專利名稱：用于使所編碼蛋白的表達增加的、包含或編碼組蛋白莖-環(huán)和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷 ...的制作方法
用于使所編碼蛋白的表達增加的、包含或編碼組蛋白 莖-環(huán)和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號的核酸本申請描述了編碼核酸序列以及其用于使所編碼蛋白的表達增加的用途，所述編碼核酸序列具體地是信使RNA(mRNA)，其包含或編碼組蛋白莖-環(huán)和多聚腺甘酸(poly(A))序列或多聚腺苷酸化信號。還公開了其用于制備藥物組合物(特別是疫苗)或在基因治療中的用途，所述藥物組合物例如用于治療腫瘤和癌癥疾病、心血管疾病、傳染性疾病、自身免疫性疾病或遺傳性疾病。本發(fā)明進一步描述了體外轉(zhuǎn)錄方法、利用包含或編碼組蛋白莖-環(huán)和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號的核酸使蛋白表達增加的體外方法以及間接體內(nèi)和體內(nèi)方法。除了心血管疾病和傳染性疾病之外，腫瘤和癌癥疾病的發(fā)生是現(xiàn)代社會中最常見的死因之一，并且在大多數(shù)情況下就治療和隨后的康復措施而言與昂貴的費用相關(guān)聯(lián)。腫瘤和癌癥疾病的治療大大依賴于例如所發(fā)生腫瘤的類型、年齡、受治療患者體內(nèi)癌癥細胞的分布等。除了侵入性手術(shù)以外，現(xiàn)今通過利用放射療法或化學療法傳統(tǒng)進行癌癥治療。然而，這些傳統(tǒng)療法通常對免疫系統(tǒng)施加巨大壓力，并且在一些情況下僅能在有限程度上使用。此外，這些傳統(tǒng)療法大部分在單次治療之間需要很長的間隔期，以使得免疫系統(tǒng)能夠再生。因此，近些年已經(jīng)研究了除這些“傳統(tǒng)治療”以外的輔助方案，以避免或至少減少這些治療對免疫系統(tǒng)的影響。這種輔助治療之一具體地包括基因治療方法或基因疫苗接種，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對于治療或?qū)τ谳o助這些傳統(tǒng)療法是非常有前景的。基因治療和基因疫苗接種是分子醫(yī)學方法，其在疾病的治療和預防中已經(jīng)得以證明，并且一般對日常醫(yī)療行為表現(xiàn)出巨大作用，特別是對于治療如上所述的疾病。基因治療還用于其他醫(yī)學領(lǐng)域中，例如用于遺傳性疾病的情況中，也即由既定的基因缺陷引起并且依照孟德爾(Mendel)定律遺傳的(遺傳性)疾病。這種遺傳性疾病中最公知的代表包括粘液粘稠病(囊腫性纖維化)和鐮狀細胞性貧血以及其他疾病?；蛑委熀突蛞呙缃臃N兩種方法均基于將核酸引入 患者的細胞或組織中，并隨后對由已經(jīng)引入細胞或組織中的核酸所編碼的信息進行處理，也即期望多肽的(蛋白)表達。在基因治療方法中，通常使用DNA，盡管最近的研究進展中已知還可以使用RNA。重要的是，在所有這些基因治療方法中，mRNA用作所編碼蛋白質(zhì)序列信息的信使，無論使用DNA、病毒RNA或是mRNA。一般認為RNA是不穩(wěn)定的分子RNA酶普遍存在并且眾所周知其難于失活。而且，RNA在化學上也比DNA更不穩(wěn)定。因此，或許令人驚訝的是，真核細胞中mRNA “缺省狀態(tài)”的特征在于其相對穩(wěn)定性，并且需要特定信號加速個體mRNA的降解。該發(fā)現(xiàn)的主要原因似乎是細胞內(nèi)mRNA的降解幾乎由外切核酸酶專門催化。然而，真核mRNA的末端受到特定末端結(jié)構(gòu)以及其相關(guān)蛋白5’末端的m7GpppN CAP和通常3’末端多聚腺甘酸序列的保護，使其免受這些酶的降解。這兩種末端修飾的去除因而被認為是mRNA降解的速率限制。盡管在α -球蛋白mRNA的3’ UTR中已經(jīng)表征了穩(wěn)定元件，然而影響真核mRNA周轉(zhuǎn)的RNA序列通常通過加速脫腺苷化而作為降解的推動者(綜述于Meyer, S. , C. Temme等，(2004), CritRev Biochem Mol Biol39(4) : 197-216 中)。