專利名稱：來自動物的單克隆抗體的快速分離的制作方法
來自動物的單克隆抗體的快速分離
相關(guān)串請的交叉引用
本申請要求分別于2010年5月17日和2010年8月27日提交的美國臨時專利申 請第61/345，538和61/377，816號的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
發(fā)明背景技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及抗體分析和產(chǎn)生的領(lǐng)域，例如從免疫的動物發(fā)現(xiàn)抗體。更具體地， 其涉及用于識別和/或生產(chǎn)所期望的抗體或抗原結(jié)合片段的方法和組合物。其還涉及來自 任何哺乳動物以及更一般地具有導(dǎo)致可溶免疫球蛋白表達的適合的免疫響應(yīng)并且其免疫 球蛋白基因座的基因信息可得的任何動物的單克隆抗體的識別。_5] 相關(guān)領(lǐng)域描述
在過去的12年中，癌癥治療性抗體例如赫塞汀(曲妥單抗,抗Her2)、Rituxa(利 妥昔單抗，抗⑶20)、Eribitux/Vectibix (西妥昔單抗/帕尼單抗,抗EGFR)、阿瓦斯丁(抗 VEGF)和其他的開發(fā)已經(jīng)挽救了全世界數(shù)以萬計的生命?？贵w治療相對于小分子藥物提 供了不同優(yōu)點，即(i)對作用原理更好的了解；(ii)較高的特異性和較少的目標(biāo)外效果；(iii)可預(yù)計的安全性和毒理學(xué)概況。目前，在美國有超過200種抗體治療處于臨床試驗， 其中大部分用于癌癥治療。
單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)是治療性抗體開發(fā)中非常重要的方面。此外，單克隆抗體廣泛 用于多種診斷和分析目的。自35年前由Kohler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Kohler和 Milstein, 1975)以來，已經(jīng)開發(fā)了多種產(chǎn)生MAb的方法。這些方法包括經(jīng)由EB病毒的基因 重組(Traggiai等人,2004)或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Kwakkenbos等人,2010)的B細(xì) 胞永生化，通過單細(xì)胞PCR克隆V基因(Wrammert等人,2008 ;Mei jer等人,2008)和經(jīng)由重 組抗體文庫的展示和刪選的體外發(fā)現(xiàn)的方法(Clackson等人，1991 ;Feldhaus等人,2003 ； Harvey 等人，2004 ；Schaff itzel 等人，1999 ；Hosse 等人，2006 ；Mazor 等人，2007 ；Zahnd 等 人,2007 ;Kretzschmar和von Ruden, 2002)。用于抗體發(fā)現(xiàn)的體外和體內(nèi)方法都關(guān)鍵取決 于確定抗原特異性的高通量篩選。近來，使用用于抗原特異性B細(xì)胞的高通量確定的軟光 刻的微雕技術(shù)已經(jīng)加速了B細(xì)胞分析，然而，這是以歸因于對抗體V基因擴增和細(xì)胞擴增的 需要的可觀的技術(shù)復(fù)雜性為代價的(Jin等人，2009 ；Love等人，2006)。
相似地，體外抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)的成功取決于篩選參數(shù)，包括展示平臺的性質(zhì)、抗原濃 度、濃縮期間的結(jié)合親和力、多輪篩選(例如，淘洗或分選)以及重要地取決于合成抗體文 庫的設(shè)計和多樣性(Hoogenboom, 2005 ；Cobaugh 等人，2008 ；Persson 等人，2006)。
目前與文庫篩選系統(tǒng)例如通過淘洗分離抗體的噬菌體展示結(jié)合的展示技術(shù)的使 用具有許多顯著問題一尤其是通過文庫生產(chǎn)的一些抗體可導(dǎo)致表達它們的生物體死亡并 且因此它們不能被簡單地檢測。存在特別的問題，即當(dāng)尋找對于來自病原體的抗原的特異 的可能與宿主表達系統(tǒng)(例如大腸桿菌(E. coli))生產(chǎn)的抗體同源的抗體時，重要的抗體 不能被表達時。使用大腸桿菌表達人類抗體文庫同樣受困于密碼子選擇的問題一人類特定氨基酸所使用的密碼子常常不是大腸桿菌或其他宿主系統(tǒng)中相同氨基酸的最佳密碼子。這意味著重要的抗體不能(或至少不能以足夠的量)被表達，因為其序列中的密碼子在大腸桿菌中高度失效導(dǎo)致在大腸桿菌中不能通讀并且全長表達?？贵w文庫的密碼子最佳化明顯不是可選的，因為文庫首先必須被測序，其使得使用文庫的主要優(yōu)點落空。有對于識別控制疾病上表現(xiàn)出有益效果的生物學(xué)相關(guān)抗體的急迫需要。哺乳動物將抗體(體液)免疫反應(yīng)針對抗傳染原、毒素或癌細(xì)胞?；疾〉膫€體產(chǎn)生識別疾病原的循環(huán)抗體并且在某些實例中(例如在從感染恢復(fù)的患者中或者在處于緩解和中的癌癥患者中)，這些抗體在恢復(fù)和治療中起到關(guān)鍵作用。目前沒有可獲得的識別血液中的循環(huán)抗體并且產(chǎn)生對疾病原特異性的并且具有治療效果的抗體的方法。另一方面，來自不同動物物種的單克隆抗體的分離對于治療學(xué)和診斷學(xué)的發(fā)展很有價值。分離單克隆抗體的現(xiàn)有方法的主要局限在于它們的應(yīng)用限于非常小數(shù)目的物種。與小鼠和人類相比，不同物種已經(jīng)進化出了不同的使它們的抗體譜變化的不同方法并且因此可產(chǎn)生識別抗原上不同表位或者顯示對特定抗原非常高的親和力的抗體。例如，本領(lǐng)域中熟知的是來自兔類的抗體通常展示比從小鼠生產(chǎn)的那些高得多的親和性。目前使用雜交瘤技術(shù)從特定物種生產(chǎn)單克隆抗體需要將B細(xì)胞通過與來自該物種的骨髓瘤融合而永生化成。發(fā)育這些骨髓瘤細(xì)胞系是困難并且費時的并且因此僅存在于小鼠、靈長類、兔和綿羊?？蛇x擇地，研究者已經(jīng)試圖通過將小鼠骨髓瘤細(xì)胞系與來自其自體骨髓瘤細(xì)胞系不可獲得的動物的B細(xì)胞融合產(chǎn)生種間雜交瘤。然而，種間雜種以非常低的效率產(chǎn)生并且不穩(wěn)定，在幾代之后停止產(chǎn)生單克隆抗體。因此，目前從具有適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍紫到y(tǒng)的動物中的絕大多數(shù)產(chǎn)生單克隆抗體是主要挑戰(zhàn)。而且，即使是對于可產(chǎn)生穩(wěn)定的B細(xì)胞融合的物種(兔、小鼠、綿羊和靈長類)，使用雜交瘤技術(shù)分離單克隆抗體是動物處死之后需要2-6個月的長期過程。可選擇地，單克隆抗體可從來自免疫動物的免疫球蛋白譜的可變(V)鏈的巨大的文庫體外分離并且之后通過不同的展示方法例如噬菌體展示、酵母展示或細(xì)菌展示來篩選這些文庫。這些方法的使用再一次受限于其免疫球蛋白譜的全面信息可得的幾個物種，即小鼠、靈長類和兔。這是因為免疫球蛋白譜的克隆需要能夠獲得能夠?qū)⒔?jīng)由無性系重組機制在該動物產(chǎn)生的免疫球蛋白可變區(qū)的大部分優(yōu)選地全部擴增的成套的寡核苷酸引物。其反過來需要在特定物種中表達的免疫球蛋白的序列的全面信息并且其對于具有編碼抗體的體液免疫系統(tǒng)的動物中的大部分來說都是不可得的。此外，不知道通過組合文庫篩選分離的抗體是否對應(yīng)于已經(jīng)通過免疫系統(tǒng)擴增并且在動物中大量生產(chǎn)的那些。明顯地，所有這些技術(shù)在某種程度上是復(fù)雜的、有困難的并且費時的。因此，還有對開發(fā)用于識別抗原特異性抗體或直接來自患者或任何動物的單克隆抗體的更有效和精確的方法的需要。發(fā)明概述本發(fā)明的方面通過提供確定血清抗體序列或識別來自血清、B細(xì)胞或直接來自淋巴組織或來自分離的B細(xì)胞的富有抗體序列的新方法來克服本領(lǐng)域中的主要缺陷。因此，在第一實施方案，提供了用于識別循環(huán)系統(tǒng)中富有抗體序列的方法，包括a)確定所受對象的含血清樣品中的抗體的VH和VL序列的至少互補決定區(qū)3 (CDR3)的氨基酸序列，以提供血清抗體序列JPb)識別相對其他血清抗體序列表現(xiàn)閾值水平豐度的抗體序列?！昂鍢悠贰币庵赴ㄈ魏窝合嚓P(guān)樣品，例如含血清樣品、血漿樣品或具有添加劑的血液樣 品。在某些方面，所確定的氨基酸序列包含完整的VH和VL區(qū)的序列。
在第二實施方案中，提供了用于產(chǎn)生一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段的方法，包 括a)獲得在所受對象的血清中存在的抗體的VH和VL區(qū)的至少CDR3的抗體氨基酸序列 的序列和豐度信息山)識別表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的那些序列；和(3)產(chǎn)生包括所確定的 富有氨基酸序列中的一種或多種的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。例如，這些抗體或抗 原片段的產(chǎn)生可包括在異源體系中的表達或體外蛋白合成的使用。
在另外的實施方案中，提供確定循環(huán)系統(tǒng)中的抗體序列的方法，包括a)獲得所 受對象的成熟B細(xì)胞中一種或多種VH和VL基因的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸、序列信息；b) 獲得來源于所受對象的血清抗體的肽的質(zhì)譜；和c)使用序列信息和質(zhì)譜確定循環(huán)系統(tǒng)中 一種或多種抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列。
在另外的實施方案中，提供產(chǎn)生抗體的方法，包括a)獲得所受對象的含血清樣 品中抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列的序列和豐度信息；和b)基于序列和豐度信息產(chǎn)生包 含血清抗體的VH和VL區(qū)的一種或多種抗體。
在某些實施方案中，同樣提供制備來自所受對象的血清抗體的包含CDR3的肽片 段的方法，包括a)獲得所受對象的成熟B細(xì)胞中的VH和VL基因的至少CDR3的核酸以及 相應(yīng)的氨基酸、序列信息山)使用序列信息選擇蛋白酶；和c)使用所述蛋白酶從所受對象 的血清抗體制備含⑶R3的肽片段。這樣的蛋白酶可基本上不剪切VH和VL肽的⑶R3。例 如，蛋白酶可在接近⑶R3區(qū)的位點剪切，產(chǎn)生基本上完整的⑶R3。
在其他方面，還提供了與B細(xì)胞中核酸信息有關(guān)的方法。例如，提供了產(chǎn)生一種或 多種抗體或抗原結(jié)合片段的方法，包括a)獲得所受對象的漿細(xì)胞群中VH和VL基因的至 少CDR3的核酸序列的序列和豐度信息；和b)識別表現(xiàn)至少閾值水平豐度的那些序列；和 c)產(chǎn)生一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段，其包含相應(yīng)于所識別的核酸序列的氨基酸序列中 的一個或多個。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)血清中存在的富有抗體序列可與B細(xì)胞尤其是來自所選擇的器官例 如骨髓的B細(xì)胞中的富有抗體基因相關(guān)聯(lián)。在另外的實施方案中，提供了識別循環(huán)系統(tǒng)中 富有抗體序列的方法，包括a)確定所受對象的漿細(xì)胞群中VH和VL基因的至少⑶R3的核 酸序列的序列和豐度信息；和《識別相應(yīng)于表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的抗體核酸序列的 那些抗體氨基酸序列，由此識別循環(huán)系統(tǒng)中的富有抗體序列。例如，所識別的抗體氨基酸序 列可以是所選擇類型的抗體例如IgG、IgM或IgA的序列。
在某些方面，確定或獲得VV基因序列(例如VH、VL)的豐度信息包括獲得來源于 相同VDJ譜系的一簇高相似性序列的豐度信息。例如，可將多個序列進行比對以確定高相 似性序列簇(例如無性系高突變的結(jié)果不同的序列)并且之后所述簇可被分級以確定簇的 普遍性。因此，在將VH和VL結(jié)構(gòu)域配對形成完整抗體V結(jié)構(gòu)域的方面中，可將屬于相似分 級簇的VH和VL結(jié)構(gòu)域配對。
在另外的實施方案中，提供了在任何動物中產(chǎn)生單克隆抗體的方法。所述方法可 以通過利用來自所受對象例如免疫的動物的免疫球蛋白DNA的高通量DNA測序以及之后用 于對免疫抗原具有特異性的單克隆抗體的識別的抗體核酸序列譜的生物信息學(xué)分析來克 服之前的局限。由此識別的抗體可以轉(zhuǎn)換類型并且無性系超突變或者可具有所選擇的抗體類型，例如人類和小鼠中的IgG或IgA或其他動物中它們的等效物。在某些實施方案中，提供了確定候選抗原特異性抗體可變區(qū)核酸序列的方法。所述方法可包括從所受對象的淋巴組織的核酸群獲得抗體可變區(qū)核酸池，優(yōu)選地?zé)o需從淋巴組織分離B細(xì)胞。所受對象可被暴露于抗原例如傳染源、免疫原或毒素?？勺儏^(qū)可至少包括⑶R3或包含⑶R1-3的全長區(qū)并且可以是可變重鏈或可變輕鏈或兩者。所述方法可包括將所受對象免疫。所述方法可進一步包括淋巴組織的分離。免疫組織分離可以是在免疫后至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或任何中間范圍。所述方法可進一步包含獲得淋巴組織的核酸群，優(yōu)選地?zé)o需從淋巴組織分離B細(xì)胞。淋巴組織可以是初級、二級或三級淋巴組織，例如骨髓、脾臟或淋巴結(jié)。所受對象可以是任何動物，例如哺乳動物、魚、兩棲動物或鳥。哺乳動物可以是人類、小鼠、靈長類、兔、綿羊或豬?？贵w可變區(qū)的核酸池可以是cDNA池。獲得核酸池可以包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶。獲得核酸池的方法例如可包括快速cDNA末端擴增(RACE)、PCR擴增或者核酸雜交。無需從淋巴組織分離B細(xì)胞，淋巴組織的核酸群可包含其他非B細(xì)胞核酸以及非抗體核酸。對于抗體序列分離，可以使用抗體特異性弓I物或探針，例如基于已知抗體恒定區(qū)cDNA序列的弓I物或探針。在可選擇的方面，核酸池可以是基因核酸池。所述方法可進一步包括確定池中抗體可變區(qū)核酸的序列和出現(xiàn)頻率。在另外的實施方案中，所述方法可包括確定富有可變區(qū)序列。在特定的實施方案中，所述方法可進一步包括確定抗體可變區(qū)核酸序列的⑶R3序列，例如通過同系物搜索。由于⑶R3是最常見的可變區(qū)，可變區(qū)序列頻率優(yōu)選地基于相應(yīng)的CDR3頻率。特別地，所選擇的可變區(qū)序列的出現(xiàn)頻率可以進一步定義為與所選擇的可變區(qū)序列具有相同或相似CDR3序列的任何可變區(qū)序列的出現(xiàn)頻率的總和。相似的⑶R3序列可以是至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%,97%,98%,99%或任何中間范圍。例如，可變區(qū)序列可以基于相同或相似⑶R3序列而分組并且每組如相同組中所有序列的頻率的和所定義的相同的頻率。在其他方面，可變區(qū)序列的頻率可以是每個不同可變區(qū)序列的頻率或者基于包含CDRl、CDR2和CDR3的全長可變區(qū)的相似性的頻率。在某些方案中，可進行富有⑶R3序列的識別，之后識別包含所識別的富有⑶R3序列的全長可變區(qū)。例如，引物或探針可以基于富有CDR3序列產(chǎn)生并且用于富集或擴增編碼富有CDR3序列的抗體可變區(qū)序列。在示例性的方面中，這些富有序列可以所確定的序列中總共至少O. 1%,0. 2%,O. 3%,O. 4%,O. 5%,O. 6%,O. 7%,O. 8%,O. 95%,2%,2. 5%,3%,3. 5%,4%,
4. 5%,5%,6%,7%,8%,9%,10%或任何中間范圍的頻率存在。所識別的富有可變區(qū)序列可以是候選抗原特異性序列。對于抗原特異性抗體或抗體片段的產(chǎn)生，所述方法可進一步包括選擇一對包含相似豐度水平的Vh和\的核酸序列或一對包含屬于包含相似分度的一簇核酸序列的核酸序列。例如，所述對中Vh核酸序列是最富有Vh序列并且所述對中的\核酸序列是最富有\(zhòng)序列?？蛇x擇地，相似豐度水平的Vh和 '可以是分別具有在Vh或\亞群中相似分級等級或相似濃度水平的任何Vh和'。例如，第三最富有Vh可以與第三最富有'配對。在還有另外的方面中，Vh和/或 '可以與其他所識別的Vh或\序列比對以識別高相似性序列簇(例如例如高突變的結(jié)果不同的序列)之后將所述簇分級并且Vh可與屬于相似級別的簇的Vl配對。
