專利名稱：用于在大腸中增加雙歧桿菌和抑制雙歧桿菌減少的試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的試劑和方法。更具體地，本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子用于在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的用途。
背景技術：
迄今為止，在成人腸中已報道了以下四種優(yōu)勢雙歧桿菌菌株青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacterium catenulatum)、假鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)和長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)(Matsuki, T.等,Appl. Environ. Microbiol. 70(1) : 167-173，2004)。已證實雙歧桿菌不僅對腸調節(jié)有效，而且還對免疫調節(jié)和血脂水平的改善等有效。因此，已進行了增加腸中的雙歧桿菌的嘗試。已知包括口服攝入耐胃酸的雙歧桿菌作為益生菌(PlObiotiCS)的方法和包括攝入寡糖作為益生元(prebiotics)的方法為增加腸內雙歧桿菌的方法。目前，攝取乳酸菌和上述雙歧桿菌作為益生菌已變得普遍(JP專利公布2007-091704A)。然而 ，由于個體間有很大的差異，并且攝取菌株的定殖率(colonizationrate)在個體間也是變化的，因此益生菌在所有人中不總是產生類似的結果(KagakutoSerbutsu 47 (2):78-80，2009)。攝取雙歧桿菌的生長因子(如，寡糖)作為益生元也變得普遍。已發(fā)現(xiàn)此類益生元對于青春雙歧桿菌的生長是有效的；然而，并未證實它們對腸中的長雙歧桿菌的生長有效(Asano 等，Nippon Nogeikagaku Kaishi, 75(10):1077-1083，2001)。另外，已報道將雙歧桿菌制劑與雙歧桿菌的生長促進劑組合給藥的組合物作為益生菌和益生元的組合制劑(JP專利公布2009-296910A)。有報道稱枯草芽孢桿菌對于促進腸細菌如雙歧桿菌的生長是有用的(JP專利公布 2009-296910A ;和 Ushijima, Medicine andBiology, 128(1) :9-14, 1994)。據(jù)報導，枯草芽孢桿菌的萌發(fā)細胞(germinated cell)對于雙歧桿菌的生長是有效的(Ushijima, 1994supra)，而枯草芽孢桿菌的孢子在小腸中萌發(fā)，以致萌發(fā)細胞促進腸細菌的生長(JP專利公布 7-170975 (1995) A)。之前本申請人還報道了通過將孢子直接經口服途徑向家畜(如豬和雞)給藥證實枯草芽孢桿菌的孢子具有腸調節(jié)作用(參見JP專利2528055B)。

發(fā)明內容
如上所述,本領域仍需要增加構建小型生物群(microbiota)的雙歧桿菌,特別是增加作為小型生物群中主要菌株的長雙歧桿菌的方法和手段(mean)。本發(fā)明的目的為提供用于有效增加大腸中雙歧桿菌的手段和方法。作為為了實現(xiàn)上述目的而深入研究的結果，本發(fā)明人證實某些枯草芽孢桿菌的孢子在經過消化道時萌發(fā)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的孢子具有促進大腸中雙歧桿菌生長的效果，而枯草芽孢桿菌的孢子，特別是與枯草芽孢桿菌(某些為萌發(fā)的)相比明顯具有更顯著的增加長雙歧桿菌并抑制長雙歧桿菌的減少的效果?；谶@些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。具體地，將本發(fā)明描述如下。[I] 一種用于在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌的減少的試劑，其包括枯草芽孢桿菌的孢子，和在保持所述枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將所述孢子輸送至受試者大腸的手段。[2]根據(jù)[I]所述的試劑，其基本上無枯草芽孢桿菌的萌發(fā)細胞。[3]根據(jù)[I]或[2]所述的試劑，其中枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌C_3102(FERMBP-1096)或其突變株或衍生株。根據(jù)[I]至[3]任一項所述的試劑，其中所述雙歧桿菌為長雙歧桿菌。根據(jù)[I]至[4]任一項所述的試劑，其用于口服給藥和/或腸道內給藥。根據(jù)[I]至[5]任一項所述的試劑，其用于飲食品、飼料或藥品。根據(jù)[I]至[6]任一項所述的試劑,其用作整腸劑(intestinalregulatory、抗變態(tài)反應劑或血脂水平改善劑。一種用于生產功能性飲食品的方法，其包括