如上面所述，真核mRNA的5’端通常經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾，以攜帶甲基化CAP結(jié)構(gòu)，例如m7GpppN。除了在RNA剪接、穩(wěn)定和運送中發(fā)揮作用以外，CAP結(jié)構(gòu)顯著地增強翻譯起始期間40S核糖體亞單位至mRNA5’端的招募。后者的功能需要通過真核起始因子復合物eIF4F識別CAP結(jié)構(gòu)。多聚腺甘酸序列額外地通過增加40S亞單位至mRNA的招募從而另外地刺激翻譯，該作用需要多聚腺甘酸結(jié)合蛋白(PABP)的干預。最近表明PABP轉(zhuǎn)而表明與eIF4G物理相互作用，所述eIF4G是與CAP結(jié)合的eIF4F復合物的一部分。因此，假設(shè)了在經(jīng)加帽的多聚腺苷酸化mRNA上進行翻譯起始的閉環(huán)模型(Michel, Y. Μ. , D. Poncet等，(2000), JBiol Chem275(41) :32268_76)。幾乎所有的真核mRNA以這種多聚腺甘酸序列結(jié)尾，所述多聚腺甘酸序列通過普遍存在的剪切/多聚腺苷酸化機制加入到其3’端。3’端多聚腺甘酸序列的存在是真核mRNA最可識別的特性之一。剪切后，除了復制依賴型組蛋白轉(zhuǎn)錄體，大部分mRNA前體需要多聚腺苷酸化尾。在上下文中，3’端加工是一種核共轉(zhuǎn)錄過程，其促進mRNA從核運送至細胞質(zhì)，并且影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。該3’端的形成發(fā)生于由剪切/多聚腺苷酸化機制指導的兩步反應(yīng)中，并且依賴于mRNA前體(pre-mRNA)中存在的兩個序列元件高度保守的六核苷酸AAUAAA (多聚腺苷酸化信號)和下游富含G/U的序列。在第一步驟中，mRNA前體在這兩個元件之間裂解。在緊接第一步驟的第二步驟中，通過加入由200-250個腺苷酸組成的多聚腺甘酸序列，使新形成的3’端延伸，這隨后影響mRNA代謝的所有方面，包括mRNA輸出、穩(wěn)定性和翻譯(Dominski, Z.和 W. F. Marzluff (2007)，Gene396 (2) :373_90)。該規(guī)律唯一已知的例外是復制依賴型組蛋白mRNA，其末端以組蛋白莖-環(huán)代替多聚腺甘酸序列。示例性組蛋白莖-環(huán)序列描述于Lopez等，(Ddivila Lopez, Μ.,&Samuelsson, T. (2008)， RNA(New York, Ν· Y.)，14(1)，1-10. doi 10. 1261/rna. 782308.)中。組蛋白mRNA前體中的莖-環(huán)通常后接富含嘌呤的序列，其被稱為組蛋白下游元件(HDE)。這些mRNA前體在核內(nèi)通過在莖-環(huán)下游單次內(nèi)切核苷酸式剪切大約5個核苷酸而被加工，其由U7snRNP通過U7snRNA與HDE的堿基配對而催化。由于需要將新合成的DNA包裝成染色質(zhì)，組蛋白合成與細胞周期一同被調(diào)控。通過組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活化以及組蛋白mRNA水平的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控，S階段期間組蛋白的合成增力口。這可以表明組蛋白莖-環(huán)對于組蛋白表達調(diào)控的所有后轉(zhuǎn)錄步驟是關(guān)鍵的。其對于充分加工、mRNA輸出進入細胞質(zhì)中、加載到多聚核糖體上以及調(diào)控mRNA穩(wěn)定性來說是必需的。在上文中，鑒定出32kDa的蛋白，其在核和細胞質(zhì)中均在組蛋白信息的3’端處與組蛋白莖-環(huán)相連。該莖-環(huán)結(jié)合蛋白(SLBP)的表達水平受到細胞周期的調(diào)控，其在S階段期間當組蛋白mRNA水平增加時最高。SLBP對于U7snRNP對組蛋白mRNA前體進行充分的3’端加工來說是必需的。完成加工后，SLBP保持在成熟組蛋白mRNA的末端與莖-環(huán)相連，并且刺激其在細胞質(zhì)中翻譯成組蛋白(Dominski，Z.和W. F. Marzluff (2007)，Gene396 (2)373-90)。