所述方法可進一步包括產(chǎn)生包含由Vh和\的所配對的核酸序列編碼的氨基酸序 列的抗體或抗體片段。所產(chǎn)生的抗體或抗體片段中的至少一種可以結(jié)合所受對象已經(jīng)被暴 露于其的抗原，例如用于將所受對象免疫的免疫原。例如，富有可變區(qū)序列可以直接化學(xué)合 成，例如自動合成法。所述方法可進一步包括在體外表達系統(tǒng)中或異源細(xì)胞表達系統(tǒng)中表 達富有可變區(qū)序列(例如合成的)。
所受對象可以是任何動物，優(yōu)選地哺乳動物或人類。所受對象可以患有疾病或病 況，包括腫瘤、傳染性疾病或自身免疫疾病或者已經(jīng)被免疫。在某些方面，所受對象可以從 疾病或或病況例如腫瘤、傳染性疾病或自身免疫疾病恢復(fù)或存活。在另外的方面，所受對象 可以處于對疾病或病況的預(yù)防和治療例如癌癥治療、傳染疾病治療或疫苗之中或之后。例 如，所受對象已經(jīng)或已經(jīng)被暴露于為傳染原、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞、變應(yīng)原或自身抗原的抗 原。這樣的傳染原可以是任何致病性病毒，致病性細(xì)菌，真菌，原生動物，多細(xì)胞寄生蟲和異 常的蛋白質(zhì)，如朊病毒，以及來源于其的核酸或抗原。變應(yīng)原可以是能夠?qū)е聜€體中I型過 敏反應(yīng)的任何非寄生蟲抗原，例如許多常見的環(huán)境抗原。
腫瘤抗原可以是腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的促發(fā)宿主中的免疫響應(yīng)的任何物質(zhì)。腫瘤細(xì)胞 中產(chǎn)生的具有歸因于突變的異常結(jié)構(gòu)的蛋白可作為腫瘤抗原。這些異常蛋白由于所關(guān)注的 基因的突變而產(chǎn)生。原癌基因和導(dǎo)致異常蛋白產(chǎn)生的腫瘤抑制因子的突變是腫瘤的致因并 且因此這些異常蛋白稱為腫瘤特異性抗原。腫瘤特異性抗原的實例包括ras和p53基因的異常產(chǎn)物。
在某些方面中，提供了包括獲得所受對象的B細(xì)胞中的VH和VL基因的至少⑶R3 編碼序列的核酸序列的序列信息。例如，所確定的核酸序列可包含VH和VL基因。B細(xì)胞可 優(yōu)選地是成熟的B細(xì)胞。例如成熟的B細(xì)胞可包括記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞或其組合。漿細(xì)胞 可包括骨髓漿細(xì)胞、淋巴結(jié)漿細(xì)胞或脾漿細(xì)胞。在特定的實例中，可使用骨髓漿細(xì)胞?？苫?于細(xì)胞標(biāo)記尤其是細(xì)胞表面標(biāo)記例如Blimp-Ι、⑶138、CXCR4和/或⑶45的差別表達選擇 或富集漿細(xì)胞。
獲得核酸序列信息可包括確定B細(xì)胞或淋巴組織中核酸序列和任選地相應(yīng)的氨 基酸序列，或者在其他方面中，從提供服務(wù)者或數(shù)據(jù)存儲設(shè)備獲得這樣的信息。在另外的方 面，這樣的核酸序列信息可用于確定血清抗體的氨基酸序列。
為了確定B細(xì)胞或淋巴組織中的核酸序列，可使用本領(lǐng)域中已知的任何核酸測序 方法，包括高通量DNA測序。高通量測序方法的非限制性實例包括邊合成邊測序(例如 454測序)、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序(Multiplex Polony Sequencing)、納米孔測序或其組合。
在某些方面中，提供了獲得所受對象的含血清樣品中抗體的VH和VL區(qū)的至少 CDR3的氨基酸序列的序列信息。獲得序列信息可包括確定氨基酸或核酸序列或者從提供服 務(wù)者或數(shù)據(jù)存儲設(shè)備獲得這些信息。
這些氨基酸序列確定方法可包括獲得來源于所受對象的血清抗體的肽的質(zhì)譜。為 了分離來源于血清抗體的肽，可使用任何層析方法，例如高效液相層析(HPLC)。
為了確定氨基酸序列，提供包括分離或富集所選擇類型的血清抗體例如IgG、IgM、 IgA、IgE或其他主要Ig類型，分離或富集與預(yù)定抗原結(jié)合的血清抗體和/或分離或富集血清抗體的含CDR3片段的方法。在另外的方面，所述方法可包括使用在所受對象的成熟B細(xì)胞的VH和VL區(qū)的至少CDR3的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列的序列信息的基礎(chǔ)上識別的蛋白酶從血清抗體制備含⑶R3的肽片段。例如，蛋白酶在⑶R3外或者接近⑶R3的位點剪切VH和VL肽，因此留下基本上完整的⑶R3區(qū)。在某些方面中，還提供可包括富集或純化含⑶R3的肽片段的方法。例如這些方法可包括將含CDR3的肽片段與用于在CDR3序列的末端特異性軛合唯一的半胱氨酸的標(biāo)記的硫醇特異性軛合劑軛合。富集或純化所軛合的含CDR3的肽片段的方法可以基于所軛合的含⑶R3的肽片段上的標(biāo)記。標(biāo)記的實例包括生物素。發(fā)明的某些方面基于，部分地，漿細(xì)胞或淋巴組 織中高度富有的抗體cDNA與對與所受對象中的疾病或病況例如腫瘤相關(guān)的抗原的抗體特異性相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。在另外的方面，提供了包含通過例如自動化方法確定B細(xì)胞或淋巴組織中血清抗體的氨基酸序列或VH和VL基因的核酸序列的豐度水平的方法。為了確定血清抗體的氨基酸序列的豐度水平，使用用于質(zhì)譜法的定量方法。在某些方法中，提供了包括確定表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的抗體氨基酸序列的方法。例如，閾值水平豐度是大約、至少或者至多5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500 μ g/ml (或其中任何可獲得的范圍)的濃度或者血清抗體的約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200個(或其中任何可獲得的數(shù)目范圍)最富有含CDR3的氨基酸序列中的至少一個的水平。在某些方法中，提供了包括識別表現(xiàn)至少閾值水平豐度的抗體核酸序列的方法。這些閾值水平的豐度可以是所受對象的抗體基因池中至少O. 5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%的頻率，例如在B細(xì)胞群或淋巴組織中的抗體基因。這些B細(xì)胞群可以是特定的成熟B細(xì)胞群，例如來自所選擇的淋巴組織例如骨髓、脾或淋巴結(jié)的成熟B細(xì)胞群。在某些方面，提供了包括報告上文所描述的確定或識別中的任一個的方法。例如，這些報告可以是計算機可讀形式。在某些方面，還提供了包括產(chǎn)生包含一個或多個的如上文所描述的富有氨基酸序列中的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段的方法?？贵w或抗原結(jié)合片段的產(chǎn)生可包括相應(yīng)于表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的血清抗體的富有VH和VL氨基酸序列的VH和VL編碼區(qū)的化學(xué)合成或者在其他方面包括B細(xì)胞或淋巴組織中VH和VL基因的富有核酸序列的化學(xué)合成。B細(xì)胞可以是成熟B細(xì)胞，特別地漿細(xì)胞，更特別地骨髓漿B細(xì)胞。產(chǎn)生方法可進一步包括將富有序列合并至一個或多個表達載體中。另外的方面可包括在任何宿主細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達富有序列例如所合成的VH和VL序列。例如，如此產(chǎn)生的抗體或抗原結(jié)合片段可結(jié)合所受對象具有或已經(jīng)被暴露于其的抗原。抗原可以是傳染原、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞或自身抗原。這些結(jié)合可以具有至少或大約100、200、103、104、105pM或1、2、3、4、5 μ M或其中可獲得的任何范圍的單價親和性。還進一步提供了包含評價所產(chǎn)生的抗體或抗原結(jié)合片段對預(yù)定的抗原例如傳染原、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞或自身抗原的結(jié)合親和性或特異性的方法。
在優(yōu)選的方面中，每個如此產(chǎn)生的抗體或抗原結(jié)合片段中都包含相似豐度氨基酸或核酸序列的Vh和\。例如，Vh序列具有分級為含血清樣品中第三最富有Vh序列的豐度水平，其可與在相同的樣品中具有相似豐度等級水平(例如第三、第四或第五)的'序列配對。發(fā)明人確定將具有+/_3等級級別豐度的Vh基因和'基因配對(例如第三最富有Vh 和第一至第六最富有\(zhòng)中的任一種)以高于50%的頻率產(chǎn)生抗原特異性抗體。
就本文描述的其他方法或組合物而言，可使用在本發(fā)明的方法和/或組合物的背景下討論的實施方案。因此，也可將屬于一種方法或組合物的實施方案應(yīng)用于本發(fā)明的其他方法和組合物。
如本文所用的，就核酸而言使用術(shù)語“編碼(encode) ”或“編碼(encoding) ”以使本發(fā)明容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，然而，這些術(shù)語可分別與“包括(comprise) ”或“包括 (comprising) ” 互換使用。
如本文說明書中所用的，“一(a)”或“一(an)”可意指一個或多個。如本文權(quán)利要求中所用的，當(dāng)與詞語“包括(comprising)”關(guān)聯(lián)使用時，詞語“一 (a)”或“一(an)”可意指一個或多于一個。
除非明確表明僅指選擇方案或者所述選擇方案是互相排斥的，權(quán)利要求中術(shù)語 “或”的使用被用來意指“和/或”，盡管本公開內(nèi)容支持是指僅選擇方案和“和/或”的定義。如本文所用的，“另一個”可意指至少第二個或更多。
本申請全文中，術(shù)語“約”用于意指數(shù)值包括設(shè)備的誤差固有偏差、用于確定所述數(shù)值的方法或在研究客體中存在的偏差。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將從下文詳細(xì)描述中變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是詳細(xì)的描述和具體的實例，同時代表本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，僅以說明的方式給出，因為從這一詳細(xì)描述中本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的不同變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
下列附圖構(gòu)成本說明書的一部分并且被包括以進一步證明本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明通過結(jié)合本文中特定實施例的詳細(xì)描述參照這些附圖中的一個或多個而被更好的理解。


圖1 :用于血清Ig的定量分析的實驗性方法的示例性實施方案的流程圖。
圖2 :分離單克隆抗體但無需通過采選骨髓漿細(xì)胞的抗體可變(V)基因譜篩選的示意圖。免疫之后，將小鼠處死并且分離⑶45RTD138+漿細(xì)胞。mRNA分離和第一鏈cDNA合成之后，產(chǎn)生可變輕鏈(VJ和可變重鏈(Vh)基因DNA。進行高通量454DNA測序和生物信息學(xué)分析以確定\和Vh譜。最富有\(zhòng)和Vh基因被識別并且通過簡單的相對頻率法則確定配對。使用自動機器人協(xié)助的基因合成合成各個抗體基因。最終，抗原特異性抗體信號鏈可變片段或全長IgG分別在細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞中表達。
圖3 :從骨髓分離漿細(xì)胞。左圖用抗⑶45R-APC抗體和抗⑶138-PE抗體標(biāo)記的總小鼠骨髓細(xì)胞群的流式細(xì)胞計數(shù)曲線。中間圖CD45R+細(xì)胞耗盡之后剩余的骨髓細(xì)胞。 右圖用軛合磁珠的抗CD138+抗體磁性分選之后分離的細(xì)胞群。
圖4 :來自骨髓漿細(xì)胞的可變輕鏈(VJ和可變重鏈(Vh)基因。通過PCR從來源于用不同抗原免疫的小鼠的骨髓漿細(xì)胞的cDNA擴增的V1^P'基因的瓊脂糖凝膠電泳。從左邊起第一道是DNA梯度；第二、第四、第六、第八道是Vd 370bp);第三、第五、第七、第九道是 Vh ( 400bp)。圖5是V基因分析的生物信息學(xué)流水線的示例性實施方案的流程圖。首先，通過與保守側(cè)翼氨基酸序列基序的同源性識別CDR3。以最高頻率(通常具有> 1%的頻率)存在的CDR3被用于將感興趣的V基因序列分組。通過多序列比對和配對同一性的計算進行包含高度表現(xiàn)的CDR3的V基因的同源性分析。最后，進行高度表現(xiàn)的全長V基因的種系分析以確定無性系突變和V (D) J和V-J基因使用。圖6 :V基因譜分析的圖形用戶界面(GUI)的實例。開發(fā)GUI應(yīng)用以便組織和圖解表示V基因的高通量測序結(jié)果。程序輸入并組織來自不同的樣品數(shù)據(jù)集、使用所描述的CDR側(cè)翼基序確定CDRH3和CDRL3并且提取CDR3頻率分布(SEQ ID NO :718_737PRT和SEQ IDNO 738-747DNA)。圖7 :佐劑和Cls免疫的譜中Vh種系家族圖表。柱狀圖代表每個譜中前30個Vh序列的％基因家族的頻率(代表總Vh譜的24% -47% )。在免疫小鼠中證明了朝向IGHVl的清楚的偏移。圖8 :包含相同⑶R3的全長V基因的同源性分析。⑷當(dāng)所有其他序列以< O. 8%的頻率存在時，全長Cls-L IVh基因(CDRH3 = GNYYYAMDY(SEQ ID NO :145))的數(shù)據(jù)集由單一序列(65% )占主要地位。(B)全長 Cls-2. 2VH 基因(CDRH3 = WLLLAY(SEQ ID NO :21))的頻率分布顯示具有高頻率的多個序列。(C)包含Cls-2. 2⑶R3的前三個全長Vh序列和它們各自的頻率(% ) (SEQ ID NO =758-760)。圖9 :高頻率⑶RH3的比較表明每個小鼠中唯一的Vh基因。顯示注射佐劑(Adv)、卵清蛋白(OVA)、Cls和Bright (BR)的小鼠中高度表現(xiàn)的⑶RH3分布的熱圖。Y軸表示每個小鼠中識別的10個最高頻率CDRH3序列。X軸將這些優(yōu)勢CDRH3序列的頻率在所有其他小鼠中相比較。白色以非統(tǒng)計學(xué)上顯著的頻率(0.00-0.03%)存在的序列。黑色以>10%的頻率存在的序列。圖10A-10B :來自不同小鼠組的骨髓漿細(xì)胞譜的⑶RH3序列的主成分分析(PCA)。僅卵清蛋白(OVA)和佐劑的小鼠是一個免疫組(來源于同一籠并且同一窩)而Cls和Bright小鼠是另一個免疫組。第一次主成分分析識別兩個主要簇組，藍色和紅色，其代表不同的實驗(即免疫在不同的日期進行)。圖11 :跨四個小鼠群的亞集分布的⑶RH3的百分比。從一組八個中選擇的四個小鼠的所有組合之間的普通CDRH3的百分比。在同一天用卵清蛋白(OVA)或佐劑免疫的小鼠之間的百分比相似性顯示為紅色。在用一天用Bright或Cls免疫的小鼠之間的百分比相似性顯示為藍色；灰色代表每個另外的可能的組合的相似性。圖12 :合成抗體基因的構(gòu)建。將來自骨髓漿細(xì)胞譜的高度表現(xiàn)Vh和\基因通過將V基因與聚gly-ser連接體連接合成為單鏈可變片段(scFv)。比對.聚gly_ser連接體起到比對所期望的基因集的錨點的作用。加入適合的限制性位點以促進克隆并且將序列填充至統(tǒng)一長度以使得單一重疊寡核苷酸組裝設(shè)計圖能夠建立所有基因。初級組裝.使用內(nèi)外成核PCR(設(shè)計圖右邊)從寡核苷酸的重疊的集產(chǎn)生初級片段。二級組裝.組裝的第二個步驟是將初級片段結(jié)合在一起形成最終產(chǎn)物的方便的重疊延伸PCR(設(shè)計圖右邊)。通過移液機器人將初級PCR產(chǎn)物用水稀釋并且每個所稀釋的初級反應(yīng)物的一部分被加至第二反應(yīng)中(實例左邊)。凝膠圖像.典型scFv組裝產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠。第一道DNA梯度；第二和第三道 400bp的初級產(chǎn)物；第四道 810bp的最終產(chǎn)物。
圖13A-13B :經(jīng)由表面等離子體子共振(Biacore)的純化的抗Cls IgG的動力結(jié)合分析。(圖13A)用固定化的Cls以25nM、50nM、100nM或200nM將抗Cls 2. 1L-2.1HB抗體注射至芯片上并且(圖13b)如上文以2. 625nM、5. 25nM、10. 5nM或21nM注射的抗Cls2.3L-2. 2H。