制備根據(jù)[I]至[7]任一項所述的試劑，和將所述試劑引入飲食品中。一種功能性飲食 品，其包含引入其中的根據(jù)[I]至[7]任一項所述的試劑。一種用于在受試者大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的方法，其agent)
包括在保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將有效量的枯草芽孢桿菌孢子輸送至受試者大腸，或直接將所述孢子給藥至受試者大腸。[11]根據(jù)[10]所述的方法，其中所述受試者為人類或非人類動物。[12]根據(jù)[10]或[11]所述的方法，其中所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌C-3102(FERM BP-1096)或其突變株或衍生株。[13]根據(jù)[10]至[12]任一項所述的方法，其中所述雙歧桿菌為長雙歧桿菌。[14]根據(jù)[10]至[13]任一項所述的方法，其中所述孢子經口服給藥和/或腸內給藥向受試者給藥。[15] 一種用于在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的試劑，其包括枯草芽孢桿菌的孢子，和在保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將所述孢子輸送至受試者大腸的手段。本發(fā)明提供具有增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的優(yōu)良效果的試劑。本發(fā)明的試劑使大腸中的雙歧桿菌增加和/或抑制其減少，從而有助于促進宿主健康并預防多種疾病。另外，本發(fā)明的試劑即使在高溫處理后也能夠保持增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌的減少。因此，本發(fā)明的試劑可優(yōu)選用于功能性飲食品以及飼料。


圖1為示出在向大腸模型添加枯草芽孢桿菌的孢子和萌發(fā)細胞后通過微陣列分析確定的雙歧桿菌菌株增加的圖。圖2為示出在向大腸模型添加枯草芽孢桿菌的孢子后通過微陣列分析確定的雙歧桿菌菌株增加的圖。圖3為示出在向大腸模型添加枯草芽孢桿菌的孢子后通過實時PCR確定的長雙歧桿菌減少的圖。
具體實施例方式以下詳細描述本發(fā)明。本申請要求對2010年3月12日提交的日本專利申請2010-055816的優(yōu)先權，將其說明書和/或附圖中所記載的部分或全部內容引入于此以作參考。本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌的孢子用于在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的用途。如下述實施例2所示，證實當將枯草芽孢桿菌的孢子經口服途徑直接給藥時，某些細胞在經過胃腸道時萌發(fā)。此外，如下述實施例3所示，發(fā)現(xiàn)與枯草芽孢桿菌的孢子和萌發(fā)細胞的混合物不同，枯草芽孢桿菌的孢子具有顯著地增加長雙歧桿菌的效果。因此，本發(fā)明意于在保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將枯草芽孢桿菌的孢子輸送至受試者的大腸，從而在大腸中使雙歧桿菌、特別是長雙歧桿菌增加和/或抑制其減少。本發(fā)明提供用于在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的試劑，所述試劑包括枯草芽孢桿菌的孢子，和在保持所述枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將所述孢子輸送至受試者大腸的手段。本發(fā)明還提供用于在受試者大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的方法，所述方法包括在保持所述枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將有效量的枯草芽孢桿菌孢子輸送至受試者大腸，或者直接將所述孢子給藥至受試者大腸。