有趣的是，SLBP的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在后生動物和原生動物中都是保守的(DdvilaLopez, Μ.，&Samuelsson, T. (2008)，RNA(New York, Ν· Υ· )，14(1)，1-10. doi 10.1261/rna. 782308)，可以顯示其與組蛋白莖_環(huán)序列的結(jié)合依賴于莖_環(huán)結(jié)構(gòu)，并且最小結(jié)合位點含有至少莖-環(huán)5’端的3個核苷酸和3’端的2個核苷酸(Pandey，N. B.等，(1994)，Molecular and Cellular Biology, 14(3), 1709-1720 以及 Williams, A. S. , &Marzluff,ff. F. , (1995)，Nucleic Acids Research,23(4)，654-662.)。即使一般將組蛋白基因歸類為產(chǎn)生末端為組蛋白莖-環(huán)的mRNA的“復制依賴型”或者產(chǎn)生作為替代帶有多聚腺甘酸尾的mRNA的“替換型”，在非常罕見的情況中已經(jīng)鑒定出了在其3’端同時含有組蛋白莖-環(huán)和多聚腺甘酸或寡聚腺甘酸(oligo(A))的天然存在的mRNA。Sanchez等利用突光素酶作為報告蛋白，檢驗了非洲爪蟾(Xenopus)卵子發(fā)生期間組蛋白mRNA的組蛋白莖-環(huán)3’端附帶的天然存在的寡聚腺甘酸的作用，并發(fā)現(xiàn)寡聚腺甘酸尾是翻譯阻遏機制的活性部分，其在卵子發(fā)生期間使組蛋白mRNA沉默，其去除是組蛋白mRNA 翻譯活化機制的一部分(Sanchez, R.和 W. R Marzluff (2004)，Mol Cell Biol24(6)2513-25)。此外，已經(jīng)利用編碼標志物蛋白α -球蛋白的人工構(gòu)建體研究了在mRNA前體加工和mRNA穩(wěn)定性水平上調(diào)控復制依整型組蛋白的需要，其中利用與無內(nèi)含子的組蛋白基因相反球蛋白基因含有內(nèi)含子的事實。為此目的，制備了構(gòu)建體，其中α-球蛋白編碼序列后接組蛋白莖-環(huán)信號(組蛋白莖-環(huán)后接組蛋白下游元件)和多聚腺苷酸化信號(ffhitelaw, E.等，(1986) · N ucleic Acids Research,14(17),7059-7070. ；Pandey, N. B.,&Marzluff, ff. F. (1987). Molecular and Cellular Biology,7(12),4557-4559. ；Pandey,N. B.等，(1990). Nucleic Acids Research, 18 (11)，3161-3170)。在另一種方法中，LUscher等研究了重組組蛋白H4基因的細胞周期依賴性調(diào)控。制備了構(gòu)建體，其中H4編碼序列后接組蛋白莖-環(huán)信號和多聚腺苷酸化信號，這兩個加工信號附帶地被半乳糖激酶編碼序列分開(Liischer, B.等，(1985). Proc. Natl. Acad. Sc1.USA,82(13),4389-4393)。此外，Stauber等鑒定出了在組蛋白H4mRNA水平上賦予細胞周期調(diào)控所需的最小序列。對于這些研究，使用了包含選擇標志物黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT)編碼序列的構(gòu)建體，所述序列的前面是組蛋白莖-環(huán)信號后接多聚腺苷酸化信號(Stauber，C.等，(1986). EMBO J，5 (12)，3297-3303)。Wagner等在對組蛋白mRNA前體加工進行檢驗時，利用報告構(gòu)建體鑒定出了組蛋白mRNA前體剪切所需的因子，所述報告構(gòu)建體使EGFP置于組蛋白莖-環(huán)信號和多聚腺苷酸化信號之間使得EGFP僅在組蛋白mRNA前體加工被破壞的情況下表達(Wagner，E. J.等，(2007). Mol Cell28(4)，692-9)。需要注意的是，多聚腺苷酸化mRNA的翻譯一般需要使3’多聚腺甘酸序列位于5’CAP附近。這通過多聚腺甘酸結(jié)合蛋白與真核起始因子eIF4G之間的蛋白-蛋白相互作用而介導。關(guān)于復制依賴型組蛋白mRNA，已經(jīng)揭示了相似的機制。