圖14 :使用通過采選骨髓漿細(xì)胞譜獲得的抗體通過三明治ELISA檢測Cls?？笴ls scFv 2. 1L-2.1HB抗體包被在板上并用作捕獲抗體而抗Cls IgG 2. 3L_2. 2H抗體用作檢測抗體。
圖15 :通過使用通過采選骨髓漿細(xì)胞譜獲得的抗體將Cls從人類血清免疫沉淀。 在與蛋白A瓊脂糖小球結(jié)合后，抗Cls IgG 2. 3L-2. 2H抗體被用于捕獲人類血清中的Cls。 用抗Cls scFv 2. 1L-2.1HB抗體作為初級抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析，之后用抗聚His-HRP 抗體檢測。道1:100kDa和70kDa M. W.標(biāo)記。道2 :無捕獲抗體；道3和4 :分別用1. 5 μ g/ ml 和 3 μ g/ml 2. 3L-2. 2H 抗體捕獲。
圖16 :序列比對顯示所有已知綿羊種系VH基因(IGHV)的5’區(qū)。5’簡并引物混合物可基于這些序列來設(shè)計并且用于來自綿羊第一鏈cDNA (SEQ ID NO =779-789)的PCR擴士豳>曰ο
圖17 :小雞種系IGHV區(qū)基因的氨基酸序列(SEQ ID NO =761-778)。說明性實施方案的描述
1.引言
值得注意的是思考生物學(xué)研究為何未能解決位于理解生命體系中心的某些主要問題。一個這樣的問題是哺乳動 物中多克隆免疫反應(yīng)的組分的分析。血清抗體在保護頜類脊椎動物對抗來自環(huán)境因素、病原體以及異常自身細(xì)胞的激發(fā)中起到不可取少的作用。然而盡管在了解免疫響應(yīng)的起源和B細(xì)胞發(fā)育上的巨大進展，仍不可能的是在分子水平解決位于具有保護性多克隆抗體群的血清中的體液免疫的最終結(jié)果。由于技術(shù)原因，血清抗體響應(yīng)僅就對特定抗原的效價而表征，很少有或者沒有歸于關(guān)于與抗原結(jié)合的免疫球蛋白的相對量以及親和性和特異性的信息。本發(fā)明的某些方面通過表征其抗體組分的相對豐度和氨基酸序列來將血清免疫響應(yīng)去卷積并且之后分別評價它們的治療功效的能力可徹底改變蛋白質(zhì)治療
B細(xì)胞成熟和歸巢是適應(yīng)性免疫力以及保護性免疫球蛋白響應(yīng)產(chǎn)生的標(biāo)志。分子免疫學(xué)和基因?qū)W的廣泛研究已經(jīng)引致對哺乳動物中B細(xì)胞分化的時相階段和不同B細(xì)胞亞群許多功能的重要了解。B細(xì)胞發(fā)育的終末以及不可逆階段是位于骨髓、脾和其他淋巴組織并且作為免疫球蛋白(Ig)生產(chǎn)工廠的漿細(xì)胞的形成。完全分化的漿細(xì)胞與分泌較低數(shù)量抗體的未成熟的漿細(xì)胞(漿母細(xì)胞)一起共同占到淋巴細(xì)胞的小于1%并且仍然負(fù)責(zé)循環(huán)系統(tǒng)中所有抗體。從功能觀點來看，循環(huán)抗體由三個池組成低親和性、非特異性池(主要通過BI和邊緣區(qū)B細(xì)胞源的ASC產(chǎn)生，響應(yīng)于激發(fā)產(chǎn)生的多克隆的和逐漸越來越高親和性 /特異性抗體的更富有的池)和具有對來自較早暴露的抗原的不同特異性的高親和性抗體的第三池。組成第三池的抗體在生物體生命期(人類中長50年)的大部分時間中產(chǎn)生，而對抗體再刺激沒有明顯需要。這些長期的持續(xù)的響應(yīng)對再感染起到重要的保護性作用并且構(gòu)成了 “體液記憶”。非特異性抗體池構(gòu)成“天然抗體”或賦予抗病原體的早期保護的體液免疫響應(yīng)的“先天”成分。第二群抗體包括適應(yīng)性免疫響應(yīng)并且在激發(fā)后幾周內(nèi)在強度上迅速下降(Rajewsky, 1996 ；Manz 等人，2005 ；Shapiro-Shelef 和 Calame, 2005 ；Lanzavecchia和 Sallusto,2009)。漿細(xì)胞代表小于I %的免疫細(xì)胞并且它們?nèi)匀回?fù)責(zé)循環(huán)系統(tǒng)中所有抗體(Rajewsky,1996 ；Manz 等人，2005 ;Shapiro-Shelef 和 Calame, 2005 ；Lanzavecchia 和Sallusto, 2009)。在小鼠和人類中，抗體以10_20mg/ml，之間的濃度存在于血清中，其中85%是IgG，約7%是IgM而另外的7-10%是單體IgA (Manz等人，2005)。小鼠中抗體分泌細(xì)胞(ASC)群的分析表明血清可含有多達500種不同的抗體，其中多個可具有相同的抗原特異性。然而，以< 20 μ g/ml (約InM)存在的低豐度抗體似乎在癌癥監(jiān)視和殺滅中不能，至少單獨地，起到顯著作用。值得注意地，考慮到哺乳動物免疫中血清抗體的巨大重要性，仍沒有辦法對組成血清Ig池的不同抗體進行相對濃度的定量表征以及序列和親和性/特異性的確定。由于技術(shù)原因，血清抗體響應(yīng)僅就對特定抗原的效價而言進行了表征。血清Ig的蛋白質(zhì)組分析 仍是不可能的，首先因為Ig中全組裝的V區(qū)的結(jié)合上不同的和無性系突變的氨基酸序列對于MS譜的判讀來說是必需的但是之前未知。換句話說，血清IgG的MS分析需要蛋白質(zhì)氨基酸序列的知識但是這些序列是未知的。其次是因為血清是多種蛋白的高度復(fù)雜的混合物，鳥槍蛋白質(zhì)組方法非常難以完成。第三，蛋白質(zhì)組方法不能告知抗體特異性和生物學(xué)功能。免疫學(xué)家依賴通過使用技術(shù)例如雜交瘤技術(shù)的永生化或經(jīng)由病毒(EBV)感染的B細(xì)胞永生化或可選地通過B細(xì)胞篩選和克隆來分離具有所期望的特異性的抗體。然而，這些方法不能捕獲循環(huán)系統(tǒng)中的抗體的譜。產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞不能增殖并且不能融合或永生化。不可能知道從永生化/克隆的記憶B細(xì)胞分離的抗體是否并且以相對于其他抗體的何種水平存在于血清中。由于這些原因，本領(lǐng)域未包含關(guān)于如何分離循環(huán)系統(tǒng)中存在的抗體，尤其是以較高豐度或特異結(jié)合疾病致病抗原的那些，的任何信息。此外，這些方法通常不能用于除了已經(jīng)開發(fā)了用于B細(xì)胞永生化的適合的工具的少數(shù)哺乳動物、小鼠、靈長類和某些實例中兔之外的任何動物。而且，這些方法非常耗時并且作為結(jié)果它們在處死動物和分離抗原特異性抗體之間花費數(shù)月。本發(fā)明試圖克服現(xiàn)有領(lǐng)域中的缺點并且開發(fā)用于人類和動物中抗體響應(yīng)的定量分子重疊合的方法。例如，高通量測序、蛋白質(zhì)組和/或生物信息分析可以相結(jié)合以識別循環(huán)系統(tǒng)或淋巴組織中高度表現(xiàn)的免疫球蛋白(Ig)的序列和相對豐度。在某些另外的實施方案中，之后可以合成這些抗體的可變結(jié)構(gòu)域的基因，表達并純化各個IgG或抗體片段例如scFvs，之后可分析抗體或抗體片段與所受對象來源中的抗原例如感興趣的傳染原或癌細(xì)胞的結(jié)合。對于來自血清的抗體響應(yīng)的定量分子重疊合，可提供具有在圖1中示例性說明示例性實施方案的方法。在某些實施方案中，步驟中一個或多個可以是任選的并且可進行步驟的變化以達成相同的目的。里二，高通量測序例如來自外周血中成熟B細(xì)胞(記憶和漿母細(xì)胞)或來自骨髓和脾(當(dāng)可獲得時)的漿細(xì)胞的V基因cDNA的NextGen測序被用于產(chǎn)生患者抗體的氨基酸序列的信息庫。在某些方面，DNA測序可被用于建立個體所制得的所有的抗體的序列數(shù)據(jù)庫。重=，為了蛋白質(zhì)組分析，分離來自患者血清的免疫球蛋白部分并且抗體通過用于Ig類型分離不同的親和性方法以及同樣通過在感興趣的多種抗原上的親和性結(jié)合分成幾部分。重U吏用保持CDR3區(qū)完整性的蛋白酶將不同部分中的Ig多肽片 段化。CDR3是不同抗體唯一或接近唯一的標(biāo)示符。同樣通過利用肽中的Cys殘基的存在的 方法從不相關(guān)的肽中富集CDR3肽。例如，使用與硫醇反應(yīng)以引入生物素的試劑。簋通，之 后通過提供池中不同CDR3序列的絕對定量的鳥槍蛋白質(zhì)組LC-MS/MS方法分辨并測序CDR3 肽。簠五，參考在上文第一步驟中產(chǎn)生的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫解釋MS數(shù)據(jù)。重左，在血清中 識別的最豐富Vh和\基因通過全基因合成來合成。重土，將相同豐度的Vh和\基因配對 成為IgG，將其表達并且表征抗原結(jié)合親和性。
在另外的實施方案中，用固定的抗原通過親和層析分離抗原特異性抗體。之后識 別唯一或相反的肽，如上文段落中所識別的由V基因家族編碼的序列。隨后相應(yīng)于具有相 同豐度(頻率)或等級級別豐度的肽的VH和VL基因被合成并且配對成為IgG，其被表達并 且表征抗原結(jié)合親和性。
在另外的實施方案中，免疫后來自淋巴組織的B細(xì)胞中的VH和VL cDNA的相對 豐度被用于識別抗原特異性抗體。免疫之后，適合的免疫響應(yīng)導(dǎo)致經(jīng)由新分化的B細(xì)胞產(chǎn) 生抗原特異性抗體。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼抗原特異性抗體的V基因cDNA在淋巴組織中以 非常高的水平表達。因此，發(fā)明人已經(jīng)使用了高通量DNA測序以確定在特定淋巴區(qū)室中的 B細(xì)胞表達的V基因并且之后推論出這些V基因的豐度或頻率。發(fā)明人合成高豐度V基因 并且根據(jù)在該組織中它們的豐度或它們的分級級別豐度將VH和VL配對。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 40%和> 80%之間的所配對的V基因產(chǎn)生抗原特異性抗體。由此產(chǎn)生的抗原特異性抗體的 百分比與通過在用免疫抗原包被的板上的系列稀釋的ELISA測定所確定的抗體的血清效 價相關(guān)聯(lián)。
Vh和\鏈的配對同樣可由將所識別的Vh和\序列分組至相關(guān)序列的簇中(例如 代表僅無性系超突變不同的序列的簇)來指導(dǎo)。這樣的分簇可通過對所識別的Vh和'序 列對以及由此的相關(guān)序列的簇進行多序列比來完成。分簇信息之后可被用于指導(dǎo)Vh和\ 鏈配對。可選擇地或另外地，通過瞬時方法識別的Vh和'鏈可通過對所識別的成對的鏈的 組合親和性測定(例如ELISA)來確定。這些方法可在當(dāng)抗體譜不是高度極化的例如常常 在來自綿羊、山羊和兔的樣品中所存在的情況時具有特殊用途。
在另外的實施方案中，提供了直接從淋巴組織識別抗原特異性可變基因序列而無 需分離B細(xì)胞的方法。示例性的實施方案可在圖2中示例性說明。步驟中一個或多個可以 是任選的并且可進行步驟的變化以達成相同的目的。首先，過程可以將免疫的動物處死并 收集初級、二級或三級淋巴器官或組織樣品開始。第二，可進行V基因cDNA的高通量測序 例如NextGen測序。第三，可使用生物信息學(xué)分析以確定不同V基因出現(xiàn)的頻率。第四，識 別以高豐度或頻率表達的V基因。例如，這些高豐度(即頻率)基因包含從相應(yīng)組織獲得 或分析的全V基因群的至少0.5%。第五，可制備編碼來自上文的豐富基因的DNA。第六， 基于它們的分級級別豐度將編碼Vh和'鏈的基因配對。第七，可在宿主細(xì)胞中表達各種 Vh-'基因組合以產(chǎn)生對用于動物免疫的抗原特異性的抗體。
I1.定義
除非另外說明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中一 名一般技術(shù)人員通常所理解的含義。下文定義補充本領(lǐng)域中的那些并且指定于本申請中所 描述的實施方案。
術(shù)語“抗體”在本文中以最廣闊的含義使用并且特別包含至少單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、天然多特異性抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體和抗體片段?？贵w是包含基本上或者部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一種或多種多肽的蛋白。所識別的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、ε、ζ和μ恒定區(qū)基因以及極大數(shù)量的免疫球蛋白可變區(qū)基因。“抗體片段”包括完整抗體的一部分，例如其抗原結(jié)合區(qū)的一個或多個部分?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，雙體、線性抗體、單鏈抗體以及從完整抗體和抗體片段形成的多特異性抗體?！巴暾贵w”是包含全長重鏈和輕鏈以及Fe區(qū)的抗體。完整抗體同樣稱為“全長異二聚”抗體或免疫球蛋白。術(shù)語“可變”是指在它們的序列上表現(xiàn)可變性并且參與確定特定抗體的特異性和結(jié)合親和性的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的部分。 如本文所用的，“抗體可變結(jié)構(gòu)域”是指包括互補決定區(qū)(CDRJP⑶R1、⑶R2和CDR3)以及框架區(qū)$1 ;即？1 141 241 3和？1 4)的氨基酸序列的抗體分子的輕鏈和重鏈的一部分。FR包括除了如本文中定義的CDR位點之外抗體可變結(jié)構(gòu)域中的那些氨基酸位點。VH是指重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。VL是指輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。如本文所用的，術(shù)語“互補核苷酸序列”是指足以與另一條單鏈上互補以與其特異性雜交具有作為結(jié)果的氫鍵的DNA或RNA的單鏈分子中的核苷酸序列?！氨磉_載體”意指用于傳送基因信息的任何核苷酸分子。II1.抗體可變結(jié)構(gòu)域本發(fā)明的某些方面提供識別在血清或B細(xì)胞中過量表達的抗體可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域編碼序列的方法?？贵w可變結(jié)構(gòu)域的這些偏移表現(xiàn)被用于識別具有高親和性或特異性的新的抗原結(jié)合分子。以高水平豐度產(chǎn)生具有可變結(jié)構(gòu)域的抗體或抗體片段允許分離高親和性結(jié)合劑。本發(fā)明是基于(部分地)形成抗原結(jié)合口袋的抗體可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)(例如CDR3區(qū))的豐度水平可與所期望的親和性或特異性相關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)。為了識別所期望的抗體可變區(qū)，本發(fā)明的某些部分提供確定抗體互補決定區(qū)(CDR)的序列和分布的方法。特別地，VH和/或VL的互補決定區(qū)(CDR)中的一至六個的序列可通過蛋白測序或核酸測序方法來確定?？勺兘Y(jié)構(gòu)域或CDR的豐度水平可確定為絕對水平例如濃度或者相對水平例如分級級別?？贵w是也稱為免疫球蛋白的球形血漿蛋白( 150kDa)。它們具有加至它們的氨基酸殘基中的某些的糖鏈。換句話說，抗體是糖蛋白。每個抗體的基本功能單位是免疫球蛋白(Ig)單體(僅包含一個Ig單位)；分泌的抗體還可以以兩個Ig單位二聚化(例如IgA)，以四個Ig單位四聚化(例如硬骨魚IgM)或者以五個Ig單位五聚化(例如哺乳動物IgM)。Ig單體是“Y”型分子，由四個多肽鏈構(gòu)成；由二硫鍵連接的兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈。每條鏈由稱為Ig結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域組成。這些結(jié)構(gòu)域包含約70-110個氨基酸并且根據(jù)它們的尺寸和功能被分類為不用的類別(例如可變的或IgV和恒定的或IgC)。它們具有表征性的免疫球蛋白折疊，其中兩個β折疊產(chǎn)生“三明治”形狀，通過保守的半胱氨酸和其他變化的氨基酸之間的相互作用保持在一起。
有通過希臘字母α、δ、ε、Y和μ表示的五個類型的人類Ig重鏈。所存在的重鏈類型定義了抗體的種類；這些鏈分別存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中。不同的重鏈在尺寸和組成上不同；Ig重鏈α和Y包含約450個氨基酸,而μ和ε具有約550個氨基酸。其他動物編碼類似免疫球蛋白重鏈類型。