本領域已知的任何常規(guī)枯草芽孢桿菌菌株均可用于本發(fā)明，只要保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)，并且枯草芽孢桿菌的孢子具有期望的增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的效果即可。另外，鑒于對動物給藥/由動物攝取，優(yōu)選此類菌株為已證實對動物安全的菌株。此類枯草芽孢桿菌菌株的具體實例包括枯草芽孢桿菌C-3102(FERM BP-1096)、枯草芽孢桿菌BN菌株以及保藏在RIKEN生物資源中心的菌株(JCM2499、JCM 11003、JCM20014、JCM20035, JCM20036, JCM20038, JCM20057, JCM20073, JCM20083、JCM20085、JCM20086、JCM20094、JCM20095、JCM20096、JCM20105、JCM20108、JCM20118、JCM20127、JCM20132、JCM20333、JCM20336、JCM20352、JCM20353、JCM20354、JCM20520 和 JCM21228)。根據(jù)本發(fā)明，“增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的效果”的表述是指增加存在于大腸中的雙歧桿菌菌株的細胞數(shù)和/或抑制存在于大腸中的雙歧桿菌菌株的細胞數(shù)減少的能力。作為促進增加或抑制減少對像的雙歧桿菌菌株不特別限定，只要它們屬于雙歧桿菌屬即可。其實例包括長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、角雙歧桿菌(B. angulatum)、兩歧雙歧桿菌(B. bifidum)、短雙歧桿菌(B. breve)、齒雙歧桿菌(B. dentium)、沒食子雙歧桿菌(B. gallicum)、球雙歧桿菌(B. globosum)、嬰兒雙歧桿菌(B.1nfantis)、細長雙歧桿菌(B. subtile)、星狀雙歧桿菌(B. asteroids)、牛雙歧桿菌(B. boum)、小豬雙歧桿菌(B. choerinum)、棒狀雙歧桿菌(B. coryneforme)、家兔雙歧桿菌(B. cuniculi)、雞雙歧桿菌(B. gallinarum)、印度雙歧桿菌(B.1ndicum)、大雙歧桿菌(B. magnum)、瘤胃雙歧桿菌(B. merycicum)、最小雙歧桿菌(B. minimum)、嗜冷雙歧桿菌(B. psychraerophiIum)、小雞雙歧桿菌(B. pulIorum)、反會雙歧桿菌(B. ruminantium)、斯卡都威雙歧桿菌(B. scardovii)、嗜酸嗜熱雙歧桿菌豬亞種(B. thermacidophilum subsp.porcinum)和嗜熱雙歧桿菌(B. thermophilum)。特別地,根據(jù)本發(fā)明，上述效果為使作為腸內菌叢中主要細菌的長雙歧桿菌增加和/或抑制其減少的效果。此類效果可通過例如以下來證實在與大腸環(huán)境條件相類似的條件下將枯草芽孢桿菌的孢子與一種或多種雙歧桿菌菌株溫育，并評價雙歧桿菌菌株細胞數(shù)的增加或減少。用于確定使雙歧桿菌增加和/或抑制其減少的具體方法可包括下述實施例3中所述的使用微陣列或實時PCR的方法。任何枯草芽孢桿菌均可用于本發(fā)明，只要通過上述方法等將其評價為具有使雙歧桿菌增加和/或抑制其減少的效果即可。具有此類期望效果的枯草芽孢桿菌的實例為枯草芽孢桿菌C-3102(FERM BP-1096)。在下述實施例中，已證實該菌株顯著地使雙歧桿菌、特別是長雙歧桿菌增加和抑制其減少。該菌株已由本申請人根據(jù)布達佩斯條約自1985年12月25日起保藏在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所(National InstituteofTechnology and Evaluation(NITE))(舊稱為通商產業(yè)省工業(yè)技術院微生物工業(yè)技術石開究所(Fermentation Research Institute, theAgency of Industrial Science andTechnology, the Ministry of International Trade and Industry))國際專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)(日本國茨城縣筑波市東 I 丁目 I 番地I 中央第 6 (郵政編碼 305-8566) Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566，Japan)，登錄號為FERM BP-1096。該菌株可在所述中心獲得。已報道枯草芽孢桿菌C-3102可通過利用其小型生物群改善作用、肉質改善作用和整腸作用以及其他作用而在動物中使用(如，JP 專利公布 04-024022 (1992) B 和 Suzuki 等，Chounai saikingaku zassi,vol. 18，no. 2，pp. 93-99 (2004))。因此，已證實枯草芽孢桿菌C-3102在包括人類在內的動物中是安全的。 另外，上述任一種具體菌株的突變株或衍生株可用于本發(fā)明，只要其具有使雙歧桿菌增加和/或抑制其減少的效果即可。