在上下文中，Gallie等顯示組蛋白莖-環(huán)在功能上與多聚腺甘酸序列類似之處在于其增強翻譯效率并且共依賴于5’CAP以達到有效的翻譯水平。他們顯示出組蛋白莖-環(huán)對于增強經(jīng)轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細胞中報告mRNA的翻譯是充分且必要的，但是其必須位于3’末端以發(fā)揮最佳功能。因此，與其他mRNA上的多聚腺甘酸尾類似，這些組蛋白mRNA的3’端似乎對于體內(nèi)翻譯十分關(guān)鍵，并且在功能上與多聚腺甘酸尾相似(Gallie，D. R.，Lewis, N. J.，&Marzluff, ff. F. (1996)，Nucleic Acids Research,24(10),1954-1962)。
此外，可以顯示SLBP與細胞質(zhì)組蛋白mRNA結(jié)合，并且是其翻譯所需的。即使SLBP不直接與eIF4G相互作用，組蛋白mRNA翻譯所需的結(jié)構(gòu)域與最近鑒定出的蛋白SLIPl相互作用。在進一步的步驟中，SLIPl與eIF4G相互作用并允許組蛋白mRNA環(huán)化，并且通過與多聚腺苷酸化mRNA翻譯類似的機制輔助組蛋白mRNA的有效翻譯。如上面所述，基因 治療方法一般利用DNA將編碼信息轉(zhuǎn)移至細胞中，然后編碼信息轉(zhuǎn)錄成mRNA,其攜帶mRNA的天然存在的元件,具體地是5’ CAP結(jié)構(gòu)和3’多聚腺甘酸序列，以確保所編碼的治療性蛋白的表達。然而，在很多情況下，無論使用DNA或RNA，基于將這些核酸引入患者的細胞或組織中并且隨后的由這些核酸編碼的期望多肽的表達的表達系統(tǒng)不會表現(xiàn)出可以允許進行有效治療所期望或甚至是所需的表達水平。在現(xiàn)有技術(shù)中，迄今已經(jīng)進行了使所編碼蛋白的表達產(chǎn)率增加的不同嘗試，具體地是通過在體外和/或體內(nèi)利用改進的表達系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)中一般描述的使表達增加的方法傳統(tǒng)地基于利用含有特定啟動子和相應(yīng)調(diào)控元件的表達載體或表達盒。由于這些表達載體或表達盒通常局限于特定的細胞系統(tǒng)，因此必須對這些表達系統(tǒng)進行改造，以用于不同的細胞系統(tǒng)中。接著一般將這種經(jīng)改造的表達載體或表達盒轉(zhuǎn)染到細胞中，并通常根據(jù)具體的細胞系進行處理。因此，主要優(yōu)先考慮能夠在靶細胞中通過細胞內(nèi)固有的系統(tǒng)而不依賴于特定細胞類型特異性啟動子和調(diào)控元件使所編碼蛋白表達的那些核酸分子。在上下文中，mRNA穩(wěn)定元件和增加mRNA翻譯效率的元件之間可以具有區(qū)別。編碼序列經(jīng)優(yōu)化以及一般適用于此目的的mRNA描述于申請W002/098443 (CureVac GmbH)中。例如，W002/098443描述了一般形式下穩(wěn)定并且在其編碼區(qū)中優(yōu)化翻譯的mRNA。W002/098443進一步公開了確定序列修飾的方法。W002/098443額外地描述了將mRNA序列中的腺嘌呤和尿嘧啶替換掉以使序列的鳥嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量增加的可能性。根據(jù)W002/098443，這種用于使G/C含量增加的替換和改造可以用于基因治療應(yīng)用中，還可以用于治療癌癥或傳染性疾病的基因疫苗中。在上下文中，W002/098443總體上提及的序列是用于這些修飾的堿基序列，其中經(jīng)修飾的mRNA編碼在將要待治療的患者中例如完全不或不足地或錯誤地翻譯的至少一種生物活性肽或多肽?；蛘撸琖002/098443以進行這些修飾的堿基序列提出了編碼抗原(例如腫瘤抗原或病毒抗原)的mRNA。在使所編碼蛋白的表達增加的又一種方法中，申請W02007/036366描述了長多聚腺甘酸序列(部分長于120bp)和β-球蛋白基因的至少兩個3’非翻譯區(qū)的組合對mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性的正面效應(yīng)。