACCGCTTGGG-Y-3’ (SEQ ID NO :6)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團(tuán)。以上引物探針濃度均為2 IOpmol/人份，優(yōu)選引物濃度為5pmol/人份、探針濃度為2. 5pmol/人份。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，RT PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶(c-MMLV酶)、熱啟動(dòng)Taq酶、RNasin> dNTPs、酶稀釋液組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其特征還在于c-MMLV酶用量為I. 5 3. 5U/人份、熱啟動(dòng)Taq酶用量為3 7U/人份、RNasin用量為15 25U/人份、dNTPs濃度為
O.20mmol/L，酶稀釋液為一般市售的酶稀釋液。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，E2A-PBX1反應(yīng)液和TBP反應(yīng)液中的PCR緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· O)、50mmol/L KC1、3. Ommol/L MgCl20根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，陰性質(zhì)控品為DEPC水，E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1-4均為含有E2A-PBX1目的片段的重組質(zhì)粒，濃度為2 X IO6Copies/μ 1-2 X IO3Copies/μ I ；ΤΒΡ陽(yáng)性定量參考品1-4均為含有TBP目的片段的重組質(zhì)粒，濃度為2Χ IO6Copies/μ 1-2X IO3Copies/μ I ;質(zhì)粒均由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為50°C逆轉(zhuǎn)錄 15min，l 個(gè)循環(huán)；95°C 15min，I 個(gè)循環(huán)；最后 94°C 15s，55°C 45s，40 個(gè)循環(huán)收集突光信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒的待檢樣品是外周血或骨髓。本發(fā)明提供的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒可以檢測(cè)出融合基因E2A-PBX1的靈敏度為50COpies/l·! 1，說(shuō)明本試劑盒具有非常好的靈敏度。
本發(fā)明針對(duì)融合基因E2A-PBX1基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，檢測(cè)的線性范圍為I X IO8Copies/ μ 1-1 X IO3Copies/ μ I。特別值得說(shuō)明的是，為了確保本發(fā)明的基因mRNA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，我們還使用攜帶有基因(cDNA)序列的重組質(zhì)粒作為DNA陽(yáng)性定量參考品。借助這些額外標(biāo)準(zhǔn)品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行平行檢測(cè)并制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測(cè)的傳統(tǒng)PCR試劑盒不同，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒可以在擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程中隨時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度。眾所周知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增體系中，同時(shí)加入引物和5’、3’末端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(例如6-FAM amidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(tuán)(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒(méi)有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，其序列保持完整，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)將被淬滅基團(tuán)吸收，所以沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生；而當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，DNA聚合酶的5’ -3’外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，因而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈即有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知靶多核苷酸(模板)進(jìn)行定量分析。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，并以如上測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從基于平行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，然后計(jì)算出該靶多核苷酸的起始拷貝數(shù)(當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)達(dá)到Ct值即初始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一靶多核苷酸在不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間在不同管內(nèi)擴(kuò)增所得到的Ct值總是恒定的)。也就是說(shuō)，基于上述的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多核苷酸的量(起始拷貝數(shù))。具體實(shí)現(xiàn)包括(I)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)通過(guò)檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)等血液系統(tǒng)腫瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表達(dá)水平，有利于評(píng)價(jià)患者化療效果、預(yù)后及對(duì)微小殘留病變復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。(2)全封閉反應(yīng)，提取RNA以后，直接用于RT-PCR檢測(cè)，避免了污染發(fā)生。(3)由于內(nèi)參基因TBP在細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，因此，本試劑盒中選擇TBP作為內(nèi)參對(duì)起始細(xì)胞量進(jìn)行校正，用于整個(gè)核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。(4)同時(shí)使用攜帶有E2A-PBX1基因和內(nèi)參TBP基因序列的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性定量參考品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行相對(duì)定量的平行檢測(cè)，從而確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。