每個重鏈具有兩個區(qū)，恒定區(qū)和可變區(qū)。恒定區(qū)在相同同種型的所有抗體中都相同，但是在不同同種型的抗體中不同。重鏈Y、α和δ具有由三個隨機(成一線)的Ig 結(jié)構(gòu)域組成的恒定區(qū)和用于增加撓性的鉸鏈區(qū)；重鏈μ和ε具有由四個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成的恒定區(qū)。重鏈的可變區(qū)在由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體中不同但是在由單個B細(xì)胞或 B細(xì)胞集群產(chǎn)生的所有抗體中相同。每個重鏈的可變區(qū)大約110氨基酸長并且由單個Ig結(jié)構(gòu)域組成。
在人類(和小鼠)中，有兩種類型的免疫球蛋白輕鏈,其稱為λ (λ)和K (K)。 輕鏈具有兩個連續(xù)的結(jié)構(gòu)域一個恒定結(jié)構(gòu)域和一個可變結(jié)構(gòu)域。輕鏈的大致長度為211 至217個氨基酸。每個抗體含有總是相同的兩個輕鏈；在這些物種中，每個抗體僅存在一種類型的輕鏈，K或λ。
片段抗原結(jié)合(Fab片段)是抗體上與抗原結(jié)合的區(qū)。其由重鏈和輕鏈中的每一個的一個恒定區(qū)和一個可變區(qū)組成。這些結(jié)構(gòu)域形成互補位-抗原結(jié)合位點-單體的氨基末端。
兩個可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合它們特異性抗原上的表位?？勺兘Y(jié)構(gòu)域也稱為FV區(qū)并且是與抗原結(jié)合的最重要的區(qū)。更具體地，可變環(huán)，輕鏈(VL)和重鏈(VH)上各三個負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合。這些環(huán)稱為互補決定 區(qū)(⑶R)。
互補決定區(qū)(OTR)是存在于與抗原互補并且因此提供具有對該特定抗原的特異性的受體的抗原受體(例如免疫球蛋白和T細(xì)胞受體)蛋白的可變結(jié)構(gòu)域中的短的氨基酸序列。CDR在可變結(jié)構(gòu)域中由保守框架區(qū)(FR)支持。
抗原受體的每個多肽鏈包含三個⑶R(⑶RlXDR2和⑶R3)。因為抗原受體通常由兩個多肽鏈組成，因此可與抗原接觸的每個抗原受體有六個CDR(每個重鏈和輕鏈包含三個CDR)，單個抗體分子有十二個CDR而五聚體IgM分子有六十個CDR。因為與免疫球蛋白和 T細(xì)胞受體相關(guān)的大多數(shù)序列變化存在于CDR中，這些區(qū)有時稱為超變結(jié)構(gòu)域。其中，CDR3 在其由VJ(在重鏈的實例中VDJ)區(qū)的重組編碼時顯示最大的變化性。
IV.抗體可變區(qū)分析
在本發(fā)明的某些方面中，可分析來源于CDNA的抗體可變基因(V基因)序列。例如，來自這些分析的信息可被用于生成產(chǎn)生循環(huán)抗體的V基因的數(shù)據(jù)庫(V基因數(shù)據(jù)庫)以致來源于血清抗體的肽的質(zhì)譜(MS)譜圖可被確定并且反過來用于確定數(shù)據(jù)庫中編碼這些肽的各個全長V基因。在另一個實施方案中，序列信息可以用于確定富有可變基因核酸例如mRNA轉(zhuǎn)錄物并且以富有可變基因為基礎(chǔ)產(chǎn)生抗體或抗體片段。所識別的富有可變基因可相應(yīng)于具有所期望的特異性或親和性的抗體或抗體片段。
從通過原始測序確定的核苷酸序列，推定的VH和VL區(qū)的氨基酸序列可使用標(biāo)準(zhǔn)算法和軟件包確定(例如參見網(wǎng)址mrc-lmb. cam. ac. uk/pubseq/, Staden包和Gap4程序)。 這些可以被進一步表征以確定VH和VL序列的⑶R(互補決定區(qū))部分，尤其是⑶R1XDR2 和CDR3。確定推定氨基酸序列并且識別CDR區(qū)的方法是本領(lǐng)域中熟知的。在一個特定的實施方案中，CDR3序列通過在前述的CDR3的N末端區(qū)尋找高度保守的序列基序來確定，這一方法可以正確地識別抗體中> 90%的⑶R3序列?；贐細(xì)胞cDNA的核酸序列獲得的推定氨基酸序列可以用于某些實施方案中血清抗體的鳥槍蛋白質(zhì)組分析。已經(jīng)開發(fā)了各種方法用于永生化或從個體B細(xì)胞克隆抗體。這些技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)，通過病毒(EBV)感染的記憶B細(xì)胞永生化，表達表面和分泌抗體兩者的記憶B細(xì)胞的工程化和從瞬時ABC群、記憶B細(xì)胞或脾漿細(xì)胞克隆抗原特異性抗體基因的。近來微流體和納米圖案化(nanopatterning)設(shè)備已經(jīng)被用于增加對于抗原結(jié)合和隨后的VH和VL基因克隆來說有質(zhì)疑的B細(xì)胞的通量。盡管對于單克隆抗體的分離是寶貴的，但是這些技術(shù)具有若干缺陷首先，大多數(shù)集中在并且在某些實例中僅與B細(xì)胞周期的某些階段相容。因此，對末端分化的成熟漿ASC的廣泛研究并未停止。這留下了未解決的核心問題，從B細(xì)胞分離的特定抗體在該個體的血清中是否以顯著的量存在。同樣，有證據(jù)顯示骨髓中的漿細(xì)胞是抗體合成的主要區(qū)室并且是在它們的親和性以及或許防護性功能的基礎(chǔ)上選擇的。其次單個B細(xì)胞克隆方法仍不足以提供血清中抗體多樣性的全部信息，尤其是特異性抗體克隆的血清濃度和豐度方面。第三，目前對于將重組mAb聚集以便重構(gòu)顯示更高治療效果的多克隆抗體的嘗試不可能捕獲血清的真實的保護效果，因為克隆的抗體的混合是完全隨機的。本發(fā)明可通過本文描述的方法避免這些問題中的一個或多個。在某些實施方案中，來自B細(xì)胞或者直接來自一個或多個免疫組織的mRNA可以被分離并且轉(zhuǎn)化為cDNA。在另外的實施方案中，cDNA可以經(jīng)歷VdP Vl基因分離。例如，編碼可變重鏈和可變輕鏈％和Vk，λ)基因的基因可以使用與cDNA的5’和3’端雜交的特異性引物來擴增。取決于用于cDNA構(gòu)建的引物，可區(qū)別不同Ig類型的V基因。例如'基因分離可以基于Ig類型通過使用可變基因的已知引物組擴增或者優(yōu)選地通過使用類型特異性3’引物的3’ RACE (cDNA末端的迅速擴增)。例如，類型特異性3’引物可以與C02結(jié)構(gòu)域雜交。V.淋巴組織 在某些實施方案中，提供了通過直接從淋巴組織獲得核酸序列來識別抗原特異性可變區(qū)序列的方法。在可選的方面中，B細(xì)胞可能不是從B細(xì)胞所位于的淋巴組織分離的。所述方法可包括初級、二級或三級免疫組織的分離。可使用用于分離淋巴組織的任何已知方法。與淋巴系統(tǒng)有關(guān)的淋巴組織與防御身體抗感染和腫瘤擴散的免疫功能相關(guān)。其由在其內(nèi)部具有不同類型的白血細(xì)胞的結(jié)締組織組成，大多數(shù)是淋巴細(xì)胞。取決于淋巴細(xì)胞發(fā)育和成熟的階段，淋巴組織可以是初級、二級或三級。(三級淋巴組織通常包含少得多的淋巴細(xì)胞并且假定僅在用導(dǎo)致炎癥的抗原激發(fā)時起到免疫作用。其通過輸入來自血液和淋巴的淋巴細(xì)胞來實現(xiàn)。中央和初級淋巴器官產(chǎn)生來自未成熟祖細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。胸腺和骨髓組成參與淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和初期選擇的初級淋巴組織。二級或外周淋巴器官維持成熟原始淋巴細(xì)胞并且起始適合的免疫響應(yīng)。外周淋巴器官是經(jīng)由抗原的原位淋巴細(xì)胞活化的位點?；罨瘜?dǎo)致克隆擴張和親和性成熟。成熟的淋巴細(xì)胞在血液和外周淋巴器官之間循環(huán)直到它們遭遇它們的特異性抗原。
二級淋巴組織為外源或變化的原始分子(抗原)提供環(huán)境以與淋巴細(xì)胞相互反 應(yīng)。其通過淋巴結(jié)以及扁桃體、派爾集合淋巴結(jié)、脾、腺樣增殖體、皮膚等中的淋巴濾泡示例 性說明，其與粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)有關(guān)。
淋巴結(jié)是淋巴組織有組織的集合，淋巴在其道路上經(jīng)過其返回血液。淋巴結(jié)以一 定間隔沿淋巴組織定位。若干的向心淋巴管指向淋巴，其滲入淋巴結(jié)的物質(zhì)中并且通過離 心淋巴管排出。
淋巴結(jié)的物質(zhì)由包含淋巴樣濾泡稱為“皮層”的外部部分中的淋巴樣濾泡和在除 了已知為“門”的部分的所有側(cè)面由皮層包圍稱為“髓質(zhì)”的內(nèi)在部分組成。門表現(xiàn)為淋巴 結(jié)表面的凹窩，其使得其他球形或卵形的淋巴結(jié)成為豆形。離心淋巴管直接從淋巴結(jié)出現(xiàn)。 動脈和靜脈經(jīng)由門隨血液進入和離開供給淋巴結(jié)。
淋巴濾泡是淋巴細(xì)胞的密集集合，其數(shù)目、尺寸和構(gòu)型依照淋巴結(jié)的功能狀態(tài)而 變化。例如，濾泡在遭遇外源抗原時顯著膨脹。B細(xì)胞的選擇發(fā)生于淋巴結(jié)的發(fā)生中心。
淋巴結(jié)在胸部、頸部、骨盆、腋窩(腋下)、腹股溝區(qū)(腹股溝)區(qū)的縱隔中尤其多 并且與腸道的血管相關(guān)。
V1. B細(xì)胞樣品制備
在某些實施方案中，B細(xì)胞可被提取用于可變區(qū)核酸序列的分離。在其他的實施 方案中，B細(xì)胞無需從淋巴組織分離因此節(jié)省了B細(xì)胞分離的花費和時間。無需B細(xì)胞分 離，淋巴組織可以直接用于獲得抗體可變基因序列的池，例如通過使用抗體特異性引物或 探針，例如基于抗體恒定區(qū)序列的引物或探針。
在一個實施方案中，可使用外周血(例如大約或至少或最多3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20ml或可從其推出的任何范圍)中成熟的循環(huán)的B細(xì)胞(記憶細(xì)胞和/或抗原分泌細(xì)胞 (ASC))。循環(huán)B細(xì)胞可以如實施例中所描述的通過磁分選程序(Jackson等人,2008 ；Scheid 等人,2009 ;Smith等人,2009 ;Kwakkenbos等人,2010)分離?？蛇x擇地，位于骨髓、脾或二 級淋巴器官中的為最終分化的B細(xì)胞的漿細(xì)胞可被分離并用于個體動物或人類中B細(xì)胞庫 的確定。在特定的方面，漿細(xì)胞可以從骨髓動員至循環(huán)系統(tǒng)中例如通過施用G-CSF(粒細(xì)胞 集落刺激因子)并且分離。
ASC是由表面標(biāo)志(例如多配體聚糖-1)區(qū)分的最終或者接近最終分化的B細(xì)胞 (包括漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞)。它們?nèi)鄙俦砻鍵gM和IgD，其他典型的B細(xì)胞表面標(biāo)志(例如 ⑶19)并且重要地它們表達抑制劑Blimp-Ι、轉(zhuǎn)錄因子Xbp-1并下調(diào)Pax-5。抗體分泌細(xì)胞 可從下列生成(i)產(chǎn)生低特異性“先天樣” IgM的BI細(xì)胞，(ii)來自不位于淋巴器官的濾 泡中(小結(jié)間)的B細(xì)胞并且包括通常產(chǎn)生較低親和性抗體的緣帶((MZ、IgM\lgD+、⑶27+) 細(xì)胞(后者幾乎在T細(xì)胞幫助不存在的情況下)，以及最后(iii)已經(jīng)經(jīng)過淋巴濾泡循環(huán)的 B2系的細(xì)胞。B2細(xì)胞直接從它們經(jīng)歷對更高抗原特異性的刪選(在無性系超突變之后)的 生發(fā)中心或在它們已經(jīng)初次進入記憶區(qū)室之后進行至漿階段。無論它們的確切來源，這些 細(xì)胞表達高親和性的主要IgG同種型的抗體并且構(gòu)成激發(fā)后保護性免疫響應(yīng)的主要組分。
漿細(xì)胞通常不能增殖或脫分化為較早的B細(xì)胞系。大多數(shù)漿細(xì)胞是短期存在的并 且在幾天內(nèi)死亡。相反，部分漿細(xì)胞占據(jù)為存活和持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的不斷的抗體分泌提供 適合的細(xì)胞因子微環(huán)境的“凹陷”(主要在骨髓中)，即它們是產(chǎn)生主要參與對再激發(fā)的保 護的抗體并且構(gòu)成“體液記憶”免疫響應(yīng)的細(xì)胞。
ASC分離的特別優(yōu)選的位點是存在大量表達對抗原特異性的抗體的漿細(xì)胞的骨髓。應(yīng)當(dāng)注意的是成熟成為漿細(xì)胞并且位于骨髓中的B細(xì)胞主要表達高親和性IgG抗體。使用基于本領(lǐng)域中熟知的細(xì)胞表面標(biāo)志選擇骨髓細(xì)胞中的成熟漿細(xì)胞，例如CD138++、CXCR4+和⑶45_^。成熟漿細(xì)胞還可基于轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1的高表達水平分離；用于分離Blimp-1S細(xì)胞的方法尤其是從攜帶與Blimp-1連接的受體蛋白的轉(zhuǎn)基因動物分離的方法是本領(lǐng)域中已知的。在另外的方面，記憶B細(xì)胞是從對在初級免疫響應(yīng)中遭遇的抗原特異性的活化的B細(xì)胞形成的。這些細(xì)胞能過長時間存活并且可在再次被暴露于相同抗原時能夠迅速響應(yīng)。在涉及特定抗原的首次(初級響應(yīng))感染的之后。響應(yīng)的天然(從未被暴露于抗原的)細(xì)胞增殖產(chǎn)生細(xì)胞的集落，其大部分分化為漿細(xì)胞，也稱為效應(yīng)物B細(xì)胞(其產(chǎn)生抗體)并且隨著感染的消退而消失，而其余部分作為可存活數(shù)年甚至一生的記憶細(xì)胞而存留VI1.核酸測序
任何測序方法，尤其是高通量測序方法，可被用于確定B細(xì)胞庫中的VH和VL核苷酸序列中的一種或多種。例如，VH和VL的核苷酸序列可使用通用引物通過454測序(Fox等人，2009)來確定而無需使得各個mRNA能夠精確定量的擴增?？商幚黹L度超過300bp的讀段(reads)以便進一步的分析(Weinstein等人,2009)。高通量測序技術(shù)的非限制性實例描述于下文。高通量測序技術(shù)預(yù)期降低用標(biāo)準(zhǔn)的熒光染料終止物方法可能的DNA測序花費。這些測序途徑中的大多數(shù)使用體外克隆步驟以擴增個體DNA分子，因為它們的分子檢測方法未敏感到足以單個的分子測序。乳液PCR連同油相中的水滴中弓丨物包被的小珠一起分離個體DNA分子。之后聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用DNA分子的克隆復(fù)制報備并且之后的固定化以便后來的測序。乳液PCR用于Marguilis等人(由454Life Sciences商品化)、Shendure和Porreca等人(也稱為“Polony測序)和SOLiD測序(由Agencourt,現(xiàn)在的AppliedBiosystems開發(fā))的方法中。體外克隆擴增的另一個方法是Illumina Genome Analyzer中所用的橋式PCR,其中當(dāng)引物與固體表面連接時擴增片段。由Stephen Quake的實驗室開發(fā)的單個分子方法(之后由Helic0S商業(yè)化)是例外其使用亮的熒光基團和激光激發(fā)以檢測固定至表面的個體DNA分子的焦磷酸測序事件，消除對分子擴增的需要。在并行化測序中，DNA分子物理結(jié)合于表面并且平行測序。與熒光染料終止物電泳測序相似，通過合成的測序使用DNA聚合酶確定堿基序列?？赡娼K止物方法(Illumina和Helicos所使用的)使用熒光染料終止物的可逆版本，一定時間加入一個核苷酸，實時監(jiān)測每個位置的熒光，通過封閉基團的反復(fù)去除以允許另一個核苷酸的聚合。焦磷酸測序(454所使用的)同樣使用DNA聚合，一定時間加入一個核苷酸種類并且通過由所連接的焦磷酸鹽的釋放所激發(fā)的光檢測并定量加至給定位置的核苷酸的數(shù)目。通過連接的測序使用DNA連接酶確定祀序列。在polony方法和SOLiD技術(shù)中所用的，其使用固定長度的，根據(jù)測序位置標(biāo)記的所有可能的寡核苷酸的池。將寡核苷酸退火并且連接；通過用于匹配序列的DNA連接酶的優(yōu)先的連接導(dǎo)致在該位置的核苷酸信號信息。在微流體Sanger測序中，在單個玻璃薄片(直徑約IOcm)上完成DNA片段的完全熱循環(huán)擴增以及它們經(jīng)由電泳的分離，因此減少了試劑使用以及花費。通過雜交測序是使用DNA微陣列的非酶方法。其序列有待確定的DNA的單個池被熒光標(biāo)記并且與包含已知序列的陣列雜交。來自陣列上給定點的強雜交信號在被測序的序列中識別其序列。質(zhì)譜可被用于確定在鏈終止反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA片段之間的質(zhì)量差別。
目前開發(fā)中的DNA測序方法包括將DNA聚合酶標(biāo)記(Scheid等人，2009)，當(dāng)DNA 鏈經(jīng)過納米孔時讀取序列以及顯微鏡基礎(chǔ)的技術(shù)，例如用于通過為了可視檢測和記錄而用較重元素(例如鹵素)標(biāo)記的核苷酸識別長的DNA片段(> 5，OOObp)中各個核苷酸位置的原子力顯微鏡(AFM)或電子顯微鏡。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)VH和VL池中的每個的小于IO5個讀段可能足以提供相應(yīng)于血清中存在的最富有抗體的可變基因序列的信息。