然而，盡管所有后面這些現(xiàn)有技術(shù)文獻已經(jīng)嘗試為基因治療方法提供非常有效的工具以及額外地改進的mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性，仍然存在相對于DNA疫苗和基于DNA的基因治療方法基于RNA的應(yīng)用穩(wěn)定性普通較低的問題。因此，本領(lǐng)域仍然需要提供改進的工具，以用于基因治療方法和基因疫苗中或者作為如上面所討論的傳統(tǒng)治療的輔助療法，例如通過進一步改善的mRNA穩(wěn)定性和/或翻譯活性，優(yōu)選基因療法。因此，本發(fā)明的目的是提供額外的和/或替代性方法以使所編碼蛋白的表達增力口，對于本領(lǐng)域已知用于治療應(yīng)用(例如基因治療和基因疫苗)中的核酸優(yōu)選通過使mRNA進一步穩(wěn)定和/或使該mRNA的翻譯效率增加。該目的由所附權(quán)利要求的主題解決。具體地，根據(jù)第一個實施方案，本發(fā)明的潛在目的由包含或編碼以下的本發(fā)明的核酸序列解決a)編碼區(qū)，優(yōu)選編碼肽或蛋白；b)至少一個組蛋白莖-環(huán)；和c)任選地多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號，優(yōu)選其用于使所編碼蛋白的表達水平增加，其中所述所編碼的蛋白優(yōu)選不是組蛋白，不是報告蛋白(例如熒光素酶、GFP、EGFP、β -半乳糖苷酶、特別是EGFP)，以及不是標志物或選擇蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT))。在上下文中，特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明第一實施方案的本發(fā)明的核酸至少部分地通過DNA或RNA合成產(chǎn)生,或者其是經(jīng)分離的核酸。本發(fā)明基于本發(fā)明人的驚人發(fā)現(xiàn)，即多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號和至少一個組蛋白莖-環(huán)的組合(盡管自然界中二者代表相互替代的機制)協(xié)同作用，這是因為該組合使蛋白表達增加至數(shù)倍于利用單個要素的任一個時觀察到的水平。無論多聚腺甘酸和組蛋白莖-環(huán)的次序如何，也無論多聚腺甘酸序列的長度如何，均可見多聚腺甘酸和至少一個組蛋白莖-環(huán)的組合的協(xié)同效應(yīng)。因此，特別優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子包含或編碼a)編碼區(qū)，優(yōu)選編碼肽或蛋白；b)至少一個組蛋白莖-環(huán)；和c)多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號，優(yōu)選其用于使所編碼蛋白的表達水平增加，其中所述所編碼蛋白優(yōu)選不是組蛋白，不是報告蛋白(例如熒光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、特別是EGFP)和/或不是標志物或選擇蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT))。在本發(fā)明第一實施方案的又一替代性方面中，本發(fā)明的核酸不包含組蛋白下游元件(HDE)。在上下文中，特別優(yōu)選本發(fā)明的核酸在5’ -至3’ -方向包含或編碼a)編碼區(qū)，優(yōu)選編碼肽或蛋白；b)至少一個組蛋白莖-環(huán)，任選地組蛋白莖-環(huán)3’端無組蛋白下游元件c)多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號。術(shù)語“組蛋白下游元件(HDE) ”是指天然存在的莖-環(huán)的3’端延伸大約15至20個核苷酸的富含嘌呤的多聚核苷酸，其代表U7snRNA的結(jié)合位點，參與將組蛋白mRNA前體加工成成熟的組蛋白mRNA。例如在海膽中，HDE是CAAGAAAGA (Dominski，Z.和ff. F. Marzluff (2007)，Gene396 (2) :373_90)。 