將枯草芽孢桿菌的孢子用于本發(fā)明。術語“孢子”是指產孢細菌(spore-formingbacteria) 0孢子具有對溫度和化學物質的抗性。孢子在適于細菌生長的條件下萌發(fā)，并生長為營養(yǎng)細胞(萌發(fā)細胞)?？苫诰甑哪蜔嵝?，通過在高溫處理后檢測存活或死亡的細菌細胞來證實給定的枯草芽孢桿菌菌株是否為產孢細菌。根據(jù)本發(fā)明，要使用的枯草芽孢桿菌包含總細胞的優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上和特別優(yōu)選90%以上的孢子，和優(yōu)選小于總細胞的30%、更優(yōu)選小于20%和特別優(yōu)選小于10%的營養(yǎng)細胞?？莶菅挎邨U菌的孢子可通過使用常規(guī)用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)來制備。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基可用作培養(yǎng)基，只要其包含碳源、氮源、礦物鹽和其他組分，并能夠有效培養(yǎng)枯草芽孢桿菌即可。本領域熟練技術人員可適當?shù)剡x擇適用于要使用的細菌菌株的已知培養(yǎng)基。可使用的碳源的實例包括乳糖、葡萄糖、鹿糖、果糖、半乳糖和赤糖糊(blackstrap molasses)?？墒褂玫牡吹膶嵗ㄓ袡C含氮物質如蛋白胨、酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物和大豆蛋白水解物?？墒褂玫牡V物鹽的實例包括磷酸鹽、鈉鹽、鉀鹽和鎂鹽。適于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基的實例包括TS (胰胨豆胨)瓊脂培養(yǎng)基和HI (心浸液)瓊脂培養(yǎng)基。枯草芽孢桿菌可在好氧條件下在20°C至50°C、優(yōu)選30°C至45°C并特別優(yōu)選約37°C下培養(yǎng)?？墒褂煤銣卦?、包覆式加熱器(mantle heater)或夾套等調節(jié)溫度條件。培養(yǎng)形式包括靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)和罐式培養(yǎng)。另外，培養(yǎng)時間可定為12小時至7天，優(yōu)選2天至3天。優(yōu)選在培養(yǎng)開始將培養(yǎng)基的pH保持在5至9，優(yōu)選6至8。培養(yǎng)后，所獲得的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)產物可直接使用，或可根據(jù)需要將其進一步經離心等進行滅菌和粗提純和/或經過濾等進行固液分離。另外，用于本發(fā)明試劑的枯草芽孢桿菌可優(yōu)選為包括濕菌細胞和干菌細胞的活菌細胞的形式；然而，其也可為死菌細胞的形式。枯草芽孢桿菌可根據(jù)需要進一步進行處理以獲得枯草芽孢桿菌的處理產物。以下描述此類處理的實例?？赏ㄟ^在適當溶劑中懸浮或稀釋而將枯草芽孢桿菌制備為懸浮液或稀釋液的形式。可使用的溶劑的實例包括水、生理鹽水和磷酸鹽緩沖液(PBS)?？赏ㄟ^熱處理枯草芽孢桿菌制備加熱產物。為了制備此類加熱產物，使枯草芽孢桿菌進行高溫處理(例如，在60°C至100°C下)一段時間，例如約10分鐘至I小時(如，約10至30分鐘)。由于將枯草芽孢桿菌的孢子用于本發(fā)明，所以即使在高溫處理后孢子也是有活力的，并保持期望的效果?？赏ㄟ^枯草芽孢桿菌的滅菌處理來制備滅菌產物。為了使枯草芽孢桿菌進行滅菌處理，可使用例如已知的滅菌處理技術如過濾滅菌、放射性消毒、過熱消毒或加壓消毒。可經干燥將枯草芽孢桿菌加工成粉狀產物或粒狀產物的形式。干燥方法包括，但不限于噴霧干燥、轉鼓干燥、真空干燥和凍干法，其可單獨或組合使用。在干燥時，可根據(jù)需要添加常規(guī)使用的賦形劑。上述處理的實例可在適當情況下單獨或組合使用。根據(jù)本發(fā)明，此類處理的枯草芽孢桿菌可用于使大腸中的雙 歧桿菌增加和/或抑制其減少。當將包含單獨或與其他成分組合的上述所獲得的枯草芽孢桿菌的、用于在大腸中使雙歧桿菌增加和/或抑制其減少的試劑與攝取用飲食品、飼料或藥品混合時，可預期大腸中雙歧桿菌的增加和/或抑制其減少以及所伴隨的整腸作用、抗變態(tài)反應作用或血脂改
善作用。本發(fā)明的用于增加大腸桿菌和/或抑制大腸桿菌減少的試劑(下文中有時稱作“本發(fā)明的試劑”)包括作為活性成分的上述枯草芽孢桿菌。其可包括一種枯草芽孢桿菌菌株或多種不同的枯草芽孢桿菌菌株。另外，其可包括以不同方式處理的枯草芽孢桿菌的組
入