圖I顯示E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1_4、陰性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果。E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1-4有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，曲線呈S型曲線，Ct值< 37，且R2 ^ O. 97 ;可明確判定為陽(yáng)性，陰性質(zhì)控品的E2A-PBX1及TBP無(wú)熒光信號(hào)增長(zhǎng)，無(wú)明顯S形擴(kuò)增曲線，可明確判定為陰性。檢測(cè)結(jié)果均符合質(zhì)量控制判斷標(biāo)準(zhǔn)。
圖2顯示TBP陽(yáng)性定量參考品1-4和陰性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果TBP陽(yáng)性定量參考品1-4有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，曲線呈S型曲線，Ct值< 37，且R2彡O. 97 ;可明確判定為陽(yáng)性，陰性質(zhì)控品的E2A-PBX1及TBP無(wú)熒光信號(hào)增長(zhǎng)，無(wú)明顯S形擴(kuò)增曲線，可明確判定為陰性。檢測(cè)結(jié)果均符合質(zhì)量控制判斷標(biāo)準(zhǔn)。圖3顯示E2A-PBX1基因的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。針對(duì)8例包括再生障礙性貧血、巨幼細(xì)胞貧血等其他非白血病患者樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果顯示熒光擴(kuò)增曲線無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)，均可明確判為陰性。圖4顯示4份白血病患者的樣本的檢測(cè)結(jié)果。4個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是29. 41、24. 19,28. 45,32. 21，結(jié)合擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，均能夠判定為陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例I :融合基因E2A-PBX1試劑盒的檢測(cè)方法(I)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存標(biāo)本采集抽取受檢者靜脈血或骨髓3_5ml，注入含EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5 10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。標(biāo)本保存和運(yùn)送標(biāo)本最好立即用于測(cè)試，在2_8°C條件下保存不應(yīng)超過(guò)48小時(shí)；或者保存在_20±5°C待測(cè)，保存期為I個(gè)月；或者使用紅細(xì)胞裂解液處理全血或骨髓，獲得有核細(xì)胞沉淀后加入Iml RNA提取液，振蕩混勻，于-70±10°C保存I個(gè)月；避免反復(fù)凍融。樣本運(yùn)輸(TC左右。(2)核酸提取I).在5 X紅細(xì)胞裂解液瓶中加入24ml的無(wú)菌純化水稀釋成I X紅細(xì)胞裂解液；2).取5ml潔凈離心管，加入抗凝血2ml ；3).加入2ml IX紅細(xì)胞裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15秒以充分混勻，室溫放置3分鐘；4).室溫下,6000rpm離心5分鐘,去上清,保留沉淀；5).重復(fù)步驟3 4 一次，盡可能吸除殘存液體；6).加入Iml RNA提取液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15秒以充分混勻，再將其轉(zhuǎn)移至
I.5ml離心管并靜置5分鐘；7).加入200 μ I氯仿，蓋緊管蓋，用力上下振搖15秒(小心液體泄漏，有腐蝕性)，靜置3分鐘(15-30°0，41下12，00011)111離心15分鐘，離心后反應(yīng)管分三層，底層(酚-氯仿層)，中間層及無(wú)色水相上層。8).小心吸取400ul上層水相(勿吸出中間層及管壁上的白色絮狀物)，轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，加入500ul異丙醇，蓋緊管蓋，上下顛倒3次，靜置10分鐘(15-30°C )。然后4°C，12，OOOrpm離心10分鐘(注意固定離心管方向)，離心前通?？床灰?jiàn)RNA沉淀，離心后可見(jiàn)白色膠狀沉淀，去上清。
9) ·加入Iml 75%的乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，4°C，12，OOOrpm離心5分鐘(注意
固定離心管方向)，小心吸去大部分乙醇。短暫離心，再吸去剩余乙醇。將沉淀在室溫空氣中干燥5分鐘(打開離心管蓋)以使痕量乙醇揮發(fā)(但過(guò)度干燥可能使RNA沉淀難以溶解)。10).用50 μ I DEPC H2O溶解沉淀，室溫靜置2分鐘。RNA溶液可立即進(jìn)行PCR或存于-70土 10°C備用。提取后的核酸RNA溶液建議立即使用，如需保存，置于-70± 10°C。(3) PCR 檢測(cè)a)配制體系E2A-PBX1反應(yīng)體系將3 μ I RT PCR酶系Α，17 μ I Ε2Α-ΡΒΧ1反應(yīng)液，充分混合，然后分裝20 μ I至每個(gè)PCR反應(yīng)管。
TBP反應(yīng)體系將3μ I RT PCR酶系Α，17 μ I TBP反應(yīng)液，充分混合，然后分裝20 μ I至每個(gè)PCR反應(yīng)管。b)加樣往上述E2A-PBX1及TBP反應(yīng)管中分別加入提取后的待測(cè)樣本核酸、直接加入陰性質(zhì)控品和分別加入對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性定量參考品5μ I。蓋緊管蓋，8，OOOrpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增儀。c)擴(kuò)增程序設(shè)置ABI7300/7500熒光PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下Reporter Dyel FAMQuencher Dye nonePassive Reference noneLightCycler480熒光PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下“Customizes”模塊中選擇 FAM(483-533)濾片，擴(kuò)增溫度參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置如下50 0C 15 分鐘；950C 15分鐘；40個(gè)循環(huán)(94°C 15秒一55°C 45秒)，熒光檢測(cè)選擇在55°C 45秒這一環(huán)節(jié)；保存文件，運(yùn)行。d)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置E2A-PBX1的4個(gè)陽(yáng)性定量參考品(Task中設(shè)為Standard,Quantity中設(shè)為對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù))。