此外，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明第一實施方案的本發(fā)明的核酸不包含內(nèi)含子。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一實施方案的本發(fā)明的核酸序列從5’至3’包含或編碼a)編碼區(qū)，優(yōu)選編碼肽或蛋白；b)多聚腺甘酸序列；和c)至少一個組蛋白莖-環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明第一實施方案的本發(fā)明的核酸序列包含任何適宜的核酸，其選自例如任何(單鏈或雙鏈)DNA，優(yōu)選但不限于例如基因組DNA、單鏈DNA分子、雙鏈DNA分子，或者其可以選自例如任何PNA (肽核酸)，或者其可以選自例如任何(單鏈或雙鏈)RNA,優(yōu)選信使RNA(mRNA),等。本發(fā)明的核酸分子還可以包含病毒RNA(vRNA)。然而,本發(fā)明的核酸序列可以不是病毒RNA或可以不含病毒RNA。更具體地，本發(fā)明的核酸序列可以不含病毒序列元件，例如病毒增強子或病毒啟動子(例如不是失活的病毒啟動子或序列元件，更具體地不因替換方法而失活)，或者其他病毒序列元件，或者病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸序列。更具體地，本發(fā)明的核酸序列可以不是逆轉(zhuǎn)錄病毒或病毒載體或者經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒或病毒載體。在任何情況下，本發(fā)明的核酸序列可以含有或不含增強子和/或啟動子序列，所述增強子和/或啟動子序列可以經(jīng)過或不經(jīng)修飾，或者可以是活化的或失活的。增強子和/或啟動子可以在植物中可表達或不可表達，和/或在真核細胞中可表達或不可表達，和/或在原核細胞中可表達或不可表達。本發(fā)明的核酸分子可以含有或不含編碼(自剪接)核酶的序列。優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子是RNA。在本發(fā)明第一實施方案的特定方面中，本發(fā)明的核酸是包含于適于進行體外轉(zhuǎn)錄的核酸中的核酸序列，尤其是適宜的體外轉(zhuǎn)錄載體(例如包含用于進行體外轉(zhuǎn)錄之特定啟動子(例如T3、T7或Sp6啟動子)的質(zhì)粒或線性核酸序列)。在本發(fā)明第一實施方案的又一個特別優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的核酸包含于適于在表達系統(tǒng)中(例如表達載體或質(zhì)粒中)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸中，所述表達系統(tǒng)尤其是原核(例如細菌，例如埃希氏大腸桿菌(E. coli))或真核(例如哺乳動物細胞(例如CHO細胞、酵母細胞或昆蟲細胞或完整的有機體(例如植物或動物))表達系統(tǒng)。術(shù)語“表達系統(tǒng)”是指適于產(chǎn)生肽、蛋白或RNA(尤其是mRNA)的系統(tǒng)(細胞培養(yǎng)物或完整的有機體)。

根據(jù)本發(fā)明第一實施方案的本發(fā)明的核酸序列包含或編碼至少一個組蛋白莖-環(huán)。在本發(fā)明的上下文中，所述組蛋白莖-環(huán)通常來源于組蛋白基因，其包含兩個相鄰的、完全或部分反向互補的序列的分子內(nèi)堿基配對，因而形成莖-環(huán)。莖-環(huán)可以出現(xiàn)于單鏈DNA中，或更常出現(xiàn)于RNA中。該結(jié)構(gòu)還被稱為發(fā)卡或發(fā)卡環(huán)，其一般由連續(xù)序列內(nèi)的莖和(末端的)環(huán)組成，其中所述莖由兩個相鄰的、完全或部分反向互補的序列形成，其被作為間隔子類別的短序列分開，構(gòu)建成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)。兩個相鄰的完全或部分反向互補的序列可以定義為例如莖-環(huán)元件莖I和莖2。