口 ο根據(jù)本發(fā)明，必須在保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將枯草芽孢桿菌的孢子輸送至受試者的大腸。為此，將枯草芽孢桿菌的孢子與下述手段組合來用于給藥或攝取在保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將孢子輸送至受試者大腸，或者直接給藥至大腸。本文所使用的“輸送至大腸的手段”的表述是指例如在防止孢子在胃和小腸中萌發(fā)的同時使枯草芽孢桿菌的孢子輸送至大腸(包括結腸和直腸)的手段。此類手段的實例為在通過防止孢子在胃和小腸中的高營養(yǎng)環(huán)境和/或低PH環(huán)境中萌發(fā)來保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時，使枯草芽孢桿菌的孢子經過胃和小腸的手段。此類輸送手段是本領域公知的，并不特別限定。其實例包括腸溶衣、腸溶膠囊、腸溶片和脂質體。腸溶衣以使得制劑不在胃和小腸中溶解或崩解、且結構特性方面未修飾的方式，由涂布制劑用組合物或組合物的組合所形成。此類腸溶衣的實例包括聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、纖維素酯衍生物(如乙酸鄰苯二甲酸纖維素或羧甲基纖維素)、纖維素醚、藻酸、丙烯酸甲酯共聚物和Eudragif l/s。腸溶片可通過用腸溶衣涂布片劑來獲得。另外，腸溶膠囊可通過用腸
溶衣涂布膠囊，或者通過由用于腸溶衣的材料制備膠囊并在膠囊內包封枯草芽孢桿菌的孢子和適當?shù)妮d體來獲得。此類輸送手段記載于，例如W02005/117921A、W02002/091833A、W02004/014403A, JP 專利公布 11-199494 (1999) A 和 W02008/114889A。本領域熟練技術人員可容易理解輸送手段的類型、制備輸送手段的方法和將輸送手段用于枯草芽孢桿菌的孢子。將枯草芽孢桿菌的孢子輸送至大腸的手段可依據(jù)給藥或攝取孢子的受試者的種類或年齡以及劑型而適當?shù)剡x擇，并設計為輸送的有利方式。另外，直接將枯草芽孢桿菌的孢子給藥至大腸的方法在本領域是已知的。例如，可采用腸內給藥或直腸內注射等。此外，除了用作活性成分的枯草芽孢桿菌的孢子和輸送其的手段以外，如果不抑制所期望的效果，可將下述添加劑、枯草芽孢桿菌或雙歧桿菌的生長促進劑、已知的整腸劑和其他成分單獨或以其組合添加到本發(fā)明的試劑。本發(fā)明的試劑的劑型包括，但不限于，口服制劑如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑(dust formulations)、糖楽；劑、干糖楽;劑、溶液劑、懸浮劑和吸入劑；經腸制劑；和注射劑。這些中，本發(fā)明的試劑優(yōu)選為口服制劑的形式。另外，液體制劑如溶液劑或懸浮劑可為使劑型在使用前可立即溶解或懸浮于水或不同的適當介質中的形式。當將本發(fā)明的試劑成形為片劑或顆粒劑時，可通過已知方法進行涂布。另外，可使用本領域已知的技術將本發(fā)明的試劑制備為控釋制劑如緩釋型制劑、延釋型制劑(delayed-release formulation)或速釋型制劑?？赏ㄟ^將常規(guī)使 用的添加劑如賦形劑、崩解劑、粘結劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、緩沖齊U、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑、甜味劑、增味劑、芳香劑、酸化劑和著色劑根據(jù)劑型配制到上述成分，根據(jù)常規(guī)方法制備上述劑型的試劑。例如，在其中將本發(fā)明的試劑制備成藥物組合物的情況下，可將藥物學可接受載體或添加劑引入本發(fā)明的試劑中。此類藥物學可接受載體和添加劑的實例包括水、藥物學可接受有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉鈉、果膠、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、可接受作為藥物學添加劑的表面活性劑和人造細胞結構如脂質體。當本發(fā)明的試劑包含上述添加劑和其他試劑如枯草芽孢桿菌或雙歧桿菌的生長促進劑和其他整腸劑時，用作活性成分的枯草芽孢桿菌孢子的含量可取決于其劑型。例如，所述含量通常為O. 01質量％至99質量％、優(yōu)選O.1質量％至80質量％、更優(yōu)選O.1質量％至75質量％。為了實現(xiàn)攝取期望量的活性成分，可期望以管理每日劑量(daily dose)的劑型制備本發(fā)明的試劑。另外，本發(fā)明的試劑中所包含的枯草芽孢桿菌的孢子數(shù)為，例如約IO4個細胞/g至IO11個細胞/g。另外，本發(fā)明的試劑可進一步包含多種用于生產藥品、飲食品、飼料和其他各種物質的添加劑。