VII1.序列豐度確定
用于測序的自動分析的生物信息方法產(chǎn)生例如454讀段，統(tǒng)計學(xué)測序誤差分析和最終的CDR尤其是CDR3的識別和分類，抗體中最超變的區(qū)已經(jīng)由本發(fā)明人開發(fā)。
在某些實施方案中，例如，為了解釋測序/PCR不確定性，抗體序列尤其是CDR3序列可分組為家族，每個家族由一或兩個核苷酸或氨基酸不同的所有CDR3序列組成。
例如，抗體可變區(qū)序列的豐度水平可基于作為鑒別劑的CDR3序列。確定豐度水平的序列可以是包括相同⑶R3序列和與其具有至少80 %同源性例如85 %、90 %、95 %、96 %、 97%、98(%或99(%同源性的001 3序列的家族(氨基酸序列或核苷酸序列)。序列同源性使用BLAST2程序(Tatusova等人，1999)以默認(rèn)參數(shù)在美國生物技術(shù)信息國家中心(網(wǎng)址 ncb1. nlm. nih. gov)確定。例如，總共以由一套序列中至少I百分比的頻率所代表的相對豐度水平存在的序列可以是CDR3序列或具有與其I或2個氨基酸變化的序列的組合。例如， 第一序列可以O(shè). 7百分比的頻率存在并且每一個具有從其的單個氨基酸變化的第二、第三和第四序列每個以O(shè). 1%的頻率存在一因此豐度上的總的出現(xiàn)率是1. 1%并且因此優(yōu)勢抗體序列(以O(shè). 7%的頻率存 在)是可以用于抗體生成/表征的候選CDR3序列。
IX.抗體可變序列信息的使用
除了提供解釋血清抗體分析的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的參考數(shù)據(jù)庫之外，通過可變區(qū)尤其是 CDR序列和豐度分析的核酸信息同樣用于提供潛在的抗原特異性抗體或抗體片段。在某些方面，基于富有可變區(qū)尤其是CDR信息所獲得的Vh和Vk , λ文庫可被插入適于生產(chǎn)全長IgG 蛋白或蛋白片段的適合的表達載體(僅由Vh和Vk, λ鏈組成的scFv或Fab或單結(jié)構(gòu)域抗體)。由Vh和Vk , λ組成的文庫可產(chǎn)生重鏈和輕鏈的組合配對。
隨機配對的V1^P Vk, λ鏈中的一些可以是活化的而其他的將不能產(chǎn)生有功能的抗體。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于骨髓中抗原特異性漿細(xì)胞的非常高度的表現(xiàn)，非常大部分所獲得克隆表達功能性并且高親和性的重組抗體。在一個實例中，從由克隆的>5%的骨髓漿細(xì)胞分離的Vh和Vk , λ基因構(gòu)建的scFv文庫包含抗原特異性抗體。
例如，發(fā)明人分析在兩只小鼠中每只使用4種不同的蛋白質(zhì)抗原促生免疫(完全 Freund佐劑)之后5天分離的骨髓漿細(xì)胞中Vh和\轉(zhuǎn)錄水平。V-D-J使用和無性系超突變的模式被確定并且與骨髓漿細(xì)胞群中的表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。與骨髓漿細(xì)胞對抗體分泌的關(guān)鍵作用相一致，抗原特異性Vi^PVl cDNA被發(fā)現(xiàn)高度富集至總Ig RNA的1% -20%之間的水平。 對于所測試的四種抗原中的每一種，將2-4種Vh和\ cDNA以總Vh cDNA池的> 4 %的頻率表現(xiàn)。合成每種抗原并且來自每只小鼠的四種最富有Vh和 '基因，如下文討論的將重鏈和輕鏈配對并且將所獲的抗體片段在細(xì)菌中表達。重要地，通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)和BIACore分析發(fā)現(xiàn)在免疫的動物中平均> 80%的相應(yīng)于最高表達的V1^P '基因的抗體片段是抗原特異性的。因此，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從這些文庫手動ELISA篩選幾百個克隆足以允許具有高親和性和特異性的抗體的生成。其他克隆的手動ELISA篩選可用于顯示產(chǎn)生不同套抗體的Vh和Vk, λ基因的不同組合。這一方法簡單并且迅速并且發(fā)明人相信可能取代雜交瘤技術(shù)用于從動物分離抗體。X.定量血清抗體分析為了識別循環(huán)抗體的 CDR區(qū)尤其是CDR3區(qū)的富有氨基酸序列的池，MS鳥槍蛋白質(zhì)組或蛋白測序方法可被用于確定氨基酸序列?？墒褂么_定其構(gòu)成肽的氨基酸序列的任何蛋白測區(qū)方法。蛋白測序的兩個主要的直接方法是質(zhì)譜和Edman降解反應(yīng)。同樣可能的是從編碼蛋白質(zhì)的DNA或mRNA序列(如果這是已知的)生成氨基酸序列。然而，還有可用于獲得關(guān)于蛋白序列的更多限制信息的多種其他反應(yīng)并且可被用作前文提及的測序方法的準(zhǔn)備工作以克服其中的特異性缺陷。例如，基于將蛋白質(zhì)降解為肽并且使用隨機質(zhì)譜將它們測序以及自動數(shù)據(jù)庫搜索的鳥槍蛋白質(zhì)組策略可以是為了識別血清抗體序列而選擇的方法?！傍B槍蛋白質(zhì)組”是指復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物的直接分析以迅速生成混合物中蛋白質(zhì)補體的完整概況。這一方法已經(jīng)通過使用結(jié)合了多維高壓液相層析(LC/LC)隨機質(zhì)譜(MS/MS)和數(shù)據(jù)庫搜索算法的多維蛋白質(zhì)識別技術(shù)(MudPIT)而變得容易。A.1gG 分級特定種類的Ig蛋白可通過例如使用蛋白質(zhì)A(或者用于其他主要Ig類型的親和純化的抗IgA和抗IgM抗體)的親和層析來分離。在某些方面，抗體或抗體片段例如來自使用木瓜酶的純化Ig的降解和FAB純化的FAB部分可因與所期望的抗原或病原體(例如癌細(xì)胞、腫瘤抗原或感染劑)或者宿主組織的結(jié)合而親和性富集以便分離疑似在自動免疫中具有作用的抗體?？贵w可在變性條件下洗脫。在另外的實施方案中，可生成血清來源FAB的幾個部分或池，包括下列那些(a)對抗原富集的，(b)對宿主組織富集的和(C)具有不相關(guān)或未知特異性的抗體。B.蛋白水解片段化為了定量鳥槍蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析，抗體或抗體片段例如FAB可使用在CDR3中不足但是存在于鄰近的框架區(qū)的氨基酸/氨基酸對后剪切的蛋白酶降解。用于蛋白質(zhì)組處理的適合的蛋白酶可通過V基因序列數(shù)據(jù)庫的生物信息分析來識別。在一個實例中，F(xiàn)AB部分于37°C經(jīng)受使用測序級胰蛋白酶(Sigma)的蛋白水解4小時。作為可選擇的方法，蛋白酶GluC(NEB)和LysC(Sigma)的組合可取代胰蛋白酶使用以生成在計算測試中提供對CDR3的更好的覆蓋的不同套的蛋白水解肽(即以使剪切發(fā)生在⑶R3兩側(cè)的位置并由此產(chǎn)生具有完整⑶R3的肽)。在某些實施方案中，⑶R3肽可以經(jīng)由⑶R3序列末端獨有的Cys與允許這些肽純化的巰基特異性試劑的特異性軛合從不相關(guān)的肽富集。發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了采用用于肽生成和含巰基的⑶R3肽的Cys特異性斷開的適當(dāng)?shù)牡鞍酌傅慕M合的程序，其產(chǎn)生由至少30%的CDR3肽序列組成的肽混合物。在一個實例中，CDR3肽經(jīng)由可逆的巰基特異性生物素化富集。在另一個實施例中，CDR3肽與允許MS分析期間它們的特定激發(fā)和檢測的特定的生色團反應(yīng)。因為CDR3肽幾乎普遍(> 99% )含有半胱氨酸、生物素化的巰基特異性交聯(lián)劑被用于為質(zhì)譜分析親和分離這些肽，由此大大簡化譜圖的復(fù)雜性。
C.鳥槍MS (質(zhì)譜)蛋白質(zhì)組
在某些示例性的方面，抗體分子的肽可以通過反相層析和串聯(lián)納電噴霧離子化/ 高分辨率隨機質(zhì)譜，使用已經(jīng)廣泛接受的程序(Ong和Mann，2005 ；Pandey和Mann，2000 ； Shevchenko 等人，1996 ；Hunt 等人，1986 ；Link 等人，1999 ；ffashburn 等人，2001 ；Lu 等人， 2007)和傅立葉轉(zhuǎn)換LTQ-Orbitrap質(zhì)譜(Hu等人，2005)來解析以從CDR3和其他FAB來源的肽收集幾十萬隨機質(zhì)譜。
例如，將肽在運行5%至38%乙腈，O.1 %甲酸的洗脫梯度的反相Zorbax C-18 柱(Agilent)上分離。肽通過納米電噴霧離子化直接洗脫至LTQ-Orbitrap質(zhì)譜(Thermo Scientific)。使用以IOOk解析度收集的母離子質(zhì)譜(MSI)使得可以數(shù)據(jù)依賴性離子選擇。 可選擇具有已知的>+1電荷的離子用于CID裂解譜分析(MS2)以便降低強度，具有每MSl 循環(huán)所選擇的12個母離子的最大值。用為30秒鐘兩次MS2所選擇的離子激活動態(tài)排出。 在LC-MS/MS運行中相應(yīng)于來自重鏈和輕鏈的恒定區(qū)的肽而識別的離子可在隨后的實驗中從數(shù)據(jù)依賴性選擇排除以便增加來自可變區(qū)的肽的選擇。
D. MS蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析
來自相同的所受對象的B細(xì)胞的可變基因測序數(shù)據(jù)被用于補充蛋白序列數(shù)據(jù)庫以便解釋鳥槍蛋白質(zhì)水解中的肽質(zhì)譜(MarCOtte，2007)。在樣品特異性序列數(shù)據(jù)庫的幫助下，我們從隨機質(zhì)譜識別了⑶R3肽(使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Keller等人,2002 ;Nesvizhskii等人， 2009)控制錯誤發(fā)現(xiàn)率)。
鳥槍蛋白質(zhì)組中的幾個最新進展使得蛋白質(zhì)能夠定量至 2倍的絕對精確度而無需引入另外的對同種型標(biāo)記或內(nèi)部定標(biāo)肽的需要(Lu等人,2007 ;Malmstrom等人,2009 ； Silva 等人，2006a ；Vogel 和 Marcotte, 2008 ；Ishihama 等人，2005 ；Liu 等人，2004)。在這些方法中，有兩種非常適于個體IgG定量APEX法基于與蛋白質(zhì)有關(guān)的隨機質(zhì)譜的加權(quán)系數(shù)(加權(quán)合并了肽可觀測性的機器學(xué)習(xí)估 量(Lu等人，2007 ;Vogel，2008)，而平均粒子密度法基于質(zhì)譜離子層析峰體積(Silva等人，2006a)。例如，兩種方法都可以用于測量含血清樣品中所識別的抗原特異性IgG中的每一種的豐度。組合(Malmstrom等人,2009)以及單獨的肽定量方法同樣可作為替換方案使用?？墒褂脺p去非CDR3肽的算法。在這些所測量的豐度的基礎(chǔ)上，可將樣品中至少50或100個最高豐度Vh和\按級別分級。
例如，樣品特異性蛋白序列數(shù)據(jù)庫是從高通量V區(qū)cDNA轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)產(chǎn)生的。通過 454測序以> 8個讀段來表示的Vh和\基因可被編譯為數(shù)據(jù)庫，其反過來被加至連鎖的正向/反向序列蛋白編碼數(shù)據(jù)庫。使用作為Bioworks軟件包(Thermo Scientific)的一部分的Sequest搜索算法在這一數(shù)據(jù)庫中搜索LC-MS/MS數(shù)據(jù)。應(yīng)用濾器以確保如下高置信度序列識別ACN彡O. 250 ；XCorr = +2、+3和彡+4個電荷的2. O、2. 5和3. O ;并且精確度 ^ 10. Oppm0
在某些實施方案中，與不同B細(xì)胞來源(例如表達其產(chǎn)品存在于血清中的Vh和' 基因的特定的器官特異性ASC群)的不同V基因池信息偶聯(lián)的氨基酸序列分析可被用來識別特定血清抗體是否可能在骨髓、在二級淋巴組織或在持續(xù)感染的實例中在三級淋巴組織中優(yōu)先發(fā)生。同樣可解決特定抗體由已經(jīng)遷移至不同器官的漿細(xì)胞分泌的可能性。在系統(tǒng)水平，發(fā)明人可以使用這一信息以定量形式估計不同區(qū)室對體液免疫的貢獻并且可以生成在免疫響應(yīng)的不同階段中所涉及的抗體或抗體片段。X1.抗體生成和表征上文描述的某些實施方案引致對B細(xì)胞或所選擇的淋巴組織中感興趣的富有血清抗體或最富有可變區(qū)序列的識別和定量。這些信息可用于開發(fā)具有所期望的結(jié)合親和性或抗原響應(yīng)的抗體或抗體片段。在某些方面，可估計它們的結(jié)合親和性或治療應(yīng)用性。例如，對癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的抗體或抗體片段可以從富有血清多克隆抗體池生成。在另外的實施方案中，對用于免疫任何動物的抗原具有特異性的抗體或抗體特異性片段可通過分析B細(xì)胞中可變區(qū)核酸的序列和豐度信息來提供或者直接從淋巴組織提供。A.用于抗體生成的基因合成
為了生成具有所期望的結(jié)合特異性或特性的抗體或抗體片段，可合成V基因，組裝為FAB或IgG并表達?？苫谕ㄟ^上文所描述的方法獲得的序列信息通過高通量基因合成生成V1^P '基因。例如，可使用自動基因合成。簡單地說，使用嚴(yán)格控制條件下的內(nèi)外成核PCR反應(yīng)生成基因片段(長度200至500個核苷酸)以確保構(gòu)建所期望的最終片段。隨后，縫線重疊延伸PCR(stitch-overlap extension PCR)被用于合成感興趣的基因。使用寡核苷酸合成儀工作列表和用于合成和組裝的機器人操作腳本將這些片段和相關(guān)重疊的設(shè)計自動化。以目前的構(gòu)型，每次機器人組裝運行(4小時)獲得48千堿基的通量。為了保持序列的最大保守和隨后用以維持相同的長度的在任一端的“填充”，序列的算法允許使用基因重疊寡核苷酸組裝策略并且同樣確保最大的寡核苷酸再使用。50個Vh和50個'基因(即> 38，OOObp的DNA)的現(xiàn)有通量平臺由一名研究人員在一周內(nèi)并且以< $2，000的試劑花費合成并且驗證正確的0RF。B. Vh和八的配對為了表達，特定的Vh必須與同源'配對。配對問題可如下解決首先發(fā)明人已經(jīng)經(jīng)驗性地發(fā)現(xiàn)樣品中Vh和\的正確配對與樣品中蛋白的分級級別豐度良好相關(guān)。例如，第五最富有Vh與第五最富有\(zhòng)配對。到目前為止用這一方法，使用Vh和\的配對生物信息學(xué)分級級別信息，發(fā)明人已經(jīng)在將來自四個不同小鼠的％和'基因配對以生產(chǎn)高親和性抗原特異性抗體上取得了 75%的成功。另外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)即使對于配對來說最佳'不是基于蛋白質(zhì)組分析具有相似豐度的'但是因為抗原識別是由Vh序列支配的，因此仍然可以觀察到抗原結(jié)合，只是親和性較低。在某些方面，VH和VL鏈可通過將相關(guān)的VH和VL序列分組在一起而識別。例如，所識別的VH和/或VL序列可基于序列的相關(guān)性進行比對并且成簇。例如每組可包含彼此僅無性系超突變的結(jié)果不同的抗體序列。在某些情況下，序列的簇可被分級，并且所述簇的級別被用作VH和VL序列之間成對的指導(dǎo)。在還有另外的方面，VH和VL鏈可基于組合的親和性測定來配對。在這一情況下，用于測試的VH和VL配對可由豐度分級和/或可由上文概括的相關(guān)序列的成簇來指導(dǎo)。配對同樣可通過其他方法解決或確認(rèn)。例如，用Vh和候選'探針(例如從豐度分析識別的)對固定漿細(xì)胞進行原位雜交(ISH)。ISH可使用適當(dāng)?shù)臋C器人自動化容易地以高通量方式應(yīng)用?？蛇x擇地，F(xiàn)AB池的ES1-MS(電噴霧電離質(zhì)譜法)與這些譜圖與所期望 的分子量的匹配相偶聯(lián)，可在某些情況下確定Vh和\配對。
C.抗體表達
在另外的方面，合成的VH和VL基因可被插入適合的載體以便表達，例如FAB在大 腸桿菌細(xì)胞中或全長IgG經(jīng)由HEK293細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染。
候補抗體或抗體片段與抗原之間的結(jié)合之后可通過結(jié)合檢測和定量的任何方法 特別是ELISA來估計。例如，癌特異性抗體或抗體片段可通過經(jīng)由抗體的熒光標(biāo)記之后的 熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的癌或宿主細(xì)胞結(jié)合來表征。