當這兩個相鄰的完全或部分反向互補的序列(例如莖-環(huán)元件莖I和莖2)相互形成堿基對時形成莖-環(huán)，產(chǎn)生雙鏈核酸序列，其末端包含由連續(xù)序列上位于莖-環(huán)元件莖I和莖2之間的短序列形成的未配對的環(huán)。未配對的環(huán)因而通常表示不能與這些莖-環(huán)元件任何一個發(fā)生堿基配對的核酸區(qū)域。所得棒棒糖形狀的結(jié)構(gòu)是很多RNA 二級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵構(gòu)建區(qū)塊。因此莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的形成依賴于所得莖-環(huán)區(qū)域的穩(wěn)定性，其中首要先決條件通常是存在能夠自身回折從而形成配對雙鏈的序列。配對莖-環(huán)元件的穩(wěn)定性由長度、其含有的錯配或鼓脹(bulge)數(shù)量(少量錯配通常是可以容忍的，特別是在長的雙鏈中)以及配對區(qū)域的堿基組成所決定。在本發(fā)明的文本中，最佳的環(huán)長度是3-10個堿基，更優(yōu)選3至8個、3至7個、3至6個或者甚至更優(yōu)選4至5個堿基，最優(yōu)選4個堿基。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)權(quán)利要求1成分(b)的組蛋白莖-環(huán)序列可以不是來源于小鼠組蛋白。更具體地，組蛋白莖-環(huán)序列可以不是來源于小鼠組蛋白基因H2A614。本發(fā)明的核酸還可以既不含小鼠組蛋白莖-環(huán)序列，也不含小鼠組蛋白基因H2A614。進一步地，本發(fā)明的核酸序列可以不含莖-環(huán)加工信號，更具體地是小鼠組蛋白加工信號，最具體地可以不含小鼠莖-環(huán)加工信號H2kA614。本發(fā)明的核酸分子還可以含有至少一種哺乳動物組蛋白基因。然而，所述至少一種哺乳動物組蛋白基因可以不是W001/12824的Seq.1D No. 7。根據(jù)本發(fā)明第一實施方案的一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸序列包含或編碼至少一個組蛋白莖-環(huán)序列，優(yōu)選根據(jù)以下式(I)或(II)的至少一個式⑴(無莖邊緣元件的莖-環(huán)序列)
權(quán)利要求
1.核酸序列，其包含或編碼 a)編碼區(qū)，優(yōu)選編碼肽或蛋白；前提是所述編碼區(qū)不編碼組蛋白、選自EGFP和熒光素酶的報告蛋白以及選自α-球蛋白、半乳糖激酶和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT)的標志物或選擇蛋白， b)至少一個組蛋白莖-環(huán)，和 c)多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸不含選自以下的一種、或兩種、或至少一種、或除一種以外的所有、或所有的成分編碼核酶(優(yōu)選自剪接核酶)的序列、病毒核酸序列、組蛋白莖-環(huán)加工信號具體地是來源于小鼠組蛋白H2A614基因的組蛋白莖-環(huán)加工序列、Neo基因、失活的啟動子序列以及失活的增強子序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸，其中所述核酸不含核酶，優(yōu)選自剪接核酶，以及選自以下的一種Neo基因、失活的啟動子序列、失活的增強子序列、組蛋白莖-環(huán)加工信號具體地是來自于小鼠組蛋白H2A614基因的組蛋白莖-環(huán)加工序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的核酸，其中所述核酸是RNA，優(yōu)選是mRNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的核酸，其中所述至少一個組蛋白莖-環(huán)選自以下式(I)或(II) 式(I)(無莖邊緣元件的莖-環(huán)序列)
6.根據(jù)權(quán)利要求5的核酸，其中所述至少一個組蛋白莖-環(huán)選自以下式(Ia)或(IIa)中的至少一種