此類物質和添加劑的實例包括多種油脂(如,植物油如大豆油、玉米油、紅花油和橄欖油，和動物油脂如牛脂或沙丁魚油)、草藥(如，蜂王漿和人參(ginseng))、氨基酸(如，谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸和精胺酸)、多元醇(如，乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和糖醇如山梨糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇和甘露醇)、天然聚合物(如，阿拉伯膠、瓊月旨、水溶性玉米纖維、明膠、黃原膠、酪蛋白、谷蛋白或谷蛋白水解物、卵磷脂、淀粉和糊精)、維生素(如，維生素C和維生素B族)、礦物質(如，鈣、鎂、鋅和鐵)、膳食纖維(如，甘露聚糖、果膠和半纖維素)、表面活性劑(如，脂肪酸的甘油酯和脂肪酸的山梨醇酯)、純水、賦形劑(如，葡萄糖、玉米淀粉、乳糖和糊精)、穩(wěn)定劑、PH調節(jié)劑、抗氧化劑、甜味劑、增味劑、酸化劑、著色劑和芳香劑。例如，可選擇有效促進用作活性成分的枯草芽孢桿菌或要增加的雙歧桿菌的生長的物質。此類生長促進劑的實例包括枯草芽孢桿菌或雙歧桿菌的生長培養(yǎng)基、募糖和乳蛋白。另外，除了上述活性成分以外，可將功能性成分或添加劑弓I入本發(fā)明的試劑中。其實例包括牛磺酸、谷胱甘肽、肉毒堿、肌酸、輔酶Q、葡糖醛酸、葡糖醛酸內酯、辣椒提取物、姜提取物、可可提取物、瓜拉那提取物、藤黃屬植物提取物、茶氨酸、Y-氨基丁酸、辣椒素、辣椒素酯(capsiate)、各種有機酸、類黃酮、多酚、兒茶素、黃嘌呤衍生物、難消化的寡糖如果寡糖(fructooligosaccharide)和聚乙烯卩比咯燒酮。此類添加劑的量可依據(jù)添加劑的類型和所期望的量而適當?shù)卮_定。添加劑的含量通常為本發(fā)明試劑總質量的O. 01質量％至90質量％、優(yōu)選O.1質量％至50質量％。給藥或攝取本發(fā)明的試劑的受試者可為脊椎動物。其具體實例包括哺乳動物如人類、靈長類(如，猴子和黑 猩猩)、家畜(如，牛、馬、豬和羊)、寵物(如，狗和貓)和實驗動物(如，小鼠和大鼠)。另外，此類受試者可為爬行動物和鳥類。特別優(yōu)選需要增加大腸中雙歧桿菌的人類。給藥或攝取本發(fā)明試劑的劑量(有效劑量)可取決于受試者的年齡和體重、給藥/攝取途徑和給藥/攝取劑量的次數(shù)，并可由本領域熟練技術人員自由裁量廣泛變化以實現(xiàn)期望的效果。例如，對于口服給藥或攝取，給藥/攝取包含在本發(fā)明試劑中的枯草芽孢桿菌孢子的劑量通常約為IO4個細胞/天至IO11個細胞/天?？莶菅挎邨U菌的含量不特別限定，并可根據(jù)例如易于生產的程度和優(yōu)選的每日劑量而適當?shù)卣{節(jié)。本發(fā)明的試劑是安全的，因而還可進一步增加攝入量。攝取的每日劑量可為一次劑量，或可將其分為多次劑量。另外，給藥或攝取的頻率不特別限定，可依據(jù)各種條件如給藥/攝取途徑、受試者的年齡和體重以及期望的效果(如，治療或預防效果)而適當?shù)剡x擇。本發(fā)明試劑的給藥/攝取途徑不特別限定，并包括口服給藥/攝取和非經口給藥(如，腸內給藥或直腸內給藥)。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑為口服給藥或攝取。本發(fā)明的試劑使宿主大腸中對宿主有用的腸細菌增加和/或抑制其減少，其具體地使雙歧桿菌、特別是長雙歧桿菌增加和/或抑制其減少，從而促進宿主健康并預防多種疾病。另外，本發(fā)明的試劑是高度安全的，因而其攝取可容易長時間持續(xù)。因此，本發(fā)明的試劑還可用于飲食品以及飼料。本發(fā)明的試劑可與另外的藥品或另外的處理或預防方法組合使用。可將另外的藥品和本發(fā)明的試劑配制成單一制劑?？蛇x地，可將它們配制成單獨的制劑以同時或間隔給藥。另外，在使用本發(fā)明的試劑時，枯草芽孢桿菌的孢子可與常規(guī)方法組合使用，除非該方法影響本發(fā)明的效果。此外，期望通過將本發(fā)明的試劑與常規(guī)方法組合使用，將會實現(xiàn)比單獨使用該試劑所實現(xiàn)的甚至更顯著的效果。如上所述，本發(fā)明的試劑具有在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的效果，并包括常規(guī)使用的枯草芽孢桿菌。其高度安全，因而無須擔心副反應。所述試劑中所包含的作為活性成分的枯草芽孢桿菌的孢子具有對高溫和化學物質的抗性，使其在生產飲食品的過程中所使用的各種形式的物理或化學處理期間穩(wěn)定。另外，它們具有優(yōu)異的防腐性。另外，當將本發(fā)明的試劑添加到多種飲食品中時，所述試劑甚至不破壞飲食品的原始風味。因此，本發(fā)明的試劑可添加到多種飲食品用于其持續(xù)攝取。本發(fā)明的飲食品含有上述本發(fā)明的試劑。