使用常規(guī)程序，根據(jù)本發(fā)明的某些方面的抗體可用可檢測的標(biāo)記來標(biāo)記或者可與 效應(yīng)分子例如藥物比如抗菌劑或毒素或酶軛合并且本發(fā)明預(yù)期這些標(biāo)記的抗體或抗體軛 合物。
本發(fā)明中可用或生產(chǎn)的抗體可以是完整抗體或其抗原結(jié)合片段并且通?？梢詫?于任何免疫球蛋白類型。因此，例如其可以是IgM或IgG抗體?？贵w或片段可以是動物例 如哺乳動物來源的并且可以是例如小鼠、大鼠、綿羊或人類來源的。優(yōu)選地，其可以是重組 抗體片段，即使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗體或抗體片段。這樣的重組抗體片段可以包括上 文所識別的優(yōu)勢CDR或可變結(jié)構(gòu)域序列。
特定重組抗體或抗體片段包括，(I)具有其至少一部分來源于不同抗體的抗原結(jié) 合位點的那些，例如其中一個抗體的超變或互補決定區(qū)被移植至第二個不同抗體的可變框 架區(qū)中的那些(如在例如EP 239400中所描述的)；(2)重組抗體或片段，其中非Fv序列已 經(jīng)被來自其他的不同抗體的非Fv序列取代(如例如EP 171496、EP 173494和EP 194276 中描述的)；或(3)大致上具有天然免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的重組抗體或片段，但是其中鉸鏈區(qū)具 有與天然免疫球蛋白中存在的那些不同的半胱氨酸數(shù)目但是其中重組抗體或片段的表面 口袋上的一個或多個半胱氨酸殘基取代天然免疫球蛋白中存在的另一種氨基酸殘基(如 例如WO 89/01782和WO 89/01974中所描述的)。
文本例如Harlow和Lane (1998)的教導(dǎo)進一步詳述了抗體、抗體片段、它們的制備 和用途。
抗體或抗體片段可以是多克隆或單克隆來源的。其可以是對于至少一個表位特異 性的。
抗原結(jié)合抗體片段包括例如通過全抗體的蛋白水解裂解獲得的片段，例如 F(ab’)2、Fab’或Fab片段，或通過重組DNA技術(shù)獲得的片段，例如Fv片段(如例如WO 89/02465中所描述的)。
XI1.治療應(yīng)用
本發(fā)明可包括具有廣泛范圍治療應(yīng)用的方法，例如癌治療、增強免疫響應(yīng)、疫苗或 者感染性疾病或自身免疫性疾病的治療
在一些實施方案中，本發(fā)明可用于在緩解中的癌患者中抗體響應(yīng)的定量分子去卷 積以確定可有利于在患者中根除腫瘤的循環(huán)系統(tǒng)中高度表現(xiàn)的抗體的序列和豐度。這些抗 體自身作為治療劑或用于識別可作為治療靶的癌細(xì)胞上的新抗原都是非常有用的。相似地 在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可用于識別保護患者免受特定感染劑感染的抗體。這些 抗體可從已經(jīng)被感染并且之后從感染中康復(fù)的患者或可選擇地從已接種的患者識別?？缮a(chǎn)這些抗體或抗體片段并且估計它們對癌細(xì)胞的特異性和細(xì)胞毒性或者對感染劑的中和效能。通過表征其抗體組分的相對豐度和氨基酸序列來去卷積血清多克隆響應(yīng)以及之后單獨估計癌細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞毒性的能力可提供關(guān)于對惡性腫瘤的適當(dāng)?shù)拿庖唔憫?yīng)的性質(zhì)的史無前例的有價值的信息。這些所識別的抗體可引致強有力的細(xì)胞毒性癌治療的發(fā)現(xiàn)以及癌檢測和治療所用的新型腫瘤抗原的識別。例如，通過同種造血干細(xì)胞(HSC)移植之后處于緩解中的患者中的抗體響應(yīng)的去卷積，可通過上文所描述的方法識別用于白血球過多癥的治療抗體。之后可通過藥理學(xué)工程和動物評估來獲取有希望的抗體。本發(fā)明的某些方面可包括通過本發(fā)明的某些方面所生成的抗體或抗體片段向非免疫個體(例如經(jīng)歷化療/放療、用于器官移植的免疫抑制的，歸因于潛在條件例如肥胖、創(chuàng)傷等免疫力低下的以及非常年輕或非常年長的患者)的被動轉(zhuǎn)移。例如，賦予免疫的抗 體的序列可通過尋找已經(jīng)克服感染的患者中過度表現(xiàn)的VH和VL序列來確定。這些保護性抗體可以遺傳水平重新合成，在大腸桿菌(或其他表達系統(tǒng))中過表達并且純化。所獲得的純化的重組抗體之后可作為被動免疫治療施用于患者?？贵w同樣可從商業(yè)供應(yīng)商例如Operon Technologies Inc. ,USA(在網(wǎng)址operon. com)通過簡單地為它們提供有待被制造的抗體的序列而訂購。疫苗接種通過用病原體來源的抗原引發(fā)免疫系統(tǒng)來防止感染。疫苗接種受到對病原體來源的抗原的單次或多次暴露的影響并且允許抗體成熟以及B細(xì)胞克隆擴張而沒有受到充分發(fā)展的感染過程的有害影響。T細(xì)胞參與同樣在影響患者的疫苗接種上具有很大重要性。本發(fā)明的某些方面同樣可被用于伴隨對抗體響應(yīng)的定性和定量評價來監(jiān)測使用實驗性疫苗的免疫處理。例如，一個或多個所受對象被給予實驗性疫苗并且從所受對象擴增VH和VL序列并且如上文所描述的分析抗體譜。隨著疫苗接種，給定的抗體可變結(jié)構(gòu)域或⑶R序列的增加的豐度可引致保護性抗體池的識別。證實之后，這些保護性抗體可別被用于需要這些保護的患者的治療，例如受到微生物例如病毒感染的患者。XII1.實施例下列實施例被包括以證實本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是在實施例中所公開的技術(shù)遵循發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的代表技術(shù)以在本發(fā)明的實行中良好地起作用并且因此可被認(rèn)為構(gòu)成用于其實行的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可在所公開的特定實施方案中進行許多變化并且仍獲得類似或相似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1:免疫程序?qū)⒌鞍卓乖?例如純化的人類互補蛋白Cls(CalBiochem)，純化的雞卵白蛋白(OVA7Sigma)或重組的細(xì)菌表達的IgH轉(zhuǎn)錄的人類B細(xì)胞調(diào)節(jié)劑(BRIGHT))懸浮在1. Omg/ml無菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在初級免疫當(dāng)天，將25 μ I抗原溶液與25 μ I弗氏完全佐劑(CFA，Pierce Biotechnology)和50 μ I無菌PBS徹底混合并且儲存在冰上。將6-8周大的雌性Balb/c小鼠養(yǎng)在常規(guī)分欄空間中并且用正常飼料維持。注射之前，將小鼠從尾靜脈抽血并且收集約25 μ I血液并且儲存于_20°C以便之后的分析。第I天被指定為進行初級免疫的日期。用26號針頭每只小鼠皮下注射100 μ I的抗原-CFA混合物至后足墊(backpad)。由動物住院醫(yī)師每日監(jiān)測小鼠并且每周兩次更換籠子。
為了次級免疫，將25 μ I抗原溶液與25 μ I弗氏完全佐劑(CFA，Pierce Biotechnology)和50 μ I無菌PBS徹底混合并且儲存在冰上。在第21天，以每只小鼠 100 μ I的抗原-1FA混合物腹膜內(nèi)給予小鼠次級免疫。在第26天，通過CO2窒息處死小鼠并且收集血液、淋巴結(jié)、脾、股骨和脛骨。為了三級以及隨后所需的免疫，將25μ I抗原溶液與25 μ I弗氏完全佐劑(CFA,Pierce Biotechnology)在50 μ I無菌PBS中徹底混合,并在次級免疫后兩周注射至動物中并且如果需要每兩周進行隨后的免疫。
實施例2 :從小鼠骨髓分離漿細(xì)胞(CD138+CD45R(B220)-CD49b_)群
從自免疫的小鼠采集的脛骨和股骨除去肌肉和脂肪組織。用普通手術(shù)剪修剪脛骨和股骨的末端并且用26號胰島素注射器(Becton Dickinson, BD)清洗出骨髓。將骨髓組織收集在無菌過濾的緩沖液#l(PBS/0. 1%牛血清白蛋白(BSA)/2mM乙二胺四乙酸(EDTA)) 中。通過使用機械破碎過濾通過70-um細(xì)胞過濾器(BD)收集骨髓細(xì)胞并用20ml的PBS清洗并且收集在50ml試管中(Falcon，BD)。之后以1200RPM于4°C離心骨髓細(xì)胞10分鐘。 將上清移去并且用3. Oml的RBC溶菌緩沖液(eBioscience)重懸細(xì)胞團并且于25°C輕柔振蕩5分鐘。之后用20ml的PBS稀釋細(xì)胞懸浮液并且以1200RPM于4°C離心10分鐘。移去上清液并且將細(xì)胞團在1. Oml的緩沖液#1中重懸。
將每個分離的骨髓細(xì)胞懸浮液分別用7. 5ug和IOug的生物素化的大鼠抗小鼠 CD45R(B220)和生物素化的大鼠抗小鼠CD49b (eBioscience)孵育。在實施例9中，每個分離的骨髓細(xì)胞懸浮液分別用2. 5ug和1. 5ug的生物素化的大鼠抗小鼠⑶45R(B220)和生物素化的大鼠抗小鼠⑶49b (eBioscience)孵育。將細(xì)胞懸浮液于4°C旋轉(zhuǎn)20分鐘。之后將細(xì)胞懸浮液以2，000RPM于4°C離心6分鐘，移去上清并且將細(xì)胞團在1. 5ml的緩沖液#1中重懸。將鏈霉親和素軛合的M280磁珠(Invitrogen)根據(jù)制造商程序清洗并且重懸。向每個細(xì) 胞懸浮液加入50 μ I磁珠并且將混合物于4°C旋轉(zhuǎn)20分鐘。之后將細(xì)胞懸浮液放置在 Dynabead磁體(Invitrogen)中并且收集上清(負(fù)極部分，未與小珠軛合的細(xì)胞)，廢棄與小珠軛合的細(xì)胞(可選擇地，小珠結(jié)合的細(xì)胞可被保留用于之后的分析)。
任選地，之后將負(fù)極部分細(xì)胞與2. 5 μ g生物素化的大鼠抗小鼠⑶45R(B220)和生物素化的大鼠抗小鼠⑶49b兩者孵育并且于4°C旋轉(zhuǎn)20分鐘。之后將細(xì)胞以2，000RPM于 4°C離心6分鐘，移除上清液并且將細(xì)胞團在1. Oml的緩沖液#1中重懸。向每個細(xì)胞懸浮液加入50 μ I磁珠并且將混合物于4°C旋轉(zhuǎn)20分鐘。之后將細(xì)胞懸浮液放置在Dynabead 磁體(Invitrogen)中并且收集上清(負(fù)極部分，未與小珠軛合的細(xì)胞)，廢棄與小珠軛合的細(xì)胞(可選擇地，小珠結(jié)合的細(xì)胞可被保留用于之后的分析)。
將預(yù)清洗的鏈霉親和素M280磁珠與生物素化的大鼠抗小鼠⑶138 (BD Pharmingen)以每25 μ I磁珠0. 75 μ g抗體于4°C孵育30分鐘。之后用磁體根據(jù)制造商程序清洗小珠并且在緩沖液#1中重懸。將預(yù)先收集的負(fù)極細(xì)胞部分(加倍貧化的CD45R/ B220+和⑶49b+細(xì)胞)與50 μ I的⑶138軛合的磁珠孵育并且于4°C旋轉(zhuǎn)30分鐘。之后將細(xì)胞置于磁體上并且用緩沖液#1清洗3次，廢棄未與小珠結(jié)合的負(fù)極(CD138_)細(xì)胞(或保留僅用于分析)。收集正極⑶138+小珠結(jié)合細(xì)胞并于4°C儲存直到進一步處理。
漿細(xì)胞純化處理的流式細(xì)胞分析顯示于圖3。
實施例3 :抗體分泌細(xì)胞(ASC)和記憶B細(xì)胞的分離
小鼠記憶B細(xì)胞。按照環(huán)境優(yōu)生學(xué)從免疫的小鼠采集二級淋巴器官(脾和淋巴結(jié))。將組織收集在無菌過濾的緩沖液#l(PBS/0. 1%牛血清蛋白(BSA)/2mM EDTA)中。通過使用機械破碎過濾通過70-um細(xì)胞過濾器(BD)收集脾和淋巴結(jié)細(xì)胞并用20ml的PBS清洗并且收集在50ml試管(Falcon，BD)中。之后以1200RPM于4°C離心脾和淋巴結(jié)細(xì)胞10分鐘。將上清移去并且用3. Oml的RBC溶菌緩沖液(eBioscience)重懸細(xì)胞團并且于25°C輕柔振蕩5分鐘。之后用20ml的PBS稀釋細(xì)胞懸浮液并且以1200RPM于4°C離心10分鐘。移去上清液并且將細(xì)胞團在1. Oml的緩沖液#1中重懸。此外，通過心臟穿刺收集全血。將全血以1:1的體積加至中性粒細(xì)胞分離液(histopaque solution) (Sigma),避免內(nèi)含物混合。將血液_中性粒細(xì)胞分離液以1，600RPM于23°C離心30分鐘而無需離心制動。梯度離心之后分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)層并且通過與清洗緩沖液(PBS，2. 5%胎牛血清(FBS)，ImM乙二胺四乙酸(EDTA)) —起離心而清洗兩次。之后將細(xì)胞在緩沖液#1中重懸。將脾和淋巴結(jié)生發(fā)中心細(xì)胞用凝集原生物素標(biāo)記并且之后用鏈霉親和素磁珠(Invitrogen)分離生發(fā)中心記憶B細(xì)胞。
人類ASC和記憶B細(xì)胞。分離來自人類志愿者的PBMC并且之后用熒光抗體染色。使用FACS通過⑶19高/⑶20低/⑶3陰性(⑶19high/⑶201ow/⑶3neg)上的門控以及之后⑶27高/⑶38高上的二次分選分離PBMC以獲得純的ASC和記憶B細(xì)胞群(Wrammert等人，2008)。實施例4 :制備用于高通量DNA測序的可變輕鏈(VL)和重鏈(VH)基因RNA分離將如實施例2和3中描述所分離的⑶138+⑶45ΙΓ骨髓漿細(xì)胞或外周血ASC和B細(xì)胞以2，000RPM于4°C離心5分鐘。之后用TRI試劑溶解細(xì)胞并且根據(jù)Ribopure RNA分離試劑盒(Ambion)中的制造商程序分離全RNA。通過使用oligodT樹脂和Poly (A)純化試劑盒(Ambion)根據(jù)制造商程序從全RNA分離mRNA。用ND-1000分光光度計(Nanodrop)測量mRNA濃度。PCR擴增將所分離的mRNA用于通過使用Maloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT, Ambion)的逆轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA合成。為了 cDNA合成，將50ng的mRNA用做模板并且使用oligo (dT)引物。根據(jù)Retroscript試劑盒(Ambion)的制造商程序進行RT-PCR。cDNA構(gòu)建后，使用2ul的未純化的cDNA產(chǎn)物和已有的VL和VH簡并引物混合物進行PCR擴增以擴增VL和VH基因(Krebber等人，1997 ;Mazor等人，2007)。引物的完整列表可在表I中找到。表1-用于八和Vh基因的PCR擴增的引物混合物Vl-正向引物 序列SEQ ID NO:AGC CGG CCA TGG CGG AYA TCC AGC TGA CTC 67 AGCCAGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TTC TCW CCC 68 AGTCAGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGM TMA 69 CTC AGT CAGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGY TRA CAC 70 AGTCAGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TRA TGA 71 CMC AGT CAGC CGG CCA TGG CGG AYA TTM AGA TRA 72 MCC AGT CAGC CGG CCA TGG CGG AYA TTC AGA TGA YDC 73 AGTCYarivL-FORlYarivL-FOR 2YarivL-FOR 3YarivL-FOR 4YarivL-FOR 5YarivL-FOR 6YarivL-FOR 7
YarivL-FOR 8
YarivL-FOR 9
YarivL-FOR 10
YarivL-FORll
YarivL-FOR 12
YarivL-FOR 13
YarivL-FOR 14
YarivL-FOR 15
YarivL-FOR 16
YarivL-FOR 17YarivL-FOR ILambdaVl -反向引物
YarivL-REV I
YarivL-REV 2YarivL-REV 4
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TYC AGA TGA 74CACAGAC
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TTC TCA WCC 75AGTC
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG WGC TSA 76CCCAATC