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的核酸，其中所述多聚腺甘酸序列包含大約25至大約400個腺苷核苷酸的序列，優(yōu)選大約50至大約400個腺苷核苷酸的序列，更優(yōu)選大約50至大約300個腺苷核苷酸的序列，甚至更優(yōu)選大約50至大約250個腺苷核苷酸的序列,最優(yōu)選大約60至大約250個腺苷核苷酸的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的核酸，其中所述多聚腺苷酸化信號包含共有序列NNUANA,優(yōu)選 AAUAAA 或 AUUAAA。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的核酸，其中所述核酸編碼治療活性蛋白或肽、佐劑蛋白、抗原、腫瘤抗原、病原性抗原、動物抗原、病毒抗原、原生動物抗原、細菌抗原、過敏性抗原、自身免疫抗原、過敏原、抗體、免疫刺激性蛋白或肽、或者抗原特異性T細胞受體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的核酸，其中所述核酸是單順反子、雙順反子或甚至多順反子核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項的核酸用于使所編碼的肽或蛋白的表達水平增加的用途。
12.用作藥物的根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所定義的核酸。
13.藥物組合物，其包含如根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所定義的核酸以及任選的藥學上可接受的載體。
14.疫苗，其包含編碼抗原的或包含抗原的根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項的核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗，其中所述抗原選自腫瘤抗原、過敏性抗原、自身免疫性自體抗原、病原性抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、動物抗原、或過敏性抗原。
16.如根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所定義的核酸在癌癥或腫瘤疾病，傳染性染病、優(yōu)選(病毒、細菌或原生動物)傳染性疾病，自身免疫性疾病，過敏或過敏性疾病，單基因疾病即(遺傳性)疾病或一般的基因疾病，具有基因遺傳背景以及通常由明確的基因缺陷引起并且依照孟德爾定律遺傳的疾病，心血管疾病，神經(jīng)疾病，呼吸系統(tǒng)疾病，消化系統(tǒng)疾病，皮膚疾病，肌骨骼病癥，結(jié)締組織病癥，瘤，免疫缺陷，內(nèi)分必疾病，營養(yǎng)和代謝疾病，眼部疾部或耳部疾病的治療中用于使蛋白表達增加的用途。
17.用于使蛋白表達增加的體外或離體方法，其包括步驟 a)提供如根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所定義的核酸， b)將核酸應(yīng)用或施用至無細胞的表達系統(tǒng)、細胞(例如表達宿主細胞或體細胞)、組織或有機體。
全文摘要
本申請描述了編碼核酸序列以及其用于使所編碼蛋白的表達增加的用途，所述核酸序列具體地是信使RNA(mRNA)，其包含或編碼組蛋白莖-環(huán)和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號。還公開了其用于制備藥物組合物(特別是疫苗)或在基因治療中的用途，所述藥物組合物例如用于治療腫瘤和癌癥疾病、心血管疾病、傳染性疾病、自身免疫性疾病或遺傳性疾病。本發(fā)明進一步描述了體外轉(zhuǎn)錄方法、利用包含或編碼組蛋白莖-環(huán)和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信號的核酸使蛋白表達增加的體外方法以及離體和體內(nèi)方法。
文檔編號C12N15/67GK103068987SQ201180039309
公開日2013年4月24日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者安德烈亞斯·特斯, 托馬斯·施拉克, 約亨·普羅布斯特 申請人:庫瑞瓦格有限責任公司