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,start值可以在I 10、stop值可以在5 20、Threshold值可以在5K 50K范圍選擇)，使“Standard curve”窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳，即R2值(correlation數(shù)值)彡0. 97。最后到“Report”窗口下記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的E2A-PBX1未知標(biāo)本的拷貝數(shù)(E2A-PBX1-Qty)，將該結(jié)果導(dǎo)出。重新按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置TBP的4個(gè)陽(yáng)性定量參考品，步驟同前，將TBP未知標(biāo)本的拷貝數(shù)(TBP-Qty)導(dǎo)出。(4)結(jié)果判定如果增長(zhǎng)曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判所檢測(cè)的基因表達(dá)量小于檢測(cè)限度。
如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且TBP的Ct值< 35，則樣品的E2A-PBX1/TBP表達(dá)量為(E2A-PBX1-Qty/TBP-Qty)。實(shí)施例2 :融合基因E2A-PBX1試劑盒中陽(yáng)性定量參考品及質(zhì)控品的使用融合基因E2A-PBX1試劑盒中陽(yáng)性定量參考品及質(zhì)控品包括E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1-4，TBP陽(yáng)性定量參考品1-4和陰性質(zhì)控品，用于臨床試驗(yàn)中質(zhì)量控制。陰性質(zhì)控品E2A-PBX1及TBP無(wú)熒光信號(hào)增長(zhǎng)，無(wú)明顯S形擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性定量參考品E2A-PBX1及TBP有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，曲線呈S型曲線，Ct值< 37，且 R2 彡 O. 97。
未知標(biāo)本的TBP的Ct值必須< 35。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)附圖I和圖2):陰性質(zhì)控品的E2A-PBX1及TBP均無(wú)熒光信號(hào)增長(zhǎng)；E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1-4 FAM檢測(cè)通路有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，曲線呈S型曲線，Ct值< 37，且R2彡O. 97 ；TBP陽(yáng)性定量參考品1-4FAM檢測(cè)通路有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，曲線呈S型曲線，Ct值< 37，且R2 ^ O. 97 ;均符合試劑盒的質(zhì)控要求，因此待檢標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果是有效的。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)融合基因E2A-PBX1 mRNA表達(dá)的試劑盒，試劑盒包括(I)RNA提取試劑、E2A-PBX1反應(yīng)液、TBP反應(yīng)液、RT PCR酶系、E2A-PBX1陽(yáng)性定量參考品1_4、TBP陽(yáng)性定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中PCR反應(yīng)體系包括E2A-PBX1反應(yīng)液、TBP反應(yīng)液和RT PCR酶系，其特征在于E2A-PBX1反應(yīng)液中正向和反向引物分別是5’ -ACCCTCCCTGACCTGTCTC-3’ (SEQ ID NO 1)5’ -GCCTTCCGCTAACAGCATG-3’ (SEQ ID NO 2) E2A-PBX1 反應(yīng)液中寡核苷酸探針是 5’ -X-ACTCAAAACACTGTAGGAGTCGGGAGG-Y-3’ (SEQID NO :3)，其中X/Y表示熒光標(biāo)記基團(tuán)；TBP反應(yīng)液中正向和反向引物分別是5’-CGTGGCTCTCTTATCCTCATGA-3’ (SEQ ID NO :4)和 5’ -GCCCGAAACGCCGAATATA-3’ (SEQ ID NO :5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于TBP反應(yīng)液中寡核苷酸探針是5’-X-CCGCAGCAAACCGCTTGGG-Y-3’ (SEQ ID NO :6)，其中 X/Y 表示熒光標(biāo)記基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于正、反向引物的濃度均為5pmol/人份，目的寡核苷酸探針、內(nèi)標(biāo)寡核苷酸探針的濃度均為2. 5pmol/人份。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，RTPCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶(c-MMLV酶)、熱啟動(dòng)Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀釋液組成，其中c-MMLV酶用量為I. 5 3. 5U/人份、熱啟動(dòng)Taq酶用量為3 7U/人份、RNasin用量為15 25U/人份、dNTPs濃度為0. 20mmol/L,酶稀釋液為一般市售的酶稀釋液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒E2A-PBX1反應(yīng)液和TBP反應(yīng)液中的PCR緩沖液包含10mmol/LTris-HCl(pH8. 0),50mmol/L KC1、3. Ommol/L MgCl20
6.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，l個(gè)循環(huán)；95°C 15min，I個(gè)循環(huán)；最后94°C 15s，55°C 45s，40個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)融合基因E2A-PBX1 mRNA表達(dá)的試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)快速、定量檢測(cè)融合基因E2A-PBX1的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)外周血或骨髓中融合基因E2A-PBX1 mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)等血液系統(tǒng)腫瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表達(dá)水平，以有利于評(píng)價(jià)患者化療效果、預(yù)后及對(duì)微小殘留病變復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102634572SQ20121001442
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者丁渭, 李明, 陳華云 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司