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTS TRA TGA CCC 77ARTC
AGC CGG CCA TGG CGG AYR TTK TGA TGA CCC 78ARAC
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CBC 79AGKC
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TAA CYC 80AGGA
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CCC 81AGWT
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CAC 82AACC
AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTT TGC TGA CTC 83AGTC
AGC CGG CCA TGG CGG ARG CTG TTG TGACTC AGGAATC84
GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTG ATT TCC 85AGC TTG G
GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTT ATT TCC 86AGC TTG G
GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTT ATT TCC 8權(quán)利要求
1.一種確定循環(huán)系統(tǒng)中的抗體序列的方法，包括 a)獲得由所受對象的成熟B細(xì)胞編碼的VH和VL基因譜的核酸以及相應(yīng)的氨基酸序列信息； b)獲得來源于所述所受對象的血清抗體的肽的質(zhì)譜；和 c)使用所述序列信息和所述質(zhì)譜確定循環(huán)系統(tǒng)中一個或多個抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述成熟B細(xì)胞來自外周血。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞來自淋巴器官。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟a)包括確定由所述成熟B細(xì)胞編碼的VH和VL基因的核酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞中的所述核酸序列是通過高通量DNA測序確定的。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述高通量測序包括邊合成邊測序、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括記憶B細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括漿細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)包括使用高效液相色譜(HPLC)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)進一步包括分離或富集所選擇類型的血清抗體。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)進一步包括分離或富集與預(yù)定抗原結(jié)合的血清抗體。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)進一步包括分離或富集血清抗體中含CDR3的片段。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)進一步包括使用基于所述序列信息所確定的蛋白酶從血清抗體制備含CDR3的肽片段。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述所受對象患有腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或者已經(jīng)被免疫。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述所受對象具有或者已經(jīng)被暴露于為感染劑、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞或自身抗原的抗原。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括報告步驟c)中的確定。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進一步包括確定所述血清抗體的氨基酸序列的豐度水平。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進一步包括識別至少具閾值水平豐度的抗體序列。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其進一步包括生成包含一個或多個的所述富有氨基酸序列中的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中每個所生成的抗體或抗原結(jié)合片段中包含相似豐度的氨基酸序列的VH和VL或者是相似豐度的高同源性氨基酸序列簇的一部分。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中步驟c)中生成的抗體或抗體結(jié)合片段以IOOpM至.5 μ M的單價親和性結(jié)合所述所受對象具有或者已經(jīng)被暴露于的抗原。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其進一步包含評估所生成的抗體或抗原結(jié)合片段對預(yù)定抗原的結(jié)合親和性。
23.—種識別循環(huán)系統(tǒng)中富有抗體序列的方法，包括 a)在所受對象的含有血清的樣品中確定相應(yīng)于抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列以提供血清抗體序列；和 b)識別相對于其他血清抗體序列表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的抗體序列。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟a)包括獲得來源于所述所受對象的血清抗體的肽的質(zhì)譜。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所確定的氨基酸序列包括完整的VH和VL區(qū)的序列。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所確定氨基酸序列包括完整抗體V結(jié)構(gòu)域的序列。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中確定完整抗體V結(jié)構(gòu)域的序列包括配對相似豐度的VH和VL區(qū)、基于同源性比對配對VH和VL區(qū)或基于親和測定配對VH和VL區(qū)。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其中確定相應(yīng)于所述VH和VL區(qū)的氨基酸序列包括確定所述VH和VL區(qū)的至少互補決定區(qū)3 (⑶R3)的氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟a)進一步包括使用基于所述所受對象的成熟B細(xì)胞中VH和VL基因的至少CDR3的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列的序列信息確定的蛋白酶從血清抗體制備含CDR3的肽片段。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟a)進一步包括獲得所述所受對象的成熟B細(xì)胞中VH和VL基因的至少CDR3的核酸序列的序列信息，其中所述核酸序列信息被用于確定所述血清抗體的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中獲得所述核酸序列信息包括確定所述B細(xì)胞中的核酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所確定的核酸序列包括VH和VL基因的序列。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述B細(xì)胞中的核酸序列通過高通量DNA測序來確定。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述高通量測序包括邊合成邊測序、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括記憶B細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括漿細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟a)進一步包括分離或富集所選擇類型的血清抗體。
38.如權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟a)進一步包括分離或富集與預(yù)定抗原結(jié)合的血清抗體。
39.如權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟a)進一步包括分離或富集血清抗體中含CDR3的片段。
40.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述方法包括通過自動化方法確定所述血清抗體的氨基酸序列的豐度水平。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中確定所述氨基酸序列的豐度水平包括質(zhì)譜定量方法。
42.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述閾值豐度水平是約5至約500μ g/ml的濃度。
43.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述豐度的閾值水平是所述血清抗體中50個最富有的含CDR3的氨基酸序列中的任何一個的水平。
44.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述所受對象患有腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或者已經(jīng)被免疫。
45.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述所受對象具有或者已經(jīng)被暴露于為感染劑、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞或自身抗原的抗原。
46.如權(quán)利要求23所述的方法，其進一步包括報告步驟a)中的確定或步驟b)中的識別。
47.如權(quán)利要求23所述的方法，其進一步包括步驟c)，即生成包含一個或多個的所述富有氨基酸序列中的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段的。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中每個所生成的抗體或抗原結(jié)合片段中包含相似豐度氨基酸序列的VH和VL。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其中步驟c)中所生成的抗體或抗原結(jié)合片段以約IOOpM至5 μ M的單價親和性與所述所受對象具有或已經(jīng)被暴露于的抗原結(jié)合。
50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述步驟c)包括在異源系統(tǒng)中的表達或體外蛋白合成的使用。
51.一種生成一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段的方法，包括 a)獲得相應(yīng)于所受對象的血清中存在的抗體的VH和VL區(qū)的抗體氨基酸序列的序列和豐度信息； b)識別表現(xiàn)出如富有氨基酸序列的至少閾值水平豐度的那些序列；和 c)生成包含一個或多個所確定的富有氨基酸序列的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟a)包括確定所述血清抗體的VH和VL區(qū)的至少⑶R3的氨基酸序列。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中步驟a)包括獲得來源于所述血清抗體的肽的質(zhì)
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所確定的氨基酸序列包括完整VH和VL區(qū)的序列。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所確定的氨基酸序列包括完整抗體V結(jié)構(gòu)域的序列。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中確定完整抗體V結(jié)構(gòu)域的序列包括將為相似豐度序列的VH和VL區(qū)配對；基于同源性比對配對VH和VL區(qū)或基于結(jié)合測定配對VH和VL區(qū)。
57.如權(quán)利要求51所述的方法，其中獲得相應(yīng)于VH和VL區(qū)的抗體氨基酸序列的序列和豐度信息包括獲得所述VH和VL區(qū)的至少互補決定區(qū)3 (CDR3)的抗體氨基酸序列的序列和豐度信息。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其中步驟a)進一步包括使用基于所述所受對象的成熟B細(xì)胞中的VH和VL基因的至少CDR3的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列的序列信息識別的蛋白酶從血清抗體制備含CDR3的肽。
59.如權(quán)利要求52所述的方法，其中步驟a)進一步包括獲得所述所受對象的成熟B細(xì)胞所編碼的VH和VL基因譜的至少CDR3的核酸序列的序列信息，其中所述核酸序列信息被用于確定所述血清抗體的氨基酸序列。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中獲得所述氨基酸序列信息包括確定所述B細(xì)胞中的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所確定的核酸序列包括VH和VL基因的序列。
62.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述B細(xì)胞中的核酸序列通過高通量DNA測序來確定。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述高通量測序包括邊合成邊測序、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合。
64.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括記憶B細(xì)胞。
65.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括漿細(xì)胞。
66.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟a)進一步包括分離或富集所選擇類型的血清抗體。
67.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟a)進一步包括分離或富集與預(yù)定抗原結(jié)合的血清抗體。
68.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟a)進一步包括分離或富集血清抗體的含CDR3的片段。
69.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟a)進一步包括通過血清抗體的蛋白水解片段化產(chǎn)生的肽序列的豐度水平。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中確定所述氨基酸序列的豐度水平包括質(zhì)譜的定量方法。
71.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述豐度的閾值水平是約5至約500μ g/ml的濃度。
72.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述豐度的閾值水平是所述血清抗體中50個最富有的含CDR3的氨基酸序列中的任何一個的水平。