含有本發(fā)明的試劑的飲食品的實例包括可引入本發(fā)明試劑的所有飲食品，例如，飲食品如具有增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的效果以促進健康的保健飲食品、功能性飲食品和特殊保健用途的食品和飲品。功能性飲食品特別優(yōu)選作為含有本發(fā)明的試劑的飲食品。根據(jù)本發(fā)明，“功能性飲食品”是指對生物體具有預定功能的飲食品，并包括，例如所謂的一般保健飲食品(該一般保健飲食品如，包括特殊保健用途的食品(包括合格的FOSHU[特殊保健用途食品])的具有健康聲明的飲食品和具有營養(yǎng)功能聲明的飲食品)、特殊膳食用途的飲食品、營養(yǎng)增補齊U、健康增補劑、增補劑(如，具有多種劑型如片劑、包衣片劑、糖衣片劑、膠囊和液劑的那些)和美容飲食品(如， 減肥飲食品)。本發(fā)明的功能性飲食品還包括采用基于Codex (FA0/WHO聯(lián)合食品標準計劃)食品標準的健康聲明的保健飲食品。飲食品的具體實例包括劑型為例如流質飲食(如，管腸內營養(yǎng)增補劑)、片劑糖果、片劑、咀嚼片、粉劑、散劑、膠囊劑、顆粒劑和滋補飲料等的保健飲食品和營養(yǎng)增補劑；茶飲料如綠茶、烏龍茶和紅茶；飲品(drinks)或飲料(beverages)如軟飲料、果凍飲料、等滲飲料、乳飲料、碳酸飲料、蔬菜飲料、果汁飲料、發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵果汁飲料、發(fā)酵乳飲料(如，酸奶)、乳酸菌飲料、乳飲料(如咖啡奶和果奶)、含有飲料粉末的飲料、可可飲料、乳和純水；涂抹調味品(spreads)如黃油、果醫(yī)、干調味品和人造黃油；蛋黃醫(yī)；起醉油；奶油凍；敷料劑；面包；米飯；面條；意大利面；味噌湯；豆腐；酸乳；湯或醬油；和甜食(如，餅干和曲奇、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖和糖片)?？赏ㄟ^添加除本發(fā)明試劑以外的用于生產上述飲食品的其他食材、各種營養(yǎng)物、各種維生素、礦物質、膳食纖維和各種添加劑(如，呈味成分(taste components)、甜味劑、酸化劑如有機酸、穩(wěn)定劑和增味劑)，根據(jù)常規(guī)方法生產本發(fā)明的飲食品。對于本發(fā)明的飲食品，本領域熟練技術人員可鑒于飲食品的形式和所需的味道或食感適當?shù)卮_定本發(fā)明的試劑或所配制的枯草芽孢桿菌孢子的量。通常，本發(fā)明試劑的合適的量通常為要添加的本發(fā)明的試劑中枯草芽孢桿菌孢子總量的O. 001至100質量％、優(yōu)選O. 01至80質量％、更優(yōu)選O. 01至50質量％。本發(fā)明的試劑是安全的，因而其在飲食品中的量可進一步增加。為了實現(xiàn)攝入期望量的本發(fā)明試劑，可期望以管理每日劑量的劑型制備本發(fā)明的試劑。如上所述，本發(fā)明的飲食品可以以管理本發(fā)明的試劑的期望量的形式消耗。因此，可提供使用飲食品在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的方法?？赏ㄟ^本領域熟練技術人員可得的適當方法將本發(fā)明的試劑引入飲食品中。例如，本發(fā)明的試劑可以以液體、凝膠、固體、粉末或顆粒形式制備，然后將其引入飲食品中?？蛇x地，本發(fā)明的試劑可直接混合或溶解在飲食品的原料中。本發(fā)明的試劑可涂覆至、涂布至、浸入或噴涂至飲食品。本發(fā)明的試劑可均勻分散或不均勻分布在飲食品中?？芍苽浜斜景l(fā)明的試劑的膠囊?？蓪⒖墒秤媚せ蚴称吠坎紕┌诒景l(fā)明試劑的周圍。任選地，可在添加適當?shù)馁x形劑等后將本發(fā)明的試劑制備成如片劑等的形式?？蛇M一步加工包括本發(fā)明的試劑的飲食品。此類加工產物也包含在本發(fā)明的范圍內。在本發(fā)明的飲食品的生產中，可采用多種常規(guī)用于飲食品的添加劑。添加劑的實例包括，但不限于，發(fā)色劑(如，亞硝酸鈉)、著色劑(如，桅子色素和Red 102)、香料(如，橙味香料)、甜味劑(如，甜葉菊和阿斯巴甜)、防腐劑(如，乙酸鈉和山梨酸)、乳化劑(如，軟骨素硫酸鈉和脂肪酸丙二醇酯)、抗氧化劑(如，EDTA 二鈉和維生素C)、pH調節(jié)劑(如，檸檬酸)、化學調味料(如，肌苷酸鈉)、增稠劑(如，黃原膠)、膨潤劑(如，碳酸鈣)、消泡劑(如，磷酸韓)、粘合劑(如，多聚磷酸鈉)、營養(yǎng)強化劑(nutrition-enriching agent)(如，鈣強化劑和維生素A)和賦形劑(如，水溶性糊精)?？蛇M一步添加功能性原料如人參(Panaxginseng)提取物、刺五加(Acanthopanax senticosus Harms)提取物、桉樹提取物或杜仲茶提取物。另外，本發(fā)明的試劑不僅可制成人類用飲食品，還可制成動物如家畜(如，豬和雞)、賽馬和寵物用飼料。飼料除了給予非人類受試者以外基本上相當于飲食品。因此，飲食品的以上描述可稍做變更適用于飼料。