73.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述所受對象患有腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或者已經(jīng)被免疫。
74.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述所受對象具有或者已經(jīng)被暴露于為感染劑、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞或自身抗原的抗原。
75.如權(quán)利要求51所述的方法，其進一步包括報告步驟b)中的識別。
76.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟c)中生成的抗體或抗原結(jié)合片段中的每一種包括相似豐度的VH和VL的氨基酸序列。
77.如權(quán)利要求51所述的方法，其中步驟c)中所生成的抗體或抗原結(jié)合片段以IOOpM至5 μ M的單價親和性與所述所受對象具有或已經(jīng)被暴露于的抗原結(jié)合。
78.如權(quán)利要求51所述的方法，其進一步包括評估步驟c)中所生成的抗體或抗原結(jié)合片段對預(yù)定抗原的結(jié)合親和性的步驟d)。
79.—種生成抗體的方法，包括a)獲得所受對象的含血清樣品中抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列的序列和豐度信息；和 b)基于所述序列和豐度信息生成包含所述血清抗體的VH和VL的一種或多種抗體。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中步驟a)包括確定所述血清抗體的氨基酸序列。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中步驟a)包括獲得來源于所述所受對象的血清抗體的肽的質(zhì)譜。
82.如權(quán)利要求80所述的方法，其中步驟a)包括使用高效液相色譜(HPLC)。
83.如權(quán)利要求79所述的方法，其中步驟b)包括相應(yīng)于表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的抗體序列的VH和VL編碼區(qū)的化學(xué)合成。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中步驟b)包括在細(xì)菌細(xì)胞中表達所合成的VH和VL編碼區(qū)。
85.如權(quán)利要求79所述的方法，其中a)包括獲得高同源性的VH和VL區(qū)的豐度信息。
86.—種從所受對象的血清抗體制備含CDR3的肽片段的方法，包括 a)獲得所受對象的成熟B細(xì)胞中VH和VL基因的至少CDR3的核酸以及相應(yīng)的氨基酸序列信息； b)使用所述序列信息選擇蛋白酶；和 c)用所述蛋白酶從所述所受對象的血清抗體制備含CDR3的肽片段。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中所選擇的蛋白肽在臨近所述CDR3區(qū)的位點裂解VH和VL區(qū)。
88.如權(quán)利要求86所述的方法，其中獲得所述核酸序列信息包括確定所述B細(xì)胞中所述核酸序列和所述相應(yīng)的氨基酸序列。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所確定的所述核酸序列包括VH和VL基因的序列。
90.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所述B細(xì)胞中的所述核酸序列通過高通量DNA測序來確定。
91.如權(quán)利要求86所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括記憶B細(xì)胞。
92.如權(quán)利要求86所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括漿細(xì)胞
93.如權(quán)利要求86所述的方法，進一步包括富集或純化含CDR3的肽片段的步驟d)。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其中步驟d)包括將含CDR3的肽片段與標(biāo)記的巰基特異性軛合劑軛合。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其中步驟d)包括基于所軛合的含CDR3的肽片段上的標(biāo)記富集或純化含CDR3的肽片段。
96.如權(quán)利要求94所述的方法，其中所述標(biāo)記是生物素。
97.一種生成一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段的方法，包括 a)獲得所受對象的成熟B細(xì)胞中相應(yīng)于VH和VL基因的核酸序列的序列和豐度信息；和 b)識別表現(xiàn)出閾值水平豐度的那些序列；和 c)生成包含一個或多個的相應(yīng)于所識別的核酸序列的氨基酸序列的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段。
98.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞來自外周血。
99.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞來自淋巴器官。
100.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括骨髓漿細(xì)胞。
101.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括淋巴結(jié)漿細(xì)胞。
102.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括脾漿細(xì)胞。
103.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括來自外周血的漿母細(xì)胞。
104.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括來自脾或淋巴結(jié)或外周血的記憶B細(xì)胞。
105.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞基于細(xì)胞表面標(biāo)記的差異表達來選擇或富集。
106.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記是Blimp-1、CD138、CXCR4或CD45。
107.如權(quán)利要求97所述的方法，其中步驟a)包括高通量測序。
108.如權(quán)利要求107所述的方法，其中所述高通量測序包括邊合成邊測序、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合。
109.如權(quán)利要求97所述的方法，其中步驟c)包括所識別的核酸序列的化學(xué)合成。
110.如權(quán)利要求97所述的方法，其中步驟c)包括在異源系統(tǒng)中的表達或體外蛋白合成的使用。
111.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述閾值水平的豐度是來自所選擇的器官的漿細(xì)胞群中的至少1%。
112.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所產(chǎn)生的抗體或抗體片段中的每一個包括相應(yīng)于相似豐度的VH和VL的氨基酸序列或者相似豐度的VH和VL的高同源性核酸序列的簇的氨基酸序列。
113.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述所受對象患有感染、腫瘤或自身免疫性疾病或者已經(jīng)被免疫。
114.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所生成的抗體或抗體片段結(jié)合一名或多名所受對象具有或者已經(jīng)被暴露于的抗原。
115.如權(quán)利要求114所述的方法，其中所述抗原是感染劑、腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞或自身抗原。
116.—種識別循環(huán)系統(tǒng)中的富有抗體序列的方法，包括 a)確定所受對象的成熟B細(xì)胞中相應(yīng)于VH和VL基因的核酸序列的序列和豐度信息；和 b)識別相應(yīng)于表現(xiàn)出至少閾值水平豐度的抗體核酸序列的那些抗體氨基酸序列，由此識別循環(huán)系統(tǒng)中的富有抗體序列；
117.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括骨髓漿細(xì)胞。
118.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括淋巴結(jié)漿細(xì)胞。
119.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述成熟B細(xì)胞包括脾漿細(xì)胞。
120.如權(quán)利要求116所述的方法，其中確定相應(yīng)于所述VH和VL基因的核酸序列的序列和豐度信息包括確定所述VH和VL基因的至少CDR3的序列和豐度信息。
121.如權(quán)利要求116所述的方法，其中步驟a)包括高通量測序。
122.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述高通量測序包括邊合成邊測序、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合。
123.如權(quán)利要求121所述的方法，其進一步包括生成包含一個或多個的所述富有抗體序列中的一種或多種抗體或抗原結(jié)合片段的步驟c)。
124.如權(quán)利要求123所述的方法，其中所產(chǎn)生的抗體或抗體片段中的每一個包括相應(yīng)于下列的氨基酸序列相似豐度的VH和VL的氨基酸序列或者相似豐度的VH和VL的高同源性核酸序列的簇。
125.如權(quán)利要求123所述的方法，其中步驟c)包括所識別的抗體序列的化學(xué)合成。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其中步驟c)包括將所合成的VH和VL基因并入至少一個表達抗體中。
127.如權(quán)利要求123所述的方法，其中所述步驟c)包括在異源系統(tǒng)中的表達或體外蛋白合成的使用。
128.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述閾值水平的豐度是來自所選擇的器官的漿細(xì)胞群中的至少1%。
129.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所識別的抗體氨基酸序列是IgG抗體的序列。
130.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所識別的抗體氨基酸序列是IgM抗體的序列。
131.如權(quán)利要求116所述的方法，其中所識別的抗體氨基酸序列是IgA抗體的序列。
132.—種識別候選抗原特異性可變區(qū)核酸序列的方法，其中所述方法包括下列步驟 a)從所受對象的淋巴組織的核酸群獲得抗體可變區(qū)核酸池而無需將B細(xì)胞從所述淋巴組織分離，其中所述所受對象已經(jīng)被暴露于抗原；和 b)確定所述池中抗體可變區(qū)核酸的序列和出現(xiàn)頻率； c)識別總共以步驟b)中所確定的序列中的至少O.5%的頻率存在的富有可變區(qū)序列，其中所述富有可變區(qū)序列是候選抗原特異性序列。
133.如權(quán)利要求132所述的方法，進一步包括選擇包含相似豐度水平或作為具有相似豐度的高同源性核酸序列簇的一部分的VH和VL的核酸序列的一對VH和VL序列。
134.如權(quán)利要求133所述的方法，其中所述對中的所述VH核酸序列是最富有VH序列并且所述對中的所述VL核酸序列是最富有VL序列。
135.如權(quán)利要求133所述的方法，進一步包括生成由VH和VL的成對核酸序列編碼的氨基酸序列的抗體或抗體片段，其中所生成的抗原或抗原片段中的至少一種結(jié)合所述抗原。
136.如權(quán)利要求132所述的方法，進一步包括所述富有可變區(qū)序列的化學(xué)合成。
137.如權(quán)利要求132所述的方法，進一步包括在體外表達系統(tǒng)或異源細(xì)胞表達系統(tǒng)中表達所述富有可變區(qū)序列。
138.如權(quán)利要求132所述的方法，進一步包括免疫所述所受對象。
139.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述淋巴組織是初級淋巴組織。
140.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述淋巴組織是二級淋巴組織。
141.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述淋巴組織是三級淋巴組織。
142.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述淋巴組織是骨髓、脾或淋巴結(jié)。
143.如權(quán)利要求142所述的方法，其中所述淋巴組織是骨髓。
144.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述所受對象是哺乳動物、魚、兩棲動物或鳥。
145.如權(quán)利要求144所述的方法，其中所述哺乳動物是人類、小鼠、靈長類、兔、山羊、綿羊或豬。
146.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述核酸池是cDNA池。
147.如權(quán)利要求132所述的方法，其中獲得所述核酸池包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶。
148.如權(quán)利要求132所述的方法，其中獲得所述核酸池包括使用基于已知抗體恒定區(qū)cDNA序列的引物或探針。
149.如權(quán)利要求132所述的方法，其中獲得所述核酸池包括快速cDNA末端擴增(RACE)。
150.如權(quán)利要求132所述的方法，其中獲得所述核酸池包括PCR擴增。
151.如權(quán)利要求132所述的方法，其中獲得所述核酸池包括核酸雜交。
152.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述核酸池是基因組核酸池。
153.如權(quán)利要求132所述的方法，其中確定所述序列包括高通量測序
154.如權(quán)利要求153所述的方法，其中所述高通量測序包括邊合成邊測序、邊連接邊測序、變雜交邊測序、單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合。
155.如權(quán)利要求132所述的方法，其進一步包括識別所述抗體可變區(qū)核酸序列的CDR3序列。
156.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所選擇的可變區(qū)序列的存在頻率進一步定義為具有與所選擇的可變區(qū)序列具有相同的CDR3序列的任何可變區(qū)序列的出現(xiàn)頻率的和。
157.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述方法包括識別總共以在步驟b)中所確定序列中至少I %的頻率存在的富有可變區(qū)序列。
158.如權(quán)利要求132所述的方法，其中所述抗體可變區(qū)核酸具有所選擇的抗體類型。
159.如權(quán)利要求158所述的方法，其中所選擇的抗體類型是IgG或IgA。
全文摘要
提供了用于識別候選抗原特異性可變區(qū)以及生成可具有所期望的抗原特異性的抗體或抗原結(jié)合片段的方法和組合物。例如，在某些方面，描述了確定血清抗體CDR的氨基酸序列和豐度水平的方法。在某些方面，提供了確定抗體可變區(qū)序列的核酸序列和頻率的方法。而且，本發(fā)明提供識別并生成包含高度表現(xiàn)的CDR的抗體或抗原結(jié)合片段的方法。
文檔編號C12Q1/68GK103003697SQ201180035306
公開日2013年3月27日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者賽·雷迪, 葛新, 丹尼·布齊, 安德魯·D·埃林頓, 愛德華·M·馬科特, 賈森·拉維德爾, 喬治·喬治烏 申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會