參考以下實施例詳細描述本發(fā)明，盡管本發(fā)明不限于這些實施例。[實施例1]孢子的制備在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌C-3102 (FERMBP-1096)。簡略地說，使用通過將“胰胨豆胨肉湯(Trypticase SoyBroth) ”(產品名，來自BBl) (30g/L)與2%瓊脂混合制備的T S瓊脂培養(yǎng)基將枯草芽孢桿菌C-3102在37°C下培養(yǎng)2至3天，從而獲得孢子。[實施例2]使用人造人腸模型對枯草芽孢桿菌萌發(fā)率的測定將胃和小腸的復制模型(reproduced model,由ΤΝ0(荷蘭)研發(fā)的人造腸模型，TNO腸模型TIM) (TIM-1 系統(tǒng))用于測定枯草芽孢桿菌孢子的萌發(fā)率。簡略地說，將各試驗組的樣品引入TNO研發(fā)的作為胃和小腸的人造模型的TIM-1中。使樣品經6小時通過該系統(tǒng)，每小時收集一次流出物，隨后測定流出樣品的萌發(fā)率。此處所使用的TIM-1模型詳細記載于Havenaar, R.和Minekus, M. , DairyIndustriesInternational 61:17-23，1996 和 Marteau, P.等，J DairySci 80:1031-1037,1996。將均質化標準歐洲歐式早餐(蛋白質含量12% ;脂肪含量32% ;和碳水化合物含量56%)用作膳食組分，同時添加如實施例1所述制備的枯草芽孢桿菌C-3102的孢子(總計 I X IO10CFU)。進行實驗(n=2)。將利用孢子的耐熱性質在65°C下加熱30分鐘的細菌細胞計數(shù)定為“孢子”，未加熱的細菌細胞定為“孢子+萌發(fā)細胞(營養(yǎng)細胞)”。通過下式計算萌發(fā)率來評價未加熱的細菌細胞數(shù)/添加的細菌細胞數(shù)X100(%)-加熱的細菌細胞數(shù)/添加的細菌細胞數(shù)X 100 (%)。細菌細胞數(shù)由平板法測定。對于通過采樣獲得的樣品，將加熱的細菌細胞的百分比與未加熱的細菌細胞進行比較。計算累積的存活率(給定時間點的細菌細胞數(shù)/添加的細菌細胞數(shù)X100%)用于比較在給定時間點所獲得的結果。結果示于表I。表I
權利要求
1.一種用于在大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的試劑，其包括枯草芽孢桿菌的孢子，和在保持所述枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將所述孢子輸送至受試者大腸的手段。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑，其基本上無枯草芽孢桿菌的萌發(fā)細胞。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑，其中所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌C-3102(FERM BP-1096)或其突變株或衍生株。
4.根據(jù)權利要求1至3任一項所述的試劑，其中所述雙歧桿菌為長雙歧桿菌。
5.根據(jù)權利要求1至4任一項所述的試劑，其用于口服給藥和/或腸內給藥。
6.根據(jù)權利要求1至5任一項所述的試劑，其用于飲食品、飼料或藥品。
7.根據(jù)權利要求1至6任一項所述的試劑，其用作整腸劑、抗變態(tài)反應劑或血脂水平改善劑。
8.一種用于生產功能性飲食品的方法，其包括制備根據(jù)權利要求1至7任一項所述的試劑；和將所述試劑引入飲食品中。
9.一種用于在受試者大腸中增加雙歧桿菌和/或抑制雙歧桿菌減少的方法，其包括在保持枯草芽孢桿菌的孢子形態(tài)的同時將有效量的枯草芽孢桿菌孢子輸送至受試者大腸，或直接將所述孢子給藥至受試者大腸。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌C-3102(FERMBP-1096)或其突變株或衍生株。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的方法，其中所述雙歧桿菌為長雙歧桿菌。
全文摘要
公開了一種用于在腸中有效增加雙歧乳桿菌的方法和手段。具體地，公開了一種在腸中控制雙歧乳桿菌增加和/或減少的試劑，所述試劑包含孢子形態(tài)的枯草芽孢桿菌；以及在保持孢子形態(tài)的同時將所述孢子形態(tài)輸送至受試者腸的手段。
文檔編號A23L1/28GK103037877SQ20118002371
公開日2013年4月10日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權日2010年3月12日
發(fā)明者畑中美咲, 中村康則 申